細胞化學與組織化學.ppt

組織化學技術(shù),序 言,現(xiàn)代組織化學是介于細胞生物學、組織學、生物化學及分子生物學之間的一門新興邊緣學科，它已滲透和應用于生命科學的許多領(lǐng)域。近幾十年來，組織化學發(fā)展突飛猛進，日新月異，已產(chǎn)生了許多分支，各類分支雖有特點，但都源于組織化學。因此，組織化學已成為醫(yī)學生物學科研過程中必備知識之一。,組織化學（histochemistry）/細胞化學(cytochemistry)是運用物理學、化學、免疫學、分子生物學等原理與技術(shù)，對組織與細胞的化學成分、化學反應及其變化規(guī)律進行定性、定位和定量研究的科學。 主要研究對象是生物大分子(如核酸、蛋白質(zhì)、酶、多糖和脂類等)在細胞內(nèi)的結(jié)構(gòu)和功能活動中的分布與變化以及亞細胞組分和細胞器在整個生命活動中的作用等。,一、組織化學發(fā)展簡史,組織化學是在組織學和化學的基礎上發(fā)展起來的，早在十九世紀，人們把顯微鏡與化學技術(shù)結(jié)合起來，開始觀察組織中的化學反應，解釋生物界中的生理現(xiàn)象。,(1890一1920)隨著顯微鏡的改進和組織細胞學染色技術(shù)的發(fā)展，組織細胞化學開始從生理組織學的概念轉(zhuǎn)為顯微化學。 依賴細胞內(nèi)的某些酶催化特異底物的化學反應形成酶細胞化學。 70年代由于細胞顯微分光光度法和熒光顯微光度法的建立，使細胞化學的成分得以定量，形成了定量細胞化學。,80年代電鏡細胞化學可以觀察化學成分的亞細胞定位。 80 90年代，先后流式細胞術(shù)、激光掃描共聚焦顯微技術(shù)出現(xiàn)。,激光掃描共聚焦顯微技術(shù)，相似于對單個細胞進行細胞“CT”分析，并能研究活細胞和定量分析細胞內(nèi)的遺傳物質(zhì)DNA、RNA、細胞器的酶含量，細胞內(nèi)各種熒光標記物(包括分子和離子的濃度及其分布，如Ca2+和pH值等)，,流式細胞術(shù)是一種快速對單細胞化學成分定量分析的新技術(shù)，每秒可測上萬細胞信息，從一個細胞中，可同時測量多種參數(shù)。,二、組織化學技術(shù)的基本要求,1盡可能地保持組織和細胞生前的形態(tài)結(jié)構(gòu)、化學成分和酶的活性。必須選擇適當?shù)墓潭ㄒ汉颓‘數(shù)奶幚矸椒ā?2化學反應要求在細胞或組織內(nèi)進行，須有定位的準確性。為此必須控制反應的時間和條件，使反應的產(chǎn)物不移位，不彌散。,3反應物須有顯色性和定量的可能性，即必須是有色的沉淀或結(jié)晶，沉淀顆粒細小連續(xù)、色深、不溶，并能保留在原位上。顏色深度要與物質(zhì)含量或酶的活性具有一定的比例關(guān)系。 4反應物要有穩(wěn)定性和重復性，以利于觀察研究和驗證。 5反應物有靈敏性和特異性，以利于對比觀察。 6反應產(chǎn)物有對照，否則難以判斷其結(jié)果的可靠性。,三、細胞化學技術(shù)顯示的化學成分：,蛋白質(zhì)：顯示某些特定蛋白、某些氨基酸或功能基； RNA和DNA； 糖類：如糖原、粘多糖和糖脂等； 脂類：如中性脂肪、磷脂和膽固醇等； 酶： 包括水解酶(如磷酸酶、酯酶、肽酶)、氧化酶(琥珀酸脫氫酶、過氧化酶、細胞色素氧化酶)和激酶、轉(zhuǎn)移酶等； 生物胺：5-羥色胺、腎上腺素類、組織胺等； 特異抗原：其化學本質(zhì)可能是多肽、蛋白、糖蛋白等； 無機鹽和微量元素：如鐵、銅、鋅、鈷、鎂等。,四、細胞化學染色的原理：,細胞中的化學成分和其相應的底物呈一系列的化學反應，形成在顯微鏡下可見到的反應產(chǎn)物。常用組織化學方法的原理如下：,一）金屬-金屬鹽沉淀反應原理,利用金、銀、銅、鐵、鋁、鈷等金屬化合物在與細胞化學成份反應過程中生成有色沉淀，借以辨認所檢查的物質(zhì)。 如磷酸酶分解磷酸底物后，可與鉛/鈷形成磷酸鉛，在硫存在時形成 PbS或CoS的棕黑色沉淀，從而標出酶所在部位。,二）偶氮偶聯(lián)法原理,用人工合成的酶底物，在酶的作用下產(chǎn)生分解產(chǎn)物，后者與重氮鹽結(jié)合，引起偶氮偶聯(lián)反應，而形成不溶性的偶氮色素。 萘基磷酸鈉 磷酸氫二鈉萘酚 萘酚FAST BLUE 偶氮染料,堿性磷酸酶水,三）過碘酸Schiff氏劑反應法原理,利用細胞中多糖放出的醛基可將Schiff氏劑中的無色品紅轉(zhuǎn)變?yōu)樽霞t色化合物，可于顯微鏡下觀察到。 這種反應多用于顯示細胞中的糖類和細胞核內(nèi)的DNA，前者稱為PAS反應，后者稱為Feulgen反應。此外，還可用于檢查細跑中的粘蛋白和不飽和脂類。