《藥物化學復習》PPT課件.ppt

藥物篩選復習課,選擇藥物作用靶標的考慮因素,1 靶標的有效性，即靶標與疾病確實相關，并且通過調節(jié)靶標的生理活性能有效地改善疾病癥狀。 2 靶標的副作用，如果對靶標的生理活性的調節(jié)不可避免地產生嚴重的副作用，那么將其選作藥物作用靶標是不合適的。,從天然資源中尋找微生物先導藥的一般流程,1.采集各種來源的樣品 2.根據(jù)不同的分離要求進行處理 3.對各類微生物分離純化 4.分離菌株的培養(yǎng)、發(fā)酵 5.應用各種模型對發(fā)酵產品進行高通量篩選 6.對活性物質進行化學分離純化及結構測定 7.活性物質體內外活性評價 8.先導化合物的結構優(yōu)化及深入研發(fā) 9.放大發(fā)酵積累量進行臨床研究,影響微生物合成的主要因素,影響其合成效率的主要因素有：所用微生物的種類、底物、酶、培養(yǎng)基類型、溫度等。 （一）微生物 微生物種類不同，其代謝以及合成的產物的結構類型乃至生物活性多不相同，擴大微生物的來源是尋找新的微生物產物的有效途徑之一 （二）酶及底物 由于生物合成酶的底物專一性較低，在其野生型菌株或阻斷突變株的發(fā)酵過程中添加一些結構類似物可作為前體產生新的微生物產品 （三）其他培養(yǎng)條件 微生物體具有的合成能力在適宜其生長的條件下會增強，也會因改變培養(yǎng)基成分而隨之 變化，當環(huán)境不利時則會抑制其合成。,微生物發(fā)酵法,發(fā)酵是利用未固定的微生物在發(fā)酵罐中生長來獲得所需產品，能夠進行批次性的生產； 發(fā)酵罐通常為含微生物營養(yǎng)基的大槽或大桶。發(fā)酵罐常配有能夠調節(jié)培養(yǎng)基溫度、pH和氧氣含量的調節(jié)器； 典型的培養(yǎng)基含碳源如葡萄糖、水合淀粉或果糖； 蛋白質或氮源如大豆粉、玉米湯或棉籽粉； 維生素源如酵母提取物；礦物質和其他混合性營養(yǎng)物。,初級代謝與次級代謝,一般將微生物通過代謝活動所產生的自身繁殖所必需的物質和能量的過程，稱為初級代謝，該過程所產生的產物即為初級代謝產物，如氨基酸、核苷類，以及酶或輔酶等。 微生物的初級代謝是指微生物從外界吸收各種營養(yǎng)物質，通過分解代謝和合成代謝，生成維持生命活動所需要的 物質和能量的過程。 次級代謝與初級代謝關系密切，次級代謝是指微生物在一定的生長時期，以初級代謝的關鍵性中間產物為前體物質，合成一些對微生物的生命活動無明確功能的物質的過程，這一過程的產物，即為次級代謝產物。 次級代謝產物在微生物生命活動過程中的產生極其微量，對微生物本身的生命活動沒有明顯作用，當次級代謝途徑被阻斷時，菌體生長繁殖仍不會受到影響。,微生物固定法,細胞固定就是將微生物種在一個不溶的細胞性或非細胞性模塊上，模塊可以是合成的聚合物、生物聚合物或微生物體本身。 微生物固定有 種常用的方法，包括在模塊中誘導、模塊上吸附、壓縮入模塊、與模塊以共價鍵結合、細胞間的化學交叉結合以及絮凝，最常用的是誘導。,基因突變的種類,根據(jù)遺傳信息的改變方式，可分為同義突變、錯義突變和無義突變三種。 同義突變：改變后的密碼子和改變前的密碼子是簡并密碼子，它們編碼同一種氨基酸，這種基因突變稱為同義突變 錯義突變：由于一對或幾對堿基對的改變而使決定某一氨基酸的密碼子變?yōu)闆Q定另一種氨基酸的密碼子的基因突變叫錯義突變。這種基因突變有可能使它所編碼的蛋白質部分或完全失活 無義突變：由于一對或幾對堿基對的改變而使決定某一氨基酸的密碼子變成一個終止密碼子的基因突變叫無義突變。其中密碼子改變?yōu)閁AG的無義突變又叫琥珀突變，密碼子改變成UAA的無義突變又叫赭石突變,基因突變的特點,1、基因突變在生物界中是普遍存在的 2、基因突變是隨機發(fā)生的。