GB 5413.16-2010發(fā)布稿 嬰幼兒食品和乳品中葉酸(葉酸鹽活 發(fā)布稿.pdf

中華人民共和國國家標準中華人民共和國國家標準 GB 5413.162010 中 華 人 民 共 和 國 衛(wèi) 生 部中 華 人 民 共 和 國 衛(wèi) 生 部 發(fā)布 2010-03-26 發(fā)布 2010-06-01 實施 食品安全國家標準 嬰幼兒食品和乳品中葉酸（葉酸鹽活性） 的測定 National food safety standard Determination of folic acid (folate activity) in foods for infants and young children, milk and milk products GB 5413.162010 I 前 言 本標準代替 GB/T 5413.16-1997嬰幼兒配方食品和乳粉 葉酸（葉酸鹽活性）測定 。 本標準與GB/T 5413.16-1997相比，主要變化如下： 對磷酸鹽緩沖液作了調(diào)整； 增加了米粉的處理方法； 增加了光密度法測定步驟。 本標準所代替標準的歷次版本發(fā)布情況為： GB 5413-1985、GB/T 5413.16-1997。 GB 5413.162010 1 食品安全國家標準 嬰幼兒食品和乳品中葉酸（葉酸鹽活性）的測定 1 范圍 本標準規(guī)定了嬰幼兒食品和乳品中葉酸（葉酸鹽活性）的測定方法。 本標準適用于嬰幼兒食品和乳品中葉酸（葉酸鹽活性）的測定。 2 規(guī)范性引用文件 本標準中引用的文件對于本標準的應用是必不可少的。 凡是注日期的引用文件， 僅所注日期的版本 適用于本標準。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本標準。 3 原理 利用干酪乳桿菌（Lactobacillus casei）ATCC 7469 對葉酸的特異性，在含有葉酸的樣品中生長產(chǎn)生 的酸度和形成的光密度來測定葉酸的含量。 4 試劑和材料 除非另有規(guī)定，本方法所用試劑均為分析純，水為 GB/T 6682 規(guī)定的二級水。 4.1 雞胰腺： 稱取 100 mg 干燥的雞胰腺， 加 20 mL 蒸餾水， 攪拌 15 min， 離心 10 min （3000 轉(zhuǎn)/分鐘） ， 取上清液，臨用前配制。 4.2 0.9 %生理鹽水：稱取 9.0 g 氯化鈉溶解于 1000 mL 水中，分裝于具塞試管中，每管 10 mL，121 滅菌 15 min。每周準備一次。 4.3 磷酸鹽緩沖液 4.3.1 磷酸鹽緩沖液（0.05 mol/L）：稱取 5.85 g 磷酸二氫鉀，1.22 g 磷酸氫二鉀，用 1000 mL 水溶 解。臨用前按 0.5 g/100 mL 加入抗壞血酸。 4.3.2 磷酸鹽緩沖液（用于谷物及谷物制品前處理）：稱取 14.2 g 磷酸氫二鈉，用 1000 mL 水溶解。 臨用前按 1.0 g/100 mL 加入抗壞血酸，用氫氧化鈉溶液 A（4.16）調(diào) pH 至 7.80.1。 4.3.3 磷酸鹽緩沖液 III（用于谷物及谷物制品測試）：稱取 14.2 g 磷酸氫二鈉，用 1000 mL 水溶解。 臨用前按 1.0 g/100 mL 加入抗壞血酸，用氫氧化鈉溶液 A（4.16）調(diào) pH 至 6.80.1。 4.3.4 磷酸鹽緩沖液（0.1 mol/L）（用于谷物及谷物制品標準溶液制備）：溶解 13.61 g 磷酸二氫鉀 于水中稀釋到 1000 mL。