生物制藥學(xué)

動(dòng)物細(xì)胞制藥生產(chǎn)用動(dòng)物細(xì)胞的要求和獲得 ； 動(dòng)物細(xì)胞的大規(guī)模生產(chǎn)流程； 動(dòng)物細(xì)胞的生產(chǎn)特征 （動(dòng)物細(xì)胞的培養(yǎng)條件和培養(yǎng)基）； 動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)（培養(yǎng)方法和操作技術(shù)） ；內(nèi)容：細(xì)胞是一切動(dòng)、植物體的基本結(jié)構(gòu)單位細(xì)胞培養(yǎng)的概念p 組織培養(yǎng)或細(xì)胞培養(yǎng)：將組織或細(xì)胞從機(jī)體取出。在體外模擬機(jī)體體內(nèi)的生理?xiàng)l件下進(jìn)行培養(yǎng)，使之生存和生長(zhǎng)；（課本）p 動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)：體外培養(yǎng)，即在無菌條件下，從機(jī)體中取出組織或細(xì)胞，或利用已經(jīng)建立的動(dòng)物細(xì)胞系，模擬機(jī)體正常生理狀態(tài)下生存的基本條件，讓細(xì)胞在培養(yǎng)容器中生存、生長(zhǎng)和繁殖的方法。p 組織培養(yǎng)：動(dòng)物組織在體外條件下的保存或生長(zhǎng)，此時(shí)可能有組織分化，并保持組織的結(jié)構(gòu)和功能。細(xì)胞工程的概念p 細(xì)胞工程是以細(xì)胞為單位，按人們的意志，應(yīng)用細(xì)胞生物學(xué)、分子生物學(xué)等理論和技術(shù)，有目的地進(jìn)行精心設(shè)計(jì)，精心操作。使細(xì)胞的某些遺傳特性發(fā)生改變，從而達(dá)到改良或產(chǎn)生新品種的目的，以及使細(xì)胞增加或重新獲得產(chǎn)生某種特定產(chǎn)物的能力，從而在離體條件下進(jìn)行大量培養(yǎng)、增殖，并提取出對(duì)人類有用的產(chǎn)品。微生物動(dòng)物細(xì)胞植物細(xì)胞大小um1101010010100懸浮生長(zhǎng)可以大多數(shù)不可以可以，但易成團(tuán)，無單個(gè)細(xì)胞營養(yǎng)要求簡(jiǎn)單非常復(fù)雜較復(fù)雜生長(zhǎng)速率快，0.5-5h慢15-100h慢24-74h代謝調(diào)節(jié)內(nèi)部?jī)?nèi)部，激素內(nèi)部，激素環(huán)境敏感不敏感特敏感較敏感細(xì)胞分化無有有剪切力敏感低非常高高細(xì)胞或產(chǎn)物濃度較高低低動(dòng)物細(xì)胞的結(jié)構(gòu)較原核細(xì)胞復(fù)雜得多，各種細(xì)胞都有明確的分工；細(xì)胞生長(zhǎng)和基質(zhì)依賴性p 生長(zhǎng)基質(zhì)（growth substratum）： 概念： 改變生長(zhǎng)表面特性，促進(jìn)細(xì)胞貼附的物質(zhì)； 胞外基質(zhì)成分：多聚賴氨酸、膠原。p 接觸抑制（ contact inhibition）： 細(xì)胞在生長(zhǎng)基質(zhì)上分裂增殖，逐漸匯成片，當(dāng)每個(gè)細(xì)胞與其周圍的細(xì)胞互相接觸時(shí)，細(xì)胞就停止增殖 特點(diǎn)：保持充足的營養(yǎng)，細(xì)胞仍可存活一段時(shí)間，但細(xì)胞密度不再增加； 大多數(shù)細(xì)胞有； 少數(shù)懸浮培養(yǎng)細(xì)胞無。