它可以發(fā)生在生物個體發(fā)育的任何時期和生物體的任何細胞 3、在自然狀態(tài)下，對一種生物來說，基因突變的頻率是很低的 4、大多數(shù)基因突變對生物體是有害的 5、基因突變是不定向的。一個基因可以向不同的方向發(fā)生突變，產生一個以上的等位基因,基因突變與藥物靶標的發(fā)現(xiàn)及應用,在基因水平上尋找藥物靶標過程： 1 尋找疾病相關生物分子線索：利用基因突變技術獲取疾病相關的生物分子信息，并進行生物信息學分析，獲取線索。 2 對相關的生物分子進行功能研究，以確定候選藥物作用靶標。 3 候選藥物作用靶標，設計基因突變的DNA及其多肽在分子、細胞和整體動物水平上進行藥理學研究。 4 驗證靶標的有效性。,Microarray 或 Biochip （生物芯片）是一種微型多參數(shù)生物傳感器。它通過在一微小的基片表面固定大量的分子識別探針，或構建微分析單元和系統(tǒng)，實現(xiàn)對化合物、蛋白質、核酸、細胞或其它生物組分準確、快速、大信息量的篩選或檢測。 A microarray is an ordered array of microscopic elements on a planar substrate that allows the specific binding of genes or gene products.,蛋白質芯片,蛋白質芯片是將各種蛋白質有序地固定在玻片、凝膠、微孔板等各種載體上形成密集蛋白質芯片，用來高通量地測定蛋白質的生物活性，如酶活性、蛋白質一蛋白質問及蛋白質一其它分子，如蛋白質一DNA、蛋白質一配基問的相互作用。,免疫共沉淀(Co-Immunoprecipitation),免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation）是以抗體和抗原之間的專一性作用為基礎的用于研究蛋白質相互作用的經典方法。是確定兩種蛋白質在完整細胞內生理性相互作用的有效方法。 其基本原理是:細胞裂解液中加入抗體，與抗原形成特異免疫復合物，經過洗脫，收集免疫復合物，然后進行SDS-PAGE及Western blotting分析。,特點,優(yōu)點： （1）相互作用的蛋白質都是經翻譯后修飾的，處于天然狀態(tài)； （2）蛋白的相互作用是在自然狀態(tài)下進行的，可以避免人為的影響； （3）可以分離得到天然狀態(tài)的相互作用蛋白復合物。缺點為： 缺點： （1）可能檢測不到低親和力和瞬間的蛋白質蛋白質相互作用； （2）兩種蛋白質的結合可能不是直接結合，而可能有第三者在中間起橋梁作用； （3）必須在實驗前預測目的蛋白是什么，以選擇最后檢測的抗體，所以，若預測不正確，實驗就得不到結果，方法本身具有冒險性。,放射免疫性檢測(RIA，Radioimmunoassay）,放射免疫性檢測(RIA，Radioimmunoassay)的基本原理是 利用標記抗原(Ag* )和非標記抗原(Ag)對特異性抗體(Ab)發(fā)生競爭性結合，用已知不同濃度的標準物和一定量的Ag*及限量的Ab反應，采取一定方法將Ag*-Ab與Ag*分開，即可算出該標準物在各濃度下Ag*-Ab復合物的結合百分率。 然后，加入要篩選的目標物在標準曲線上即可查出樣品中是否含有要篩選的目標物及其濃度。,親和閃爍檢測法Scintillation Proximity Assay, SPA,該技術使用能產生冷光的特制平板或圓球微粒，其底部或外層包被著連接分子，通過化學處理可使抗體、受體蛋白質和酶偶聯(lián)到含閃爍的微球體（熒光微球體或SPA）的表面上，當其和同位素標記的配體特異性結合，近距離釋放射線能量激發(fā)產生冷光，繼而被探測器所監(jiān)測；不能特異性結合的小分子，其標記同位素所發(fā)出的射線能量大部分被水溶液散射，而不足以激發(fā)產生冷光?？