用氫氧化鉀溶液（4.10）調(diào) pH 至 7.00.1。 4.4 葉酸標準品。 4.5 氨水（10.8 %）。 4.6 甲苯（C7H8）。 4.7 抗壞血酸（C6H8O6）。 4.8 菌株：干酪乳桿菌（Lactobacillus casei）ATCC 7469。 GB 5413.162010 2 4.9 培養(yǎng)基 4.9.1 乳酸桿菌瓊脂培養(yǎng)基：胨化乳 15 g，酵母浸膏 5 g，葡萄糖 10 g，番茄汁 100 mL，磷酸二氫鉀 2 g， 聚山梨糖單油酸酯 1 g， 瓊脂 10 g， 加蒸餾水至 1000 mL， 調(diào) pH 至 6.8 0.2 （20 25 ） 。 121 高壓滅菌 15min，備用。 4.9.2 乳酸桿菌肉湯培養(yǎng)基：胨化乳 15 g，酵母浸膏 5 g，葡萄糖 10 g，番茄汁 100 mL，磷酸二氫鉀 2 g，聚山梨糖單油酸酯 1 g，加蒸餾水至 1000 mL，調(diào) pH 至 6.8 0.2（20 25 ）。121高壓滅 菌 15min，備用。 4.9.3 葉酸測定用培養(yǎng)基：酪蛋白胨 10 g，葡萄糖 40 g，乙酸鈉 40 g，磷酸氫二鉀 1 g，磷酸二氫鉀 1 g，DL-色氨酸 0.2 g，L-天門冬氨酸 0.6 g，L-半胱氨酸鹽酸鹽 0.5 g，硫酸腺嘌呤 10 mg，鹽酸鳥嘌呤 10 mg，尿嘧啶 10 mg，黃嘌呤 20 mg，聚山梨糖 0.1 g，谷光甘肽 5 mg，硫酸鎂 0.4 g，氯化鈉 20 mg，硫 酸亞鐵 20 mg，硫酸錳 15 mg，核黃素 1 mg，p-氨基苯甲酸 2 mg，維生素 B6 4mg，鹽酸硫胺素 400 g， 泛酸鈣 800 g，煙酸 800 g，生物素 20 g，加蒸餾水至 1000 mL，調(diào) pH 至 6.7 0.1（20 25 ）。 注：市售商業(yè)化合成培養(yǎng)基效果更穩(wěn)定。 4.10 氫氧化鉀溶液（4 mol/L）：稱取 224 g 氫氧化鉀于 1000 mL 燒杯中，用 400 mL 水溶解，冷卻至 室溫后，轉(zhuǎn)移至 1000 mL 容量瓶中，用水定容。 4.11 木瓜蛋白酶溶液：1 g 蛋白酶（活力6000 U/mg，pH 6.0 0.1，40 ）溶于 100 mL 磷酸鹽緩沖 液（4.3.1）中。臨用前配制。 4.12 -淀粉酶溶液：1 g -淀粉酶（1.5 U/mg）溶于 100 mL 磷酸鹽緩沖液（4.3.1）中。臨用前配制。 4.13 0.22 m 滅菌濾膜。 4.14 標準溶液的制備 4.14.1 葉酸標準貯備液（500 g/mL）：稱取 55 mg56 mg（精確至 0.1 mg）葉酸標準品（4.4），用 50 mL 蒸餾水轉(zhuǎn)入 100 mL 容量瓶中，加 2 mL 氨水（4.5）。溶液制備后，按式（1）計算溶液的體積， 要求貯備液中葉酸鹽的濃度為 500 g/mL： 貯備液體積（mL）= 500100 1000 cm 或簡化為： 貯備液體積（mL）= 50 cm (1) 式中： m葉酸標準品的質(zhì)量，單位為毫克（mg） ； c葉酸標準品的純度，單位為克每百克（g/100 g） 。 用水稀釋溶液至刻度，用吸管加水至計算要求的體積，充分混合，放入棕色試劑瓶中 2 4 冰 箱冷藏，保存期為 4 個月。 4.14.2 葉酸標準中間液（50 g/mL）：吸取 10 mL 葉酸標準貯備液（4.14.1）于 100 mL 棕色容量瓶 中，用水定容至刻度，充分混勻，2 4 冰箱冷藏，保存期為 1 個月。 