按基質(zhì)依賴性細(xì)胞的分類p 貼壁依賴性細(xì)胞（anchoraged-dependent cell）；p 非貼壁依賴性細(xì)胞（anchoraged-independent cell）或懸浮細(xì)胞；p 兼性貼壁依賴性細(xì)胞。貼壁依賴性細(xì)胞（anchoraged-dependent cell）p 概念：需要有適量帶電荷的固體或半固體支持表面才能生長(zhǎng)的細(xì)胞；p 細(xì)胞依靠自身分泌的或培養(yǎng)基中提供的貼附因子才能在該表面上生長(zhǎng)、增殖；p 當(dāng)細(xì)胞在該表面生長(zhǎng)后，一般形成兩種形態(tài)，即成纖維樣細(xì)胞型或上皮樣細(xì)胞型；兼性貼壁依賴性細(xì)胞: 理想的藥物生產(chǎn)細(xì)胞系動(dòng)物細(xì)胞的生理特點(diǎn)p 分裂周期長(zhǎng)（一般1248h，不同種屬，不同部位可能時(shí)間不同）；p 生長(zhǎng)一般需貼附于基質(zhì)，并有接觸抑制現(xiàn)象；p 正常二倍體細(xì)胞的生長(zhǎng)壽命是有限的（30代，50代，與細(xì)胞種族和年齡有關(guān)）；p 動(dòng)物細(xì)胞對(duì)周圍環(huán)境十分敏感；p 動(dòng)物細(xì)胞對(duì)培養(yǎng)基的要求高；p 蛋白質(zhì)的合成途徑和修飾功能與細(xì)菌不同。動(dòng)物細(xì)胞蛋白質(zhì)合成場(chǎng)所p 游離核糖體：合成的蛋白質(zhì)用于細(xì)胞質(zhì)基質(zhì)內(nèi)；p 粗糙內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上的核糖體：合成的蛋白質(zhì)是分泌性的和膜中整合的蛋白質(zhì)，它們多數(shù)為糖蛋白。這些寡糖鏈，有的在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中加接（N鏈寡糖），有的在高爾基體內(nèi)加接（O鏈寡糖）；p 蛋白質(zhì)的糖基化作用：與細(xì)胞的許多生理功能密切相關(guān)，如細(xì)胞識(shí)別、表面受體、胞內(nèi)消化和外排分泌物等；由生理特點(diǎn)得出的結(jié)論p 作為宿主，生產(chǎn)藥品的不足： 條件； 成本； 產(chǎn)量。p 優(yōu)點(diǎn)： 胞外產(chǎn)物； 翻譯后修飾； 糖基化。轉(zhuǎn)化細(xì)胞系p 概念：染色體的斷裂變成異倍體，失去了正常細(xì)胞的特點(diǎn)，而獲得了無限增殖的能力；哺乳動(dòng)物細(xì)胞系p CHO細(xì)胞：（Chinese hamster ovary，CHO）中國倉鼠卵巢；p BHK21：幼倉鼠的腎臟（baby hamster kidney, BHK）；p Vero細(xì)胞CHO細(xì)胞p 最為普遍和成熟表達(dá)糖基化蛋白藥物的細(xì)胞；p 目前廣泛用于構(gòu)建工程細(xì)胞的是一株缺乏二氫葉酸還原酶的營養(yǎng)缺陷突變株CHOdhfr-;BHK21成纖維樣細(xì)胞，用于增殖病毒、制備疫苗（口蹄疫、狂犬病疫苗）和重組蛋白Vero細(xì)胞p 可支持多種病毒的增殖并制成疫苗： 如脊髓灰質(zhì)炎疫苗； 狂犬病疫苗； 乙腦。