DB37T3122-2018槐花多糖提取工藝及其生物活性評價技術(shù)規(guī)程.doc

ICS67.050X 04DB37山東省地方標(biāo)準(zhǔn)DB37/T 31222018槐花多糖提取工藝及其生物活性評價技術(shù)規(guī)程Technical Guideline of Sophora japonica Polysaccharide Extraction and Its Biological Activity Evaluation2018-02-02發(fā)布2018-03-02實施山東省質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督局發(fā)布DB37/T 31222018前言本標(biāo)準(zhǔn)按照GB/T 1.12009給出的規(guī)則起草。本標(biāo)準(zhǔn)由山東省畜牧獸醫(yī)局提出。本標(biāo)準(zhǔn)由山東省畜牧業(yè)標(biāo)準(zhǔn)化技術(shù)委員會歸口。本標(biāo)準(zhǔn)由山東農(nóng)業(yè)大學(xué)、山東省動物疫病預(yù)防與控制中心負(fù)責(zé)起草。本標(biāo)準(zhǔn)主要起草人：朱瑞良、魏凱、胡莉萍、孫振紅、黃河、郝智慧、閆振貴、王慧軍、裴宗飛。5槐花多糖提取工藝及其生物活性評價技術(shù)規(guī)程1 范圍本規(guī)程規(guī)定了槐花多糖提取工藝及其生物活性評價技術(shù)的術(shù)語和定義、試劑或材料、儀器設(shè)備、槐花多糖的提取、苯酚-硫酸法測定多糖含量和生物活性評價等標(biāo)準(zhǔn)。本規(guī)程適用于槐花多糖用作動物用免疫佐劑和免疫增強(qiáng)劑的制備和檢驗。2 規(guī)范性引用文件下列文件對于本文件的應(yīng)用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，僅所注日期的版本適用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB/T 603化學(xué)試劑試驗方法中所用制劑及制品的制備GB/T 6682分析實驗室用水規(guī)格和試驗方法GB 14925實驗動物環(huán)境及設(shè)施GB/T 14926.54實驗動物血凝抑制試驗3 術(shù)語和定義下列術(shù)語和定義適用于本文件。3.1分泌型免疫球蛋白ASecretory Immunoglobulin A，SIgAsIgA主要分布在唾液、淚液、腸胃液、乳汁以及呼吸道分泌液。在外分泌液當(dāng)中，是機(jī)體黏膜免疫當(dāng)中的主要抗體。在腸道黏膜免疫當(dāng)中起到關(guān)鍵作用的是分泌型免疫球蛋白A（Secretory Immunoglobulin A，SIgA）。作為腸粘膜上的主要免疫球蛋白，它是腸道黏膜上的第一道防線，對各種內(nèi)源共生菌及外源入侵的病原體都有抵抗作用。3.2血凝與血凝抑制試驗hemagglutination and hemagglutination inhibition test血凝試驗（hemagglutination test，HA）是指某些病毒或病毒的血凝素能選擇性地使某種或某幾種動物的紅細(xì)胞發(fā)生凝集，這種凝集紅細(xì)胞的現(xiàn)象稱為血凝，也稱直接血凝反應(yīng)，利用這種特性設(shè)計的試驗稱血凝試驗。血凝抑制試驗（hemagglutination inhibition test，HI）是指當(dāng)病毒的懸液中先加入特異性抗體，且這種抗體的量足以抑制病毒顆?；蚱溲兀瑒t紅細(xì)胞表面的受體就不能與病毒顆?；蚱溲刂苯咏佑|，這時紅細(xì)胞的凝集現(xiàn)象就被抑制，稱為血凝抑制，利用這種特性設(shè)計的試驗稱血凝抑制試驗。3.3酶聯(lián)免疫吸附實驗enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA將已知的抗原或抗體吸附在固相載體表面，使酶標(biāo)記的抗原抗體反應(yīng)在固相表面進(jìn)行的技術(shù)。4 試劑或材料4.1 牛血清白蛋白（BSA），配制方法見附錄A。4.2 1%雞紅細(xì)胞：配制方法見附錄A。4.3 纖維素酶。4.4 Sevag試劑：氯仿:正丁醇5:1（V/V）混合。4.5 無水乙醇。4.6 商品化新城疫滅活疫苗。4.7 商品化新城疫標(biāo)準(zhǔn)抗原。4.8 磷酸鹽緩沖溶液（PBS），配制方法見附錄A。4.9 去離子水。4.10 生理鹽水。4.11 96孔V形微量血凝板。4.12 96孔ELISA酶標(biāo)板。4.13 雞sIgA ELISA檢測試劑盒。4.14 抗凝管。4.15 注射器。4.16 密封袋。4.17 濃硫酸。4.18 苯酚。5 儀器設(shè)備5.1 恒溫干燥箱。5.2 超微粉碎機(jī)。5.3 40目篩網(wǎng)。5.4 電子天平。5.5 pH計。5.6 水浴鍋。5.7 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀。5.8 全自動血細(xì)胞分析儀。5.9 分光光度計。5.10 酶標(biāo)儀。5.11 磁力攪拌器。5.12 移液器（10 L1000 L）。5.13 微量振蕩器。5.14 高壓蒸汽滅菌器。5.15 蒸餾裝置。5.16 分光光度計（380 nm780 nm）。5.17 電子天平。5.18 坐標(biāo)紙。6 槐花多糖的提取6.1 采集新鮮盛開的槐花，去梗后放入恒溫干燥箱中于70 烘干，用超微粉碎機(jī)粉碎成粉末狀，過40目篩，裝入密封袋，-20 保存。