墒褂瞄W爍計數(shù)器方便地測定。,Homogeneous Assays One-pot assays with no transfer or wash steps All the reagents are added in one step or in multisteps The signal is read in a plate reader Heterogeneous Assays 多步篩選：multiple additions/incubations/washings/ transfers/filtrations/readings of the signal Labor intensive, complicated step, hard to automate,SPR基本原理,它利用P偏振光在玻璃與金屬薄膜界面處發(fā)生全內反射時滲透到金屬薄膜內的消失波,引發(fā)金屬中的自由電子產生表面等離子體, 當表面等離子體與消失波的頻率相等時,二者將發(fā)生共振,界面處的全反射條件將被破壞, 呈現(xiàn)衰減全反射現(xiàn)象，入射光被金屬表面電子吸收,使反射光能量急劇下降,SPR的優(yōu)點,待測物無需標記 適用于混濁、不透明或者有色溶液 能實時、連續(xù)監(jiān)測反應動態(tài)過程 檢測方便、快捷 應用范圍廣，檢測靈敏度高 始終保持生物分子的活性,SPR缺點,難以區(qū)分非特異性吸附 對溫度、樣品組成等干擾因素敏感 多步結合和多價結合的干擾 空間位阻效應 配體或者分析物的不均一 擴散速度的限制 重結合現(xiàn)象,SPR的應用,對生物分子進行識別及定量檢測 研究生物分子間的相互作用,用SPR可獲得的信息： 兩個分子之間結合的特異性 目標分子的濃度 結合以及解離過程的動力學參數(shù) 結合的強度,報告基因檢測,報告基因檢測（report gene assay） 報告基因 (reporter gene) 是一種編碼可被檢測的蛋白質或酶的基因，也就是說，是一個其表達產物非常容易被鑒定的基因。把它的編碼序列和基因表達調節(jié)序列相融合形成嵌合基因，或與其它目的基因相融合，在調控序列控制下進行表達，從而利用它的表達產物來標定目的基因的表達調控，篩選得到轉化體。,報告基因的特點： (1)已被克隆和全序列已測定； (2)表達產物在受體細胞中不存在，即無背景，在被轉染的細胞中無相似的內源性表達產物； (3)其表達產物能進行定量測定。,報告基因的種類,1、氯霉素乙酰轉移酶 2、半乳糖苷酶 3、人生長激素 4、熒光素酶 5、熒光蛋白,熒光產生的原因,原子熒光光譜的產生 氣態(tài)自由原子吸收光源的特征輻射后，原子的外層電子躍遷到較高能級，然后又躍遷返回基態(tài)或較低能級，同時發(fā)射出與原激發(fā)波長相同或不同的發(fā)射即為原子熒光。原子熒光是光致發(fā)光，也是二次發(fā)光。當激發(fā)光源停止照射之后，再發(fā)射過程立即停止。,時間分辨熒光（HTRF）,一般熒光技術的缺點是熒RF光壽命短，背景熒光高，激發(fā)光和發(fā)射光容易相互干擾 HTRF主要是利用堿土金屬壽命長的特點，可以在激發(fā)和檢測之間延緩一段時間，使具有不同熒光壽命的物質達到分別檢測的目的。同時通過熒光諧振能量傳遞原理，區(qū)分開激發(fā)光和發(fā)射光,熒光偏振（Fluorescence Polarization，F(xiàn)P） 1926年Perrin首次在研究論文中描述他所觀察到的熒光偏振現(xiàn)象。以一束單一波長的偏振光照射溶液中的熒光物質，后者可吸收并釋放出相應的偏振熒光。