昆蟲細(xì)胞系生產(chǎn)抗體、試劑盒，生物學(xué)研究。細(xì)胞庫的建立p 兩個(gè)細(xì)胞庫：原始細(xì)胞庫（master cell bank,MCB）和生產(chǎn)用細(xì)胞庫（manufactures working cell bank,MWCB）或稱工作細(xì)胞庫（working cell bank，WCB）。細(xì)胞系的保存p 短期保存： p 長(zhǎng)期保存：p 防受傷的措施：p 冷凍、解凍方法。作業(yè)p 用基因工程方法生產(chǎn)重組藥物時(shí)，為什么一些生物藥物不能用原核細(xì)胞表達(dá)？p 最常用的兩種藥物生產(chǎn)哺乳動(dòng)物源細(xì)胞系是什么，有什么特點(diǎn)？哺乳動(dòng)物細(xì)胞最佳培養(yǎng)溫度為（370.5）；耐受溫度范圍較窄，3537死亡：43以上低溫抑制生長(zhǎng)pH值：細(xì)胞的最適pH7.27.4人體：血液pH比較恒定，7.367.44p 氧氣：高氧環(huán)境：O2濃度60%以上，對(duì)細(xì)胞毒性較大，抑制生長(zhǎng)和增殖，出現(xiàn)染色體異常等現(xiàn)象；（一）動(dòng)物細(xì)胞對(duì)培養(yǎng)基的要求高p 完全異養(yǎng)，容易利用相對(duì)低分子量的營養(yǎng)物；p 12種必需氨基酸；p 8種以上維生素；p 多種附加成分：生長(zhǎng)類、細(xì)胞因子和貼壁因子及激素、結(jié)合蛋白質(zhì)等；能源和碳源物質(zhì)糖類p 主要：葡萄糖（常需要補(bǔ)丙酮酸鈉）和谷氨酰胺；p 不能利用：多糖、雙糖、寡糖等聚合物氮源氨基酸p 不能利用：多肽、蛋白質(zhì)等高分子聚合物；p 12種AA必須添加：Arg、Cys、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Thr、Trp、Tyr、Val；（Tip，Hall，MTV，CT）p 細(xì)胞只能利用？型AA；p 谷氨酰胺:重要碳源和能源維生素：代謝和生長(zhǎng)起調(diào)節(jié)和控制作用無機(jī)鹽類：一般為生理鹽水的離子濃度（0.9%）。生長(zhǎng)類因子與激素p 激素：胰島素是最常用的激素，p 貼附因子：膠原等；p 脂類化合物：細(xì)胞生長(zhǎng)必需的，類脂及其前體和血清常平行使用。特別是缺陷性細(xì)胞，對(duì)某種脂類有很高的依賴性。合成培養(yǎng)基：缺點(diǎn)：不能直接使用；需要添加5-20血清，才能培養(yǎng)無血清培養(yǎng)基p 概念：全部用已知成分組配、不加血清的合成培養(yǎng)基；p 組成：合成培養(yǎng)基基礎(chǔ)之上，添加激素與生長(zhǎng)因子、結(jié)合蛋白、貼壁與伸展因子、低分子量營養(yǎng)因子；p 當(dāng)前市場(chǎng)上可獲得的適于各種細(xì)胞的無血清培養(yǎng)基見P99表38貼壁懸浮培養(yǎng)（假懸浮培養(yǎng)）微載體培養(yǎng)p 概念：細(xì)胞貼附于微載體上伸展和增殖，再懸浮于培養(yǎng)液中的培養(yǎng)過程；p 兼具貼壁和懸浮培養(yǎng)的雙重優(yōu)點(diǎn)動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)的操作方式：灌流式（perfusion）操作 灌流式操作 p 細(xì)胞和培養(yǎng)基一起加入反應(yīng)器，反應(yīng)過程中不斷地將部分條件培養(yǎng)基取出，同時(shí)不斷地補(bǔ)充新鮮培養(yǎng)基。