杜氏肌營(yíng)養(yǎng)不良癥DMD與遺傳.ppt

,疾病概述,Dystrophie musculaire de Duchenne,DMD，杜氏肌營(yíng)養(yǎng)不良，假肥大型肌營(yíng)養(yǎng)不良 Dystrophine（Dys） 抗肌萎縮蛋白 缺失 Maladie monogenique Htdit: XR Duchenne, un neurologiste franais, a donn une description complte de 13 maladies attaints,Phnotype Clinique de la DMD,Les muscles jumeaux des jambs des garons atteints apparaissent quils soient dvelopps Mais asthniques 假性肌肥大 Tissu conjonctif et la graisse,Phnotype Clinique de la DMD,12 ans normal 3 5 ans dveloppe une faiblesse musculaire Ds lge de 12 ans confin en chaise roulant Au-del de lge de 20 ans ne survivra QI 智商 une chute modr denviron 20 points,Lab Cratine kinase (niveau srique)血清濃度 50 100 fois la limite suprieure de la normale dans les stades prcoces,Dystrophie musculaire de Becker,le gne de la dystrophie Beaucoup plus attnu 緩和 Aprs lge de 16 ans parvient marcher 之后多年也可行走,DMD與BMD的差異,DMD致死 BMD存活率非常高(70%),易產(chǎn)生 新的突變,遺傳,遺傳特征,Htdit: XR,遺傳特征,（1）系譜中常常只有男性患者 （2）父母都無(wú)病時(shí)，女兒則不會(huì)發(fā)病，兒子可能發(fā)??； （3）由于交叉遺傳，患者的同胞、舅舅、姨表兄弟、外甥常常為本病患者； （4）由于男性患者的子女都正常，故可見隔代遺傳； （5）女性患者的父親一定是患者,母親一定是攜帶者。,DMD 男女差異,男性致死 1/3 nomutation,2/3 mre porteuse 女性攜帶者 Majorit 無(wú)任何臨床表現(xiàn)，70% 肌酸激酶(Cratine kinase ) 增高 8% 輕微的肌肉癥狀,有些還有嚴(yán)重的近心端肌肉障礙。 女性很少患有DMD,母系鑲嵌,某男性是家族中DMD的先證者 他的母親沒有攜帶突變基因 遺傳位點(diǎn)上發(fā)生了新近的突變 大約5%-15%的這些發(fā)生的例子是由于母系生殖鑲嵌,DMD 發(fā)病率較高,Garons nouveau-ns：1/3300 Un taux de mutation ：1/10000 每天一個(gè)男性每11-12秒會(huì)產(chǎn)生1個(gè)新突變的精子（8 x 107 par jour）,基因與蛋白,Gne DMD,人類最大的基因之一，2300 kb 位于Xp 占X 染色體全長(zhǎng)的1.5% 99% 的序列由內(nèi)含子組成 編碼區(qū)包括79個(gè)外顯子及7 個(gè)組織特異性的啟動(dòng)子 其mRNA 序列長(zhǎng)114 kb 主要表達(dá)于骨骼肌、心肌，少量表達(dá)于腦組織,7 個(gè)組織特異性的啟動(dòng)子,B( 腦皮質(zhì)) 、M( 肌組織) 、P( 蒲肯野纖維) 、R( 視網(wǎng)膜) 、B3( 腦組織) 、S(施旺細(xì)胞)和G( 肌組織之外的多種組織器官) B 型：大腦皮層、海馬回神經(jīng)元 P型：小腦蒲肯野細(xì)胞, 在骨骼肌也有極少量的表達(dá) M 型：骨骼肌、心肌組織, 同時(shí)在腦神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞也有少量表達(dá),Dystrophin 抗肌萎縮蛋白,全長(zhǎng)型dystrophin 是一種427 kDa的棒狀蛋白, 長(zhǎng)約150 nm, 分為4 個(gè)區(qū)域， 氨基端區(qū)域 中央棒狀區(qū) 富含半胱氨酸區(qū)域 羧基端區(qū)域,A. 位于Xp21, 黑色的豎線代表分布于整個(gè)基因上的79 個(gè)外顯子, 黑色箭頭指示各組織特異性啟動(dòng)子不同的啟動(dòng)位點(diǎn), 分別以不同的字母縮寫來(lái)代表, B( 腦皮質(zhì)) 、M( 肌組織) 、P( 蒲肯野纖維) 、R( 視網(wǎng)膜) 、B3( 腦組織) 、S( 施旺細(xì)胞)和G( 肌組織之外的多種組織器官) 。 