4.14.3 葉酸標準工作液（0.05 ng/mL，0.1 ng/mL）：吸取 1 mL 葉酸標準中間液（4.14.2）于 100 mL 棕色容量瓶中，用水定容至刻度，混合。再吸該液 1 mL 于 100 mL 棕色容量瓶中，定容，混合。 從上 液中分別吸取 5 mL 于 250 mL 和 500 mL 棕色容量瓶中， 用磷酸鹽緩沖液 （4.3.1） 定容到刻度， 混勻， 即為高濃度標準工作液（0.1 ng/mL）和低濃度標準工作液（0.05 ng/mL）。臨用前配制。 4.15 鹽酸（1 mol/L）：量取 83.0 mL 鹽酸溶于水中，冷卻后定容至 1000 mL。 GB 5413.162010 3 4.16 氫氧化鈉溶液 A（4 mol/L）：稱取 160 g 氫氧化鈉于 1000 mL 燒杯中，用 400 mL 水溶解，冷卻 至室溫后，轉(zhuǎn)移至 1000 mL 容量瓶中，用水定容。 4.17 氫氧化鈉溶液 B（0.1 mol/L）：吸取 2.5 mL 氫氧化鈉溶液 A（4.16）轉(zhuǎn)移至 100 mL 容量瓶中用 水定容。 4.18 氫氧化鈉標準滴定溶液（0.1 mol/L 0.0002 mol/L）：稱取 4 g（精確至 0.0001 g）氫氧化鈉用水 稀釋至 1000 mL，用鄰苯二甲酸氫鉀標定。保存此溶液的容器要密封，以防二氧化碳滲入。 4.18.1 氫氧化鈉標準溶液的標定：稱取約 0.18 g（精確至 0.0001 g）于 105 110 烘至恒重的鄰 苯二甲酸氫鉀，用 50 mL 除二氧化碳的水溶于錐形瓶中，加兩滴 5 g/L 的酚酞指示劑，用配好的氫氧化 鈉溶液滴定至粉紅色，同時作空白實驗。按式（2）計算氫氧化鈉標準溶液的濃度： c= 2042. 0)( m 21 VV (2) 式中： c氫氧化鈉的濃度，單位為摩爾每升（mol/L） ； m稱取的鄰苯二甲酸氫鉀的質(zhì)量，單位為克（g） ； V1氫氧化鈉溶液的用量，單位為毫升（mL） ； V2空白試驗氫氧化鈉溶液的用量，單位為毫升（mL） 。 4.18.2 酚酞溶液：取 0.5 g 酚酞溶于 75 mL 體積分數(shù)為 95 %的乙醇中，加入 20 mL 水，再加入氫氧 化鈉溶液（4.18），直至加入一滴立即變成粉紅色，再用水定容至 100 mL。 4.19 溴麝香草酚藍指示劑：稱取 0.1 g 溴麝香草酚藍于研缽中，加入 1.6 mL 氫氧化鈉溶液 B（4.17） 研磨，加少許水至完全溶解，轉(zhuǎn)移至 250 mL 容量瓶中用水定容。 5 儀器和設備 5.1 pH 計：精度為 0.01。 5.2 離心機：轉(zhuǎn)速2000 轉(zhuǎn)/分鐘。 5.3 分光光度儀。 5.4 天平：感量為 0.1 mg。 5.5 生化培養(yǎng)箱：36 1 5.6 滴定管：分刻度值為 0.1 mL。 5.7 渦旋振蕩器。 6 分析步驟 6.1 測試菌液的制備 6.1.1 干酪乳桿菌 （Lactobacillus casei） ATCC 7469 凍干菌粉轉(zhuǎn)入乳酸桿菌肉湯培養(yǎng)基 （4.9.2） 中， 36 1 培養(yǎng) 24 h 后，轉(zhuǎn)接至乳酸桿菌瓊脂培養(yǎng)基（4.9.1）試管中，再 36 1 培養(yǎng) 24 h。培養(yǎng)好的 乳酸桿菌瓊脂培養(yǎng)基（4.9.1）試管的培養(yǎng)物作為貯備菌種。 GB 5413.162010 4 6.1.2 從貯備菌種培養(yǎng)基上分別轉(zhuǎn)接到三個乳酸桿菌瓊脂培養(yǎng)基 （4.9.1） 試管中， 放入培養(yǎng)箱中 36 1 培養(yǎng) 24 h。