如果被激發(fā)的熒光物質處于靜止狀態(tài)，該物質仍將保持原有激發(fā)光的偏振性，如果其處于運動狀態(tài)，該物質發(fā)出的偏振光將區(qū)別于原有激發(fā)光的偏振特性，也就是所謂熒光去偏振現(xiàn)象。當熒光染料被單極光激發(fā)釋放熒光，產生水平和垂直方向光束。水平和垂直方向光通量的比值即為偏振值（mP）。mP大小主要由熒光物質分子旋轉速度決定，而旋轉速度與分子大小呈反比。小分子熒光染料與其他分子結合后，分子量增加而旋轉速度降低，則熒光偏振值（Mp）升高；相反，如小分子熒光染料從已結合的分子上解離，則熒光偏振值降低。由于FP 直接檢測水平和垂直方向光通量比值，Mp 值不受絕對熒光強度的影響，具有操作簡單、快速；分析結果穩(wěn)定；成本低、高通量和易于自動化等優(yōu)點。,酶聯(lián)免疫吸附 (Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay , ELISA) 使抗原或抗體與某種酶連接成酶標抗原或抗體，這種酶標抗原或抗體既保留其免疫活性，又保留酶的活性。在測定時，把受檢標本（測定其中的抗體或抗原）和酶標抗原或抗體按不同的步驟與固相載體表面的抗原或抗體起反應。用洗滌的方法使固相載體上形成的抗原抗體復合物與其他物質分開，最后結合在固相載體上的酶量與標本中受檢物質的量成一定的比例。加入酶反應的底物后，底物被酶催化變?yōu)橛猩a物，產物的量與標本中受檢物質的量直接相關，故可根據(jù)顏色反應的深淺進行定性或定量分析。,雙抗體夾心ELISA,1）將特異性抗體與固相載體聯(lián)結，形成固相抗體。洗滌除去未結合的抗體及雜質。 2）加受檢標本，保溫反應。標本中的抗原與固相抗體結合，形成固相抗原抗體復合物。 洗滌除去其他未結合物質。 3）加酶標抗體，保溫反應。固相免疫復合物上的抗原與酶標抗體結合。徹底洗滌未結合的酶標抗體。此時固相載體上帶有的酶量與標本中受檢抗原的量相關。 4）加底物顯色。固相上的酶催化底物成為有色產物。通過比色，測知標本中抗原的量。 在臨床檢驗中，此法適用于檢驗各種蛋白質等大分子抗原。,競爭性ELISA,當抗原材料中的干擾物質不易除去，或不易得到足夠的純化抗原時，可用此法檢測特異性抗體。其原理為標本中的抗體和一定量的酶標抗體競爭與固相抗原結合。標本中抗體量越多，結合在固相上的酶標抗體愈少，從而反映出抗體的量,PCR引物的設計原則總述,引物長度（primer length） 產物長度（product length） 序列Tm值 (melting temperature) G+C含量（composition） 引物二聚體及發(fā)夾結構 （duplex formation and hairpin） 閱讀框,質粒的定義,中文名稱： 質粒 英文名稱： plasmid,質粒是一類存在于細菌和真菌細胞中，能獨立于染色體DNA而自主復制的共價，閉合，環(huán)狀DNA分子，其大小通常在1-100kb范圍內。質粒的復制和轉錄要依賴于宿主細胞編碼的某些酶和蛋白質，如離開宿主細胞則不能存活，而宿主即使沒有它們也可以正常存活。質粒的存在使宿主具有一些額外的特性,具有對受體細胞的可移植性或親和性 具有與特定細胞相適應的復制位點和整合位點 具有多種單一的核酸內切酶識別切割位點 具有合適的選擇性標記,一個理想載體應具備的條件,質粒的改造和構建：指導思想,刪除不必要的DNA區(qū)域，盡量縮小質粒的相對分子質量，以提高外源DNA片段的裝載量。 滅活某些質粒的編碼基因，如促進質粒在細菌種間轉移的mob基因，杜絕質粒擴散污染環(huán)境，保證DNA重組實驗的安全 加入易于識別的選擇標記基因，最好是雙重或多重標記，便于檢測含有重組質粒的受體細胞。 在選擇性標記基因內引入具有多種限制性內切酶識別及切割位點的DNA序列，同時刪除重復的酶切位點。 