p 灌流式操作在某些生物反應(yīng)器中是唯一可行的操作方式， 紅細(xì)胞生成素（erythropoietin，EPO）：對(duì)紅細(xì)胞生成起特異性刺激作用的細(xì)胞因子。紅細(xì)胞生成素是一種糖蛋白，在胎兒體內(nèi)由腎臟及肝臟產(chǎn)生，而在成人體內(nèi)主要由腎臟產(chǎn)生。腎功能受到損害，紅細(xì)胞生成素的產(chǎn)生受阻，可導(dǎo)致貧血；EPO的理化性質(zhì)：糖鏈占分子量的39%；糖基化程度與準(zhǔn)確性對(duì)活性影響很大；rhEPO的表達(dá)研究：在哺乳動(dòng)物細(xì)胞CHO、BHK細(xì)胞系統(tǒng)中表達(dá)，與天然紅細(xì)胞生成素相似。工業(yè)生產(chǎn)中大規(guī)模生產(chǎn)使用。構(gòu)建表達(dá)紅細(xì)胞生成素的細(xì)胞株：然后篩選陽性克隆用胰酶消化抗性克隆培養(yǎng)出的細(xì)胞；抗體制藥抗體是高等脊椎生物的免疫系統(tǒng)受到抗原刺激后，由成熟的B淋巴細(xì)胞產(chǎn)生的能夠與該抗原發(fā)生特異結(jié)合的糖蛋白分子，它是機(jī)體免疫系統(tǒng)中最重要的效應(yīng)分子，具有結(jié)合抗原、結(jié)合補(bǔ)體、中和毒素、介導(dǎo)細(xì)胞毒、促進(jìn)吞噬等功能，從而發(fā)揮抗感染、抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)與監(jiān)視等作用，因此，抗體又稱為免疫球蛋白。單克隆抗體階段p 多克隆抗體的不均一性，p 第二代抗體或細(xì)胞工程抗體：p 單克隆抗體與多克隆抗體最主要的區(qū)別是單克隆抗體為單一種B細(xì)胞所產(chǎn)生的一種均一的免疫球蛋白分子；基因工程抗體：將抗體的基因按不同需要進(jìn)行改造和重組，然后導(dǎo)入適當(dāng)?shù)氖荏w細(xì)胞中進(jìn)行表達(dá)；單克隆抗體的生產(chǎn)流程： 抗原與動(dòng)物免疫； 細(xì)胞融合與雜交瘤細(xì)胞的選擇性培養(yǎng)； 篩選陽性克隆與克隆化； 雜交瘤細(xì)胞與抗體性狀的鑒定 ； 單克隆抗體的大量制備； 單克隆抗體的純化p 第三代抗體：以1994年Winter以基因工程方法制備抗體為代表；p 單克隆抗體的缺陷：?jiǎn)慰寺】贵w多是由鼠B細(xì)胞與鼠骨髓瘤細(xì)胞經(jīng)細(xì)胞融合形成的雜交瘤細(xì)胞分泌的，具有鼠源性，進(jìn)入人體后會(huì)引起人抗抗體反應(yīng)（HAMA反應(yīng)）。參與體內(nèi)免疫反應(yīng)的來自骨髓的兩類細(xì)胞： B淋巴細(xì)胞，有合成一種抗體的遺傳基因； T淋巴細(xì)胞，幫助淋巴細(xì)胞產(chǎn)生抗體。有上百萬種不同的B淋巴細(xì)胞系，含遺傳基因不同的B淋巴細(xì)胞合成不同的抗體；當(dāng)機(jī)體受抗原刺激時(shí)，抗原分子上的許多決定簇分別激活各個(gè)具有不同基因的B細(xì)胞，被激活的B細(xì)胞分裂增殖，并合成多種抗體。單克隆抗體：是將抗體產(chǎn)生細(xì)胞與具有無限增殖能力的骨髓瘤細(xì)胞相融合，通過有限稀釋法及克隆化使雜交瘤細(xì)胞成為純一的單克隆細(xì)胞系而產(chǎn)生的；由于這種抗體是針對(duì)一個(gè)抗原決定簇的抗體，又是單一的B淋巴細(xì)胞產(chǎn)生的，故稱為單克隆抗體。