雙縮脲法測定血清蛋白質含量—比色技術.pptVIP

生物化學實驗 CQMU,雙縮脲法測定血清蛋白質含量,張瑩 基礎醫(yī)學院 生物化學與分子生物學教研室,蛋白質的定量分析是生物化學和其他生命學科最常涉及的分析內(nèi)容，是臨床上診斷疾病及檢查康復情況的重要指標，也是許多生物制品，藥物、食品質量檢測的重要指標。在生化實驗中，對樣品中的蛋白質進行準確可靠的定量分析，則是經(jīng)常進行的一項非常重要的工作。,目前測定蛋白質含量的方法有很多種，下面列出根據(jù)蛋白質不同性質建立的一些蛋白質測定方法： 物理性質：紫外分光光度法。 化學性質：凱氏定氮法、雙縮脲法、Lowry法 染色性質：考馬斯亮藍染色法、銀染法。 其他性質：熒光法。,掌握雙縮脲法測定蛋白質的原理 掌握分光光度計的使用 掌握標準曲線的制作 學習分光光度法測定的原理和方法,實驗目的,實驗原理,雙縮脲反應（Biuret reaction）,兩分子尿素加熱脫氨縮合成的雙縮脲（H2N-OC-NH-CO-NH2），因分子內(nèi)含有兩個鄰接的酰胺鍵，在堿性溶液中可與Cu2+發(fā)生雙縮脲反應，生成紫紅色絡合物。,雙縮脲法測定蛋白質的原理,蛋白質分子含有大量彼此相連的肽鍵（-CO-NH-），同樣可以與堿性銅溶液中的Cu2+發(fā)生雙縮脲反應而生成紫紅色的Cu2+-蛋白質絡合物。在一定范圍內(nèi)紫紅色顏色的深淺與蛋白質含量成正比，因此可以用分光光度法測定樣品中蛋白質的含量。,方法學評價,操作簡便、迅速、受蛋白質性質的影響較??； 靈敏度較差，需要樣本含蛋白質120 mg水平才能檢測到； 且特異性不高，除含-CONH-的化合物有此反應外，凡是含-CONH2、-CH2NH2 、 -CS-NH2等基團的化合物也有此反應。,分光光度法的基本原理,分光光度法是利用物質具有對光的選擇性吸收特征而建立起來的一種定量、定性分析方法。 當一束單色光通過均勻的溶液時，入射光強度為Io，透射光強度為It。,透光率（Transmittance）T：透射光的強度It與入射光強度I0之比。,透光率愈大，溶液對光的吸收愈少；透光率愈小，溶液對光的吸收愈多。,吸光度（Absorbance）A:透光率的負對數(shù)。,A愈大，溶液對光的吸收愈多。,Lambert-Beer定律吸收光譜法基本定律,描述物質對單色光吸收強弱與厚度和待測物濃度的關系。 含義：一束單色光通過溶液時，光能被吸收的程度與溶液的濃度和液層厚度成正比。,AKCL,A為溶液對光的吸光度，反映了物質對光的吸收程度； K為吸光系數(shù)，是物質在單位濃度和單位厚度的條件下對入射光的吸光度。 C為溶液濃度； L為溶液厚度； 實驗中溶液厚度不變，則AKC,分光光度法的基本應用,利用吸收光譜對物質進行定性分析 利用吸收光譜對物質進行定量分析,原理：根據(jù)物質對于入射光的特征吸收，可應用于物質溶液的定性檢測 常用方法： 比較吸收光譜曲線：在相同的條件下，吸收光譜曲線不同，表明物質的化學結構不同。 比較最大吸收波長：不同物質的最大吸收波長不同；化學結構相似的物質最大吸收波長相同，吸收系數(shù)不同。 比較吸光度的比值：多用于檢測物質的純度（DNA A260/A280=1.8 純度鑒定),利用吸收光譜對物質進行定性分析,原理： Lambert-Beer定律 常用方法： 標準曲線法 配制一系列已知不同濃度的標準溶液，用選定的顯色劑顯色。選用合適波長的入射光。測定時先以空白溶液調節(jié)透光率100%，然后分別測定標準系列的吸光度。以吸光度為縱坐標，濃度為橫坐標作圖得到一條通過原點的直線，叫做標準曲線（或稱A-C曲線）。,利用吸收光譜對物質進行定量分析,標準曲線,標準曲線與樣品的測定條件必須一致。,常用方法： 標準曲線法 標準管法： 對個別樣品進行測定，且A-C曲線線性良好直接比較測定結果。 A標 =K標c標b標 A測 =K測 c測 b測 c測 =A測 /A標 c標,分光光度計的使用,分光光度計設計的原理,分光光度計操作,打開電源開關，使儀器預熱20分鐘 用“波長設置”按鈕將波長設置在您將要使用的分析波長位置上 打開樣品室蓋，按“0%T”鍵調透射比零 蓋好樣品室蓋，按“100%T”調100%透射比 按“方式鍵”（MODE）將測試方式設置為吸光度方式(A) 將參比溶液和被測溶液分別倒入比色皿中 打開樣品室蓋，將盛有溶液的比色皿分別插入比色皿槽中，蓋上樣品室蓋 將參比溶液推入或拉入光路中，按“100%T”調零A 將被測溶液拉入光路中，此時，顯示器上所顯示是被測樣品的吸光度參數(shù) 實驗完成后，關閉電源，洗凈比色皿，并蓋好蓋布。,實驗步驟,取試管7支，按下表操作并記錄：,混勻各管，室溫放置30分鐘。以空白管調零，在波長540 nm比色，讀取各管光吸收值，并記錄。,在座標紙上以各管蛋白質含量為橫座標，兩管平均光吸收值為縱座標，繪制標準曲線。 以測定管的光吸收值在標準曲線中查出該待測血清樣本的蛋白質含量。 計算待測血清樣本中蛋白質的濃度（g/L）。,注意事項,本實驗是定量實驗，要求所有玻璃儀器必須潔凈、干燥，蛋白質標準液和血清取量必須準確。 雙縮脲試劑應該在最后同時加入各個試管，以保證各管反應同時進行。 各管加好樣后必須充分混勻。顯色反應需要2030 min才能完成，顯色后放置4小時光吸收值穩(wěn)定。 注意