根據(jù)外源基因克隆的不同要求，分別加裝特殊的基因表達調控元件或用于表達產物親和層析分離的標簽編碼序列。 非結合型，即要求質粒不會從一個細菌轉移到另一個細菌。,腫瘤的發(fā)生不僅是分裂失控導致的細胞過度增生，同時也可能是細胞凋亡通路受阻，使本該死亡的細胞繼續(xù)存在而產生腫瘤，因此，選擇性誘導腫瘤細胞凋亡為目標的技術已成為腫瘤治療的重要策略之一。細胞凋亡是存在于細胞中的自毀機制，細胞凋亡能夠使機體清除衰老和異常的細胞，在維持許多細胞功能方面起到重要作用。 1972年kerr等首先提出“細胞凋亡”這一概念，是由體內外因素觸發(fā)的細胞內置的死亡程序誘導的細胞死亡過程。細胞凋亡是細胞在一定的生理或病理條件下，自己結束其生命的過程，具有嚴格的基因時控性和選擇性。生物體各種細胞的數(shù)量都是通過增殖與死亡之間的平衡來完成的。,細胞周期,細胞周期指由細胞分裂結束到下一次細胞分裂結束所經歷的過程，所需的時間叫細胞周期時間。 G1期(gap1)，指從有絲分裂完成到期DNA復制之前的間隙時間。 S期(synthesis phase)，指DNA復制的時期，只有在這一時期H3-TDR才能摻入新合成的DNA中。 G2期(gap2)，指DNA復制完成到有絲分裂開始之前的一段時間。 M期又稱D期(mitosis or division)，細胞分裂開始到結束。,微管的功能,細胞內，微管以胞質微管和紡錘體微管兩種形式存在，主要參與細胞運動、細胞器的定位、胞內物質的運輸及真核細胞的有絲分裂過程。 細胞進入分裂期，其胞質微管解聚成微管蛋白后再組裝成紡錘體微管。 在分裂后期，紡錘體微管牽引著姊妹染色單體從赤道面移向紡錘體的兩極。 在有絲分裂結束后，紡錘體微管解聚再組裝成胞質微管。,抗結核藥物的篩選,What is 結核病?,結核病是由結核桿菌感染引起的慢性傳染病。結核菌可能侵入人體全身各種器官，但主要侵犯肺臟，稱為肺結核病。 是青年人容易發(fā)生的一種慢性和緩發(fā)的傳染病。一年四季都可以發(fā)病，15歲到35歲的青少年是結核病的高發(fā)峰年齡。潛伏期48周。其中 結核桿菌80發(fā)生在肺部，其他部位(頸淋巴、腦膜、腹膜、腸、皮膚、骨骼)也可繼發(fā)感染。人與人之間呼吸道傳播是本病傳染的主要方式。傳染源是接觸排菌的肺結核患者。,結核桿菌,當前抗結核治療藥物,Screen ing,臨床常用治療藥物,當常規(guī)治療失敗后可使用二線抗結核藥物,臨床常用治療藥物及耐藥靶點,一線抗結核藥物作用靶點的突變使原有藥物的作用蛋白構像發(fā)生了改變,利福平，異煙肼，鏈霉素，乙胺丁醇和吡嗪酰胺 這些藥物不良反應多、殺菌作用不強、療程必須使用個月以上，患者依從性差。,卷曲霉素、乙硫異煙胺、對氨基水楊酸、環(huán)絲氨酸、環(huán)丙沙星、阿米卡星和卡那霉素 不良反應較大，治療時間更長（個月），花費昂貴，治愈率也更低,年我國總耐藥率為，其中初始耐藥率為.，獲得性耐藥率為.,抗結核藥物新靶點,與胞壁合成相關的新靶點,01,與持留態(tài)有關的新靶點,02,與結核桿菌毒性相關的靶點,04,05,06,與核酸相關的靶點,03,與胞壁合成相關的新靶點- 肌醇-1-磷酸合成酶,肌醇存在于分枝桿菌中,與其生長繁殖密切相關。 肌醇是合成細胞壁的必須前體 結核桿菌利用肌醇合成其體內主要的硫醇分枝硫醇。分枝硫醇在維持分枝桿菌的氧化還原平衡、保護細胞免受氧化應激的傷害和半胱氨酸的保存方面起著重要的作用, 對細菌的生長和毒力具有重要意義。 肌醇在細菌體內合成的第一步是葡萄糖-6-磷酸在肌醇-1-磷酸合成酶(ino1 , 酶編號5. 5. 1. 4)的催化下形成肌醇-1-磷酸。肌醇-1-磷酸合成酶基因突變的結核桿菌，在正常的培養(yǎng)基上無法生長。