每月轉(zhuǎn)接一次，作為月接種管貯于冰箱中。每月定期從月接種管中重新接種 3 個轉(zhuǎn)接管保 存新菌株。 6.1.3 從月接種的培養(yǎng)管中的一支再接種一支乳酸桿菌瓊脂培養(yǎng)基 （4.9.1） 試管， 36 1 培養(yǎng) 24 h， 作為日接種管每日測定用。 6.1.4 從日接種管中接種一管乳酸桿菌肉湯培養(yǎng)基（4.9.2），36 1 培養(yǎng) 24 h。在無菌條件下離 心該培養(yǎng)液 10 min （2000 轉(zhuǎn)/分鐘） ， 棄去上清液。 用 10 mL 生理鹽水 （4.2） 振蕩洗滌菌體， 離心 10 min （2000 轉(zhuǎn)/分鐘），棄去上清液，用 10 mL 生理鹽水（4.2）振蕩清洗。如前離心操作，棄去上清液。再 加 10 mL 生理鹽水（4.2），混勻。吸 1 mL 該菌懸液于 10 mL 生理鹽水（4.2）中，混勻制成測試菌液。 6.1.5 以生理鹽水（4.2）做對照，用分光光度計，于 550 nm 波長下，測測試菌液（6.1.4）的光密度 值，此值應在 60 %80 %之間。 6.2 試樣的制備 6.2.1 乳制品 稱取 2 g（精確至 0.0001 g）試樣（約含葉酸 5 g）于 100 mL 燒杯中，用 25 mL30 mL 水復原樣 品，轉(zhuǎn)入 100 mL 容量瓶中，用水定容至刻度，溶液中葉酸的質(zhì)量濃度大約為 0.05 g/mL。吸取 1 mL 該樣液和 1 mL 雞胰腺（4.1）于一個 180 mm15 mm 的帶螺旋蓋的試管中，充分混合。加 18 mL 含抗 壞血酸的磷酸緩沖液（4.3.1） ，再加 1 mL 甲苯（4.6） 。同時制備空白對照管，吸 1 mL 蒸餾水和 1 mL 雞胰腺（4.1）于空白管中，加 18 mL 含抗壞血酸的磷酸緩沖液（4.3.1）及 1 mL 甲苯（4.6） 。在 37 下，樣品管和空白管保溫 16 h 后，于 100 水浴加熱 5 min。用磷酸鹽緩沖液（4.3.1）作適當稀釋， 得到濃度約為 0.1 ng/mL 的葉酸鹽溶液。 若確定樣品中強化葉酸與原生葉酸相比所占比例很大， 則可以用 1 mL 樣液加 19 mL 含抗壞血酸的 磷酸緩沖液（4.3.1）于 100 水浴加熱 5 min，再用磷酸鹽緩沖液（4.3.1）稀釋，得到濃度約為 0.1 ng/mL 的葉酸鹽溶液。 6.2.2 谷物及谷物制品 稱取大約含 1 g 葉酸的試樣于 150 mL 三角燒瓶中。加 20 mL pH 7.8 磷酸緩沖溶液（4.3.2） ，混 勻后加 50 mL 水和 1.0 mL 甲苯（4.6） 。加蓋后 121 15 min 滅菌，然后迅速冷卻。加 1 mL 木瓜蛋白 酶溶液（4.11） ，于 36 1 保溫 3h 后 100 加熱 3 min，冷卻。加 1 mL -淀粉酶溶液（4.12） ，36 1 保溫 2 h 后加 4 mL 雞胰腺 （4.1） ， 加蓋， 36 1保溫 16 h 后 100 加熱 3 min， 冷卻。 用 1 mol/L 鹽酸（4.15）調(diào) pH 至 4.5，用水稀釋定容到 100 mL。過濾得到澄清濾液，然后吸取 1 mL 澄清濾液用磷 酸鹽緩沖液 III（4.3.3）定容至 100 mL，得到濃度約為 0.1 ng/mL 的葉酸鹽溶液。 