因免疫動(dòng)物品系和骨髓瘤細(xì)胞在種系發(fā)生上距離越遠(yuǎn)，產(chǎn)生的雜交瘤越不穩(wěn)定、故一般采用與骨髓瘤供體同一品系的動(dòng)物進(jìn)行免疫此圖用的是間接法測(cè)抗體，原理是用酶標(biāo)記的抗體以檢測(cè)已于固相結(jié)合的受檢抗體，故稱為間接法。克隆化：是指單個(gè)細(xì)胞通過無性繁殖而獲得細(xì)胞集團(tuán)的整個(gè)培養(yǎng)過程，這種細(xì)胞集團(tuán)的每個(gè)細(xì)胞的生物學(xué)特性和功能完全相同一般經(jīng)過大約3次的克隆化，才能達(dá)到100孔內(nèi)均為抗體陽性細(xì)胞克?。欢嗫寺】贵w階段p 第一代抗體：以1890年Behring發(fā)現(xiàn)白喉抗毒素為代表；p 特點(diǎn)：用抗原免疫動(dòng)物獲得多克隆抗體；p 多克隆抗體：將某種天然抗原經(jīng)各種途徑免疫動(dòng)物，成熟的B細(xì)胞克隆受到抗原刺激后，便產(chǎn)生抗體并將之分泌到血清和體液中，這種抗體實(shí)際是一種混合物，因此又稱多克隆抗體；p 病原微生物含有多種抗原決定簇的抗原物質(zhì)，因此這些抗體制劑也是多種抗體的混合物。酶工程酶工程：以應(yīng)用的目的出發(fā)研究酶、應(yīng)用酶的特異性催化功能并通過工程化將相應(yīng)原料轉(zhuǎn)化成有用物質(zhì)的技術(shù)固定化酶：是指限定或固定于特定空間位置的酶，具體來說，是指經(jīng)物理或化學(xué)方法處理，使酶變成不易隨水流失，而又能發(fā)揮催化作用的酶制劑。固定化酶：優(yōu)點(diǎn)： 較長(zhǎng)時(shí)間、多次使用，多數(shù)穩(wěn)定性提高； 反應(yīng)結(jié)束后易分離，產(chǎn)物易純化，產(chǎn)品質(zhì)量高； 反應(yīng)條件易于控制； 酶利用效率高； 更適于多酶反應(yīng)。p 缺點(diǎn)： 固定時(shí)，活力有損失； 成本； 只適于可溶性底物，較適于小分子底物。p 載體結(jié)合法：將酶結(jié)合到不溶性載體上，根據(jù)結(jié)合形式的不同，分為以下三類： 物理吸附法：用物理方法將酶吸附于不溶性載體上； 離子結(jié)合法：酶通過離子鍵結(jié)合于具有離子交換基的水不溶性載體上； 共價(jià)結(jié)合法：酶以共價(jià)鍵結(jié)合于載體上，酶分子上非活性部位功能團(tuán)與載體表面活潑基團(tuán)間發(fā)生化學(xué)反應(yīng)形成共價(jià)鍵。由于載體上的功能基團(tuán)與酶分子上的側(cè)鏈基團(tuán)間不具有直接反應(yīng)的能力，因此在偶聯(lián)反應(yīng)前，需先進(jìn)行載體活化，在載體上引進(jìn)某種活潑基團(tuán)，然后此活潑基團(tuán)再與酶分子上某一基團(tuán)反應(yīng)形成共價(jià)結(jié)合。重氮法：這是帶芳香氨基載體的主要反應(yīng)疊氮法：適用于含羥基、羧甲基等的載體。交聯(lián)法(crosslinking定義：利用雙功能試劑或多功能試劑(bifunctional or multi-functional)在酶分子間，酶分子與惰性蛋白間，或酶分子與載體間進(jìn)行交聯(lián)反應(yīng)，以共價(jià)鍵制備固定化酶的方法；微囊化法制備固定化酶的方法p 界面沉淀法；p 界面聚合法；p 脂質(zhì)體包埋方法；p 纖維包埋法。