,肌醇-1-磷酸合成酶,故肌醇-1-磷酸合成酶可以作為抗結核藥物的靶位，而由此產生的藥物可能對結核桿菌具有較強的特異性。 肌醇-1-磷酸合成酶也是真核生物中非常重要的多元醇。在設計和篩選結核桿菌肌醇-1-磷酸合成酶抑制劑的時候，應盡量避免抑制劑對真核生物的肌醇-1-磷酸合成酶產生抑制作用，影響人體的正常生理功能，從而產生藥物副作用。,磷酸肌醇合成酶抑制劑 在37攝氏度下，0.5 mM 2-3H肌醇(12,000 cpm/nmol) (用3H標記) 用CHCl3作溶劑，同時加入Tris-HC1 (pH 8.3) 48mM MgCl2, 0.5 mM Ptd-CMP, 0.25%聚乙二醇辛基苯基醚 (Triton X-100), 5 mM 類似物, 和 0.05 mg 的微粒體蛋白，配置成0.1mL的溶液。反應20分鐘后加入0.5 mL 的 0.1 N HCl （含有MeOH)和0.5mL of CHCl3。用0.5mL的水分離。 有機質層的放射性用閃爍探測器來測定。,肌醇抑制劑放入F111細胞 將F111細胞放入培養(yǎng)皿中培養(yǎng)一晚上，培養(yǎng)皿中加入10%經透析的胎牛血清和10微克的肌醇。附著在玻蓋上的細胞用Krebs-Ringer 緩沖液(135 mM NaC1, 4.6 mM KC1,1.2 mM CaCl2,l mM 磷酸鈉, 1.3 mM MgSO4, 5 mM HEPES pH 7.41）沖洗兩次，然后浸在含有10 pM 3H】肌醇 (l000 cpm/pmol) 和5 mM 類似物中，放入含有5%CO2的恒溫箱恒溫在37攝氏度。 120分鐘后將細胞用140mM NaCl沖洗六次，一份溶解在1%SDS中，另一份溶解在10%三氯乙酸中，然后離心分離。 最后細胞溶解液在閃爍探測器中測定放射性，用蛋白濃度測定試劑盒測定蛋白質。,與毒性有關的靶點-泛酸合成酶,泛酸是一種B族維生素(Vit&)，它是輔酶A(CoA)和?；d體蛋白(ACP)的生物合成的關鍵前體，CoA和ACP分子結構中的磷酸泛酰巰基乙胺來源于泛酸；CoA和ACP參與生物體內碳水化合物、脂肪酸、蛋白質和能量代謝，是細胞生長過程中重要的輔因子；阻斷泛酸的合成將抑制結核桿菌的生長。此外，泛酸的生物合成對于結核桿菌的毒性也是至關重要的，敲除泛酸合成酶基因panC和panD所得的泛酸營養(yǎng)缺陷型菌株毒性比卡介苗還低。并且，微生物和植物都必須通過自身生物途徑合成泛酸，而哺乳動物自身不能合成泛酸，必須從食物中獲得。因此，泛酸合成途徑是一個理想的抗結核藥物作用靶點。,結核桿菌泛酸合成途徑中，主要有4個酶參與反應，酮泛解酸羥甲基轉移酶(PanB),泛酸合成酶(PanC) L-天冬氨酸-脫羧酶(PanD)和酮泛解酸還原酶(PanE),四種酶協(xié)同催化下完成的。它們分別由panB、panC、panD和panE編碼。 這其中泛酸合成酶(pantothenatesynthetase，IX3)是關鍵的限速酶，催化泛酸合成的最后一步反應，因此，泛酸合成酶成為抗結核藥物合適靶位。,篩選方法,建立泛酸合成酶活力的測定方法：原理是泛酸合成酶催化反應得到的產物之一為AMP,AMP可反應得到ADP,ADP和磷酸烯醇式丙酮酸鉀作用生成丙酮酸，丙酮酸生成乳酸消耗NADH,還原態(tài)的NADH在340nm有吸光，而氧化態(tài)的沒有。由分光光度計測吸光度的變化，從而測定泛酸合成酶活性。,與核酸相關的靶點DNA回旋酶,DNA回旋酶，又稱促旋酶，旋轉酶。屬拓撲異構酶II(type II ），它的作用是在水解ATP的同時能使松弛態(tài)環(huán)狀DNA轉變?yōu)樨摮菪鼶NA,與細菌體內DNA轉錄復制重組和修復等生理過程密切相關。 DNA拓撲異構酶 （DNA topoisomerase ）為催化DNA拓撲學異構體相互轉變的酶之總稱。