若確定樣品中強化葉酸與原生葉酸相比所占比例很大則可以直接在樣品中加 20 mL 0.05 mol/L 含 抗壞血酸的磷酸緩沖液（4.3.2）和 50 mL 水，于 121 滅菌 15 min，然后吸取 1mL 澄清濾液，再用 0.05 mol/L 磷酸鹽緩沖液 III（4.3.3）稀釋，得到濃度約為 0.1 ng/mL 的葉酸鹽溶液。 6.3 標準曲線管的制作 按表 1 順序加入蒸餾水、標準工作液（4.14.3） （測定谷物及谷物制品的標準溶液用磷酸鹽緩沖液 （4.3.4）代替磷酸鹽緩沖液（4.3.1） ）和葉酸測定用培養(yǎng)基（4.9.3）于培養(yǎng)管中。表 1 中每一編號需 制作 3 管。試管 S2 至 S10 中，相當葉酸含量為 0.00 ng、0.05 ng、0.10 ng、0.15 ng 、0.20 ng、0.25 ng、 0.30 ng、0.40 ng、0.50 ng。 GB 5413.162010 5 表 1 標準曲線管的制作 試管號 S1 S2 S3 S4 S5 S6 S7 S8 S9 S10 蒸餾水（mL） 5 5 4 3 2 1 0 2 1 0 標準溶液（mL） 0 0 1 2 3 4 5 3 4 5 培養(yǎng)基（mL） 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 注 1：試管 S3S7 中加低濃度標準工作液。 注 2：試管 S8S10 中加高濃度標準工作液。 6.4 試樣管的制作 按表 2 順序加入蒸餾水、試樣和葉酸測定用培養(yǎng)基于試管中，表中每一編號需制作 3 管。 表 2 試樣管的制作 試管號 1 2 3 4 蒸餾水（mL） 4 3 2 1 樣 品（mL） 1 2 3 4 培養(yǎng)基（mL） 5 5 5 5 6.5 滅菌 將標準曲線管和試樣管 121 滅菌 5 min，迅速冷卻到室溫（商品化培養(yǎng)基按標簽說明進行滅菌)。 注：保證加熱和冷卻過程中條件均勻，滅菌管數(shù)過多或距離太近，在滅菌鍋中都可產(chǎn)生不良影響。 6.6 接種 無菌條件下每管中均加入一滴（約 50 L）菌懸液（6.1.4） ，加蓋，充分振蕩混勻所有試管（標準 曲線未接種空白管 S1 除外） 。 6.7 培養(yǎng) 6.7.1 酸度法：36 1 培養(yǎng) 72 h。對每支試管進行目測檢查，未接種管內(nèi)培養(yǎng)液應是澄清的，標 準曲線管和試樣管中培養(yǎng)液的濁度應有梯度。未接種管中若出現(xiàn)混濁，則測定無效。 6.7.2 光密度法：在 36 1 ，培養(yǎng) 16 h24 h。其他同 6.7.1。 6.8 測定 6.8.1 酸度法 6.8.1.1 用 10 mL 水將未接種空白管 S1 和接種空白管 S2 的培養(yǎng)物轉(zhuǎn)至三角燒瓶中， 以溴麝香草酚藍 （4.19）作指示劑，或用 pH 計以 pH 6.8 0.2 為滴定終點用氫氧化鈉標準滴定溶液（4.18）滴定標準曲 線未接種空白管 S 1 和接種空白管 S 2。記錄下消耗的氫氧化鈉標準滴定溶液體積。 注： 如果接種空白滴定反應消耗的氫氧化鈉標準滴定溶液體積數(shù)等于或高于未接種空白水平的 1.5 mL， 則測定結(jié)果 無效。 6.8.1.2 用 10 mL 水將標準曲線管和試樣管中的培養(yǎng)物轉(zhuǎn)至三角燒瓶中，以溴麝香草酚藍（4.19）作 指示劑，或用 pH 計以 pH 6.8 0.2 為滴定終點用氫氧化鈉標準滴定溶液（4.18.1）滴定標準曲線管和試 樣管的培養(yǎng)物。記錄下消耗的氫氧化鈉標準滴定溶液體積。 注：通常標準曲線管 S7 消耗的 0.1 mol/L 的氫氧化鈉標準滴定溶