多聚甲醛配制

4多聚甲醛配制4多聚甲醛配制方法1) 900 ml dd H20 + 500 ul 1N NaOH2) Heat to 65-703) While stirring, add 40 g paraformaldehyde4) Continue heating and stirring until paraformaldehyde is dissolved5) Let cool to room temperature6) Add 100 ml of 10X PBS7) pH to 7.3 with HCl8) Sterile with filter9) Store at 4, protected from light稱量2g，放置與50ml pbs中，37度孵箱2天后，4%的多聚甲醛就配好了。配制0.1M的PBS，PH=7.2-7.4,100mlPBS+4g多聚甲醛，放入65水浴，一般半天左右就可以溶好因為需要現(xiàn)用現(xiàn)配所以我一般就配10毫升。用一個帶蓋的玻璃離心管加0.4克多聚甲醛，加8毫升PBS，加1毫升2N的NAOH，放到60度的水浴里，10分鐘，拿出來用手顛倒幾次，基本上就都溶了，再用HCL調(diào)ph到7.2，最后定容就行了，我最快10分鐘搞定。取4g 多聚甲醛溶到100 PBS緩沖液，加2滴1N的NaOH（pH7.4）,60度水浴磁力攪拌，大約1-2小時可以溶解。4%多聚甲醛的配制:在放置磁力攪拌棒的容器中,將4克多聚甲醛(EM級)溶解于100ml PBS,加入數(shù)滴NaOH,在通風廚中60加熱(打開瓶蓋)使溶解,冷卻至室溫,調(diào)整PH值為7.4,使用前新鮮配制.常用的固定劑種類很多,固定劑的正確選擇取決于被研究抗原的性質(zhì)及所用抗體的特性.固定劑可分為兩類:有機溶劑和交聯(lián)劑.有機溶劑如乙醇和丙酮能夠去處脂類物質(zhì)使細胞脫水,把蛋白質(zhì)沉淀在細胞結(jié)構(gòu)上.交聯(lián)劑如多聚甲醛一般通過自由氨基基團把生物分子橋連起來,形成一個相互交聯(lián)的抗原網(wǎng).許多人發(fā)現(xiàn)用交聯(lián)劑固定細胞效果較好,尤其是做免疫熒光的時候,當然沒有固定的規(guī)則可言.不過,單獨用多聚甲醛固定的細胞不能使抗體進入細胞內(nèi),因此,標本固定后必須用非離子去污劑(triton-x 100)透化標本.4多聚甲醛（PFA）配制稱取40gPFA溶于裝有500mlDEPC水的玻璃容器（燒杯或燒瓶）中，持續(xù)加熱磁力攪拌至6065,使成乳白色懸液。用1.0mmol/L 的NaOH調(diào)PH至7.0使呈清亮狀（滴加），再加入約500ml 2PBS，充分混勻（在冰浴或冷水浴中）。可再檢測一下PH，過濾后定容至1000ml，室溫或4（保存?zhèn)溆茫?。注意?.配制時應(yīng)在通風條件下操作，并避免接觸皮膚及吸入（戴口罩及手套），因PFA有較強的毒性，對粘膜及皮膚有刺激作用。2.加熱時，溫度不可過高，常為6065。否則PFA降解失效，配制好的PFA雖可有效一點時間，但過久的液體，固定效果下降，應(yīng)用前新鮮配制。4%多聚甲醛固定液配制多聚甲醛(PFA) 40g ,雙蒸水500ml在60-65度加熱成乳白色懸液（用1.0mol/LNaOH調(diào)制7.0或7.2-7.4 ）用0.1molPBS定容至1000ml。除了用DEPC水配制PFA外，也可以用滅菌蒸餾水或經(jīng)DEPC處理的0.010.1/L的PBS配制，方法及主要事項同上。制備的單細胞懸液用70%乙醇固定，4過夜。次日生理鹽水洗脫液洗滌去除固定液。加PI染液混勻，至4避光30min，上機測試。正常對照細胞呈紅色熒光，凋亡細胞呈藍色熒光，在流式細胞儀DNA直方圖上，由于凋亡細胞的出現(xiàn)，二倍