催化DNA鏈斷開和結合的偶聯(lián)反應，為了分析體外反應機制，用環(huán)狀DNA為底物。在閉環(huán)狀雙鏈DNA的拓撲學轉變中，要暫時的將DNA的一個鏈或兩個鏈切斷，根據(jù)異構體化的方式而分為二個型。切斷一個鏈而改變拓撲結構的稱為型拓撲異構酶（top- oisomerase），通過切斷二個鏈來進行的稱為型拓撲異構酶（topoisomerase）。,超螺旋是DNA三級結構 DNA在二級結構雙螺旋的基礎上，進一步扭曲、折疊，螺旋形成超螺旋的三級結構。螺旋變緊的稱為正超螺旋，變松的稱為負超螺旋。這是DNA三級結構的一種常見形式。,酶活性測定 在緩沖液中，加入超螺旋PcDNA質粒及回旋酶酶提液和不同濃度的藥物(設空白對照組及加酶不加藥對照組)，混勻后，37溫孵30 min。加入及蛋白酶K。中止反應；繼續(xù)于37溫孵30min后，加入溴酚藍；點樣于08瓊脂糖凝膠板，在70 V電壓下電泳1 h，以溴化乙啶(EB)溶液染色至少30 min，置凝膠成像系統(tǒng)中觀察結果并照像記錄。,以異檸檬酸裂解酶（ICL）為靶點,異檸檬酸裂解酶（isocitrate lyase，ICL）是乙醛酸循環(huán)途徑中的關鍵限速酶之一，研究表明異檸檬酸裂解酶對于持留結合桿菌的存活起關鍵作用，決定了結核桿菌的持留性，最終導致結核病療程過長。敲除了ICL基因的結核分支桿菌不再具有持留性。而人等高等動物中不存在乙醛酸代謝途徑。,篩選模型的建立 以D（s）型異檸檬酸作為底物，利用ICL參與的酶促反應產物（乙醛酸和苯腙反應后的復合物）在324nm處有吸收的特性，測定25酶促反應體系在324nm處吸光度的變化，即可測得異檸檬酸裂解酶的活力。 異檸檬酸裂解酶可催化底物異檸檬酸產生琥珀酸和乙醛酸，產物乙醛酸可與苯肼反應生成苯腙，苯腙在324nm波長下產生光吸收峰，因此測定酶促反應體系在324nm波長下光吸收的變化即可測定異檸檬酸裂解酶的酶活力。,以蛋白激酶G為靶點的篩選,研究表明，結核分枝桿菌（MTB）自身基因組內的pknG基因所編碼的蛋白激酶G（PknG）對持留狀態(tài)的形成起著關鍵性的作用。當MTB被巨噬細胞吞噬，形成吞噬體厚，PknG可以阻止吞噬體與細胞內溶酶體的融合，從而使MTB在細胞內免于被溶酶體的水解酶類降解。,-糖尿病治療的作用靶點,1.定義：糖尿病是一組由于胰島素分泌缺陷及（或）其生物學作用障礙引起的高血糖為特征的某些疾病。慢性高血糖常導致各種臟器，尤其是眼、腎、神經及心血管的長期損害、功能不全和衰竭 2.分類： 1型（B細胞被破壞，常導致胰島素絕對缺乏） 2型（胰島素抵抗或分泌缺陷） 特異型 妊娠,胰島素受體 廣泛分布于全身各組織細胞膜。約有l(wèi)，000300，000個受體，大多數(shù)含有1萬個受體。 胰島素受體是糖蛋白，由2個a和2個B亞基即a2b2構成。 胰島素受體是由位于第19號染色體短臂上的IR基因，a和B亞單位是由單個基因所編碼的，seino等發(fā)現(xiàn)IR基因是120kb，22外顯子。11個外顯子編碼a亞單位，共90多個kb，11外顯子編碼B亞單位，共30多個kb。三個轉錄起始點定位于翻譯起始點的上游276bp，282bp和283bp。 不同組織胰島素受體存在著異質性。,蛋白質激酶在與細胞生長、分化和增值有關鍵作用的信號級聯(lián)中擔當著管理者的角色。這些酶在底物特定的蛋白位點將磷酸基團轉變成ATP。PI3K家族被認為是控制細胞這些進程的長官。一些外部的細胞生長因子，比如表皮生長因子受體，胰島素受體和G蛋白偶聯(lián)受體，信號的傳遞直接通過PI3K。族PI3K根據(jù)其活性機制被分成兩種亞基，A和B。 PIP3連接著許多有用的分子，比如絲氨酸-蘇氨酸激酶、酪氨酸激酶和G蛋白管理者。這些