,四）聯(lián)苯胺法原理,過氧化氫酶分解H2O2產(chǎn)生新生氧，后者可將無色聯(lián)苯胺氧化，生成聯(lián)苯胺藍，進而變成棕黑色化合物。此法主要顯示細胞中的過氧化物酶。,五）色素形成法原理,是一組顯示酶定位的常用方法，其原理是在酶的作用下，使無色的化學物質(zhì)在細胞局部形成色素沉著，以此確定待測酶的存在部位。 色素形成法主要包括四唑鹽法（NBT、MTT）、靛藍形成法等。其中四唑鹽法用于定性各種氧化還原酶、多種脫氫酶、轉(zhuǎn)移酶。靛藍反應用于酯酶、磷酸酶等,六）底物標記法原理,底物標記法是指用同位素、色素、金屬標記酶的底物，在酶的作用下，底物分解后沉著于酶所在的部位。 最常用的底物標記法為放射自顯影術(shù)，即70年代后興起的同位素標記技術(shù)，其原理是用同位素標記底物，在酶的作用下，帶有標記的分解產(chǎn)物沉著于酶所在組織結(jié)構(gòu)上，通過放射自顯影過程對沉著于酶所在部位的底物進行捕捉。,七）熒光染色與免疫熒光法原理,熒光染色法是用特定的熒光染料對組織細胞中的化學成分直接染色，在熒光顯微鏡下對這些成分進行直接觀察。 例如吖啶橙可以同時對細胞內(nèi)的DNA和RNA染色，細胞核的DNA呈亮綠色-黃綠色熒光，胞質(zhì)和核仁的RNA呈桔紅色熒光。,組織與細胞材料的制備,一、組織取材注意事項,1.注意防止人為因素的影響 刀和剪要快，刀要足夠長。 2.組織塊的大小 大小可根據(jù)需要而定，一般長1cm寬1cm厚0.20.3cm。 3.動物和人體組織的取材位置 要視研究目的，觀察部位而定。取材時應考慮：主要病灶，病灶與正常組織交界處，遠離病灶的正常組織。,4.取材時間 原則上，應盡快取材，但較大的手術(shù)標本如胃、肺、腸等器官，最好先固定后取材。組織要求離體后30min內(nèi)浸入固定液，尤其是開展分子生物學工作。動物組織取材要求心臟還在跳動時取材，腦組織和神經(jīng)組織應采用灌注預固定后，再進行后固定。 5.注意包埋方向，包埋時要平整。 6.保持材料的清潔 7.切除不需要的部分，骨組織需脫鈣 8.明確編號，登記,培養(yǎng)的活細胞可分貼壁和懸浮二種。貼壁細胞處理方法有： （1）細胞大量培養(yǎng)后，經(jīng)消化將細胞制成懸液（106）涂在包被有切片粘合劑的載玻片上，涼干后固定。 （2）將細胞直接培養(yǎng)在蓋玻片上。 （3）將細胞直接培養(yǎng)在6孔或9孔板上，固定后備用。 胸水、腹水、尿液、腦脊液等體液多而細胞較少的標本，可用離心沉淀法收集細胞。,二、細胞材料的準備,三、組織標本的固定,1.目的 (1)防止組織細胞的死后變化，防止自溶和腐敗，以保持組織細胞的固有形態(tài) (2)使細胞內(nèi)的蛋白質(zhì)、脂肪、糖和酶等各種抗原成份轉(zhuǎn)變成不溶性物質(zhì)，以保持它原有的結(jié)構(gòu)與生活時相仿,（3）防止細胞過度收縮或膨脹而失去其原有形態(tài)結(jié)構(gòu)，固定劑兼有硬化作用 （4）經(jīng)過固定的組織能對染料產(chǎn)生不同的親和力而著色清晰，便于辨認。,2.固定液的種類,固定液分為單純固定液和混合固定液兩種。 （1）甲醛固定液： 是一種還原劑，呈酸性，原液濃度為37%40%，配成固定液的濃度為4%甲醛。配制時取甲醛原液10ml，加雙蒸水或緩沖液至100ml，為甲醛固定液（習慣上稱為10福爾馬林） 。 甲醛滲透力強，固定均勻。但脫水后有較大收縮，在某些方法中要求中性甲醛，可在原裝瓶內(nèi)放入碳酸鎂，pH為7.6，可長期保持中性。甲醛固定后，通常需用流水沖洗12 24小時,否則影響染色效果。,(2) 4多聚甲醛固定液 (3) Bouins液 苦味酸飽和水溶液 75ml 甲醛 25ml 冰醋酸 5ml 滲透速度快，收縮小，組織固定均勻，保持結(jié)構(gòu)完整，適合于各種胚胎連續(xù)切片，對于肝、皮、胰腺特殊染色效果好。固定為1224小時，但固定過久，對堿性染料著色不利。,（4）Carnoy氏液 純酒精 60ml 氯仿 30ml 冰醋酸 10ml 此固定液滲透速度快，2mm以下小塊組織固定時間24小時，它是細胞核極好的固定液，適合于細胞分裂、RNA、DNA及糖元等固定。固定后直接入純酒精脫水。,(4) PLP固定液：過碘酸-賴氨酸-多聚甲醛固定液。該固定劑較適合于富含糖類組織，對超微結(jié)構(gòu)及許多抗原的抗原性保存較好。 (5) Methacarn固定液：甲醇60ml，氯仿30ml，醋酸10ml，混均后4保存?zhèn)溆?，對核?nèi)抗原的保存效果較好。 (6) 丙酮及醇