6.2 稱取一定量的槐花粉與去離子水按體積1:25混合，用pH計調(diào)節(jié)pH至4.5，加入終濃度0.25 %的纖維素酶，45 水浴中浸提1 h，提取4次，合并4次上清液，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓濃縮至1/5體積。6.3 濃縮液用Sevag試劑（配制方法見附錄A）除蛋白，重復(fù)兩次，最后加入4倍體積的無水乙醇使多糖沉淀，對析出的多糖進(jìn)行離心，冷凍干燥后即為槐花多糖。7 苯酚-硫酸法測定多糖含量7.1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液的配制稱取葡萄糖100 mg，蒸餾水定容至100 mL的1 mg/L的葡萄糖液，搖勻后吸取10 mL該溶液，用去離子水稀釋定容至100 mL，即得100 ug/mL的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液。7.2 90 %苯酚液的配制量取苯酚90 mL，用去離子水定容至100 mL，即得90 %苯酚液，棕色瓶中避光保存。7.3 6 %苯酚液的配制將90 %苯酚液稀釋至6 %，即一體積儲存液對應(yīng)十四體積去離子水，臨用現(xiàn)配。7.4 實驗步驟7.4.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作取8支干凈的帶塞試管，按表1方法分別加入相應(yīng)體積的葡萄糖溶液，然后在冰水浴中加入0.5 mL的6 %苯酚溶液，震蕩搖勻后緩慢逐滴加入純硫酸，以不放熱或微量放熱為宜，搖勻后恒溫加塞，沸水放置20 min，取出后用涼水冷卻10 min，以0號作為空白調(diào)零，在最大吸收波長處（490 nm）測定吸光度。以葡萄糖濃度X為橫坐標(biāo)（g/mL），吸光度Y為縱坐標(biāo)，從而來繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。用excel軟件求得回歸方程。表1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作的試劑配制方法管號01234567葡萄糖（mL）0.00.10.20.30.40.50.60.7苯酚液（mL）0.50.50.50.50.50.50.50.5濃硫酸（mL）3.03.03.03.03.03.03.03.07.4.2 待測樣品多糖含量的測定與計算將提取得到的待測多糖用去離子水溶解，定容至100 mL，取溶解后的溶液，按標(biāo)準(zhǔn)曲線中的測定方法，以樣液為參比液，測定溶液的吸光值，按回歸方程計算待測溶液的多糖濃度，乘以稀釋倍數(shù)則為多糖含量。7.5 質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)用苯酚-硫酸法測的多糖含量大于80 %以上，視為提取的槐花多糖合格。8 生物活性評價8.1 槐花多糖對雞免疫功能的增強(qiáng)作用檢測將240只SPF雛雞，隨機(jī)分為4組，每組60只。、組為試驗組，于912日齡，每天頸部皮下注射0.25 mL槐花多糖溶液。其中、組槐花多糖含量分別為200 mg/mL、100 mg/mL、50 mg/mL，組為對照組，注射生理鹽水。12日齡時各組免疫雞新城疫滅活苗，于免疫后3 d、7 d、14 d、21 d，采樣檢測相關(guān)指標(biāo)。實驗雞的飼養(yǎng)符合GB 14925的要求。8.2 免疫器官指數(shù)免疫7天后，各組隨機(jī)取15只雛雞，稱量體重（稱重前12 h停飼停水），剖殺前采集血液（檢測后續(xù)指標(biāo)用），分別摘取胸腺、法氏囊、脾臟并稱重，計算出胸腺指數(shù)胸腺重（g）/活體重(kg)，法氏囊指數(shù)法氏囊重（g）/活體重(kg)，脾臟指數(shù)脾臟重（g）/活體重(kg)。8.3 血清抗體效價的檢測免疫后3 d、7 d、10 d、14 d、21 d，采集各組雛雞的血液，在37 溫箱靜置2 h，分離血清，用血凝（HA）與血凝抑制（HI）試驗檢測雛雞血清抗體水平。血凝（HA）與血凝抑制（HI）試驗依據(jù)GB/T14926.54。8.4 白細(xì)胞數(shù)目及淋巴細(xì)胞比率的測定用一次性醫(yī)用抗凝管采集各組雛雞的抗凝血1 mL，用全自動血細(xì)胞分析儀測定雛雞血液內(nèi)白細(xì)胞數(shù)目和淋巴細(xì)胞比率。8.5 小腸內(nèi)分泌型免疫球蛋白A（SIgA）含量的測定雛雞剖殺后，取10 cm長的十二指腸段，用3 mL 1 % BSA-PBS反復(fù)沖洗3次后，8000 rpm離心取上清，用商品化ELISA試劑盒檢測上清中SIgA的含量。AA附錄A （資料性附錄）溶液的配制A.1.1 牛血清白蛋白（BSA）的配制將100 mg的牛血清白蛋白加入9.5 mL水中（須將蛋白加入水中，而不是將水加入蛋白中），蓋好蓋后，輕輕搖動，直至牛血清白蛋白完全溶解為止。加水定容到10 mL，然后分裝成小份貯存于-20 。A.2 Sevag試劑的配制氯仿:正丁醇5:1（V/V）混合。A.3 磷酸鹽緩沖溶液（PBS）的配制取ZLI-9061 PBS溶于1000 mL的蒸餾水中，混勻，測pH值應(yīng)在7.27.4之間，若偏離此范圍，請用0.1N的HCL或NaOH調(diào)整。A.4 1%雞紅細(xì)胞的配制A.4.1 配制1 %紅細(xì)胞懸液時最好選擇23只SPF雞或未進(jìn)行過任何免疫過的成年公雞血液，采血時按十分之一采血量比例在一次性注射器中加入抗凝劑，如肝素或枸椽酸鈉等。A.4.2 采血完畢后最好分裝至2 mL容量的圓底離心管中，