固定化酶在醫(yī)療治療上的應(yīng)用：作為“人工臟器”用于除去有害的毒性物質(zhì)及有潛在毒害作用的代謝尾產(chǎn)物：如清除尿毒癥病人體內(nèi)積累的尿素；同種酶，采用不同的方法或不同載體固定化后，其最適溫度可能不同。氨基?；福菏澜缟系谝环N工業(yè)化生產(chǎn)的固定化酶葡萄糖異構(gòu)酶：世界上生產(chǎn)規(guī)模最大的一種固定化酶。將培養(yǎng)好的含葡萄糖異構(gòu)酶的放線菌細(xì)胞用6065熱處理15min，該酶就固定在菌體上，制成固定化酶，用于連續(xù)生產(chǎn)果葡糖漿。此外，也可用吸附法、結(jié)合法、凝膠包埋法、交聯(lián)法或雙重固定化法等進(jìn)行固定化。(3) 天門冬氨酸酶：利用固定化細(xì)胞或固定化酶將延胡索酸轉(zhuǎn)化生產(chǎn)天門冬氨酸。 青霉素酰化酶： 這是在醫(yī)藥工業(yè)上廣泛應(yīng)用的一種固定化酶。用于制造各種半合成青霉素和頭孢霉素。用于酶進(jìn)行催化反應(yīng)的容器及其附屬設(shè)備稱為酶反應(yīng)器酶反應(yīng)器是用于完成酶促反應(yīng)的核心裝置。它為酶催化反應(yīng)提供合適的場(chǎng)所和最佳的反應(yīng)條件，酶工程在藥物生產(chǎn)方面的應(yīng)用：體外循環(huán)裝置：人工腎臟1992年，美國FDA明確要求對(duì)于具有手性特性的化學(xué)藥物，都必需說明其兩個(gè)對(duì)映體在體內(nèi)的不同生理活性、藥理作用以及藥物代謝動(dòng)力學(xué)情況。pH的控制：可以從以2大方面進(jìn)行控制：1 培養(yǎng)基：（1）調(diào)節(jié)好基礎(chǔ)料的pH：滅菌后（消后）pH值往往降低；（2）在基礎(chǔ)料中加入維持pH的物質(zhì)2 補(bǔ)料調(diào)節(jié)pH值：（1）補(bǔ)料； 通過補(bǔ)料調(diào)節(jié)pH （2）加酸堿。當(dāng)補(bǔ)料與調(diào)pH發(fā)生矛盾時(shí)，加酸堿調(diào)pH 需氧：生理特性，反映在攝氧率上，如營養(yǎng)物質(zhì)濃度和菌種特性。基因工程制藥基因工程干擾素的生產(chǎn) 基因工程大腸桿菌發(fā)酵生產(chǎn)工藝； 基因工程假單胞桿菌發(fā)酵生產(chǎn)工藝。p 基因工程假單胞桿菌發(fā)酵生產(chǎn)干擾素干擾素概念p 概念： （interferon，IFN）：機(jī)體受到病毒感染時(shí)，免疫細(xì)胞產(chǎn)生的一組結(jié)構(gòu)類似、功能接近的細(xì)胞因子（或生物調(diào)節(jié)蛋白）；干擾素分類p 根據(jù)分子結(jié)構(gòu)和抗原性的差異分為、等4個(gè)類型。每一類干擾素根據(jù)蛋白質(zhì)肽鏈的氨基酸數(shù)量或氨基酸序列的不同分成不同的亞型，如干擾素有24種亞型，其中包括1b 2a 2b等亞型；干擾素比病毒顆粒小干擾素生產(chǎn)工藝路線（3）p 基因工程大腸桿菌發(fā)酵生產(chǎn)工藝；p 表達(dá)產(chǎn)物：無糖基化，N-met，無活性包涵體；p 工藝特點(diǎn)：發(fā)酵過程，隨后變性、復(fù)性過程；p 優(yōu)點(diǎn)：來源、純度、活性、成本。雙鏈cDNA接上dT或dG尾pBR322質(zhì)粒加上dA或dC轉(zhuǎn)化大腸