B. 不同形式的dystrophin 蛋白及其區(qū)域組成, 氨基端、中央棒狀區(qū)域、富含半胱氨酸區(qū)域及羧基端區(qū)域,DMD患者：60%基因突變表現(xiàn)為缺失 一般在基因的5端和中央棒區(qū)兩個(gè)區(qū)域 BMD患者：可能缺失了一個(gè)或者幾個(gè)基因序列 dystrophine蛋白的特點(diǎn) DMD患者體內(nèi)很少或者沒有 BMD患者體內(nèi)有表達(dá)，但是仍然比正常人少,臨床治療,DMD治療,目前為止尚無(wú)治療DMD的有效方法 藥物治療（對(duì)癥治療）：糖皮質(zhì)激素治療 短期口服激素治療可增強(qiáng)骨骼肌力量和功能，并可能在更長(zhǎng)時(shí)間內(nèi)穩(wěn)定骨骼肌力量和功能 基因治療：利用不直接引起人類疾病，免疫原性較小的腺相關(guān)病毒（AAV）為載體，導(dǎo)入人工剪裁的Dys基因 修正肌肉組織(占全身體重40)的基因缺陷遇到各種各樣的困難 康復(fù)治療、矯形治療、社會(huì)心理治療等,臨床檢測(cè),產(chǎn)前診斷和雜合子診斷,90%攜帶者孕婦中產(chǎn)前診斷可能有至少95%的精確度 由于基因突變導(dǎo)致基因的缺失或者多倍體的家庭中，60%-70%可以直接通過(guò)southern印跡雜交技術(shù)或者PCR技術(shù)來(lái)測(cè)量胎兒的DNA得到 在其余的基因缺失不能明確診斷出來(lái)的家庭中，可以通過(guò)鍵的標(biāo)記來(lái)完成產(chǎn)前診斷 與患病男性結(jié)婚的女性中 75%的女性：DNA檢查、CK血清濃度檢查胎兒是否攜帶 25%女性難檢測(cè)： 第一，在病程的一些時(shí)期，基因缺陷是無(wú)法被檢查出來(lái)的（可能情況就是等位基因是正常的或者突變的等位基因位于另外一條X染色體上） 第二，一些家庭的一些成員的樣本丟失了 第三，兩個(gè)標(biāo)記基因之間的基因重組在X染色體傳入下一代之前發(fā)生了（母系鑲嵌）,產(chǎn)前檢測(cè),生物化學(xué)檢查CK血清濃度 基因診斷 多重PCR Southern blot 探針連接多重?cái)U(kuò)增(MLPA) 變性高效液相色譜(DHPLC) 抗肌萎縮蛋白的免疫組化,多重PCR方法DMD、BMD相關(guān)基因的缺失、重復(fù),可直接檢出DMDBMD的缺失型突變 65的患者為基因缺失所致 多重PCR:使用多對(duì)引物的 針對(duì)DMD基因的缺失熱區(qū)，利用多對(duì)PCR引物在一個(gè)PCR管中同時(shí)擴(kuò)增多個(gè)外顯子，通過(guò)和正常對(duì)照相比較而判斷外顯子的缺失情況,多重PCR方法,優(yōu)點(diǎn)： 1、具有敏感、特異性強(qiáng)和可重復(fù)性好的優(yōu)點(diǎn) 2、需要的DNA量少、操作簡(jiǎn)單 局限性: 1. 女性攜帶者正常x染色體的屏蔽效應(yīng)，無(wú)法檢出 2.多重PCR體系內(nèi)，由于引物之間的相互競(jìng)爭(zhēng)，有時(shí)也會(huì)出現(xiàn)個(gè)別片段擴(kuò)增的假陰性結(jié)果。（對(duì)初次擴(kuò)增呈陰性結(jié)果的片段進(jìn)行再次擴(kuò)增，以驗(yàn)證結(jié)果的準(zhǔn)確性）,Southern blot方法DMD、BMD相關(guān)基因的缺失、重復(fù),是一種常用的DNA定量的分子生物學(xué)方法 原理 將待測(cè)的DNA樣品固定在固相載體(硝酸纖維膜或尼龍膜)上 與同位素標(biāo)記的核酸探針進(jìn)行雜交 在與探針有同源序列的固相DNA的位置上顯示出雜交信號(hào) 通過(guò)檢測(cè)信號(hào)的有無(wú)、強(qiáng)弱可以對(duì)樣品定性、定量，從而計(jì)算出轉(zhuǎn)入的拷貝數(shù),Southern blot方法,優(yōu)點(diǎn)：Southern雜交準(zhǔn)確性高、特異性強(qiáng) 缺點(diǎn)： 1、不經(jīng)過(guò)靶片段的擴(kuò)增(PCR)，一般每個(gè)電泳通道需要1030g的DNA，在實(shí)際操作中就需較大量的DNA樣品 2、Soutllem雜交不能確定缺失的準(zhǔn)確外顯子范圍，對(duì)檢測(cè)女性重復(fù)突變(duplication)或三重重復(fù)(triplication)攜帶者存在困難 3、由于DMD基因很大，需要6到8個(gè)cDNA探針，雜交反應(yīng)才能覆蓋整個(gè)DMD基因，要12周時(shí)間用來(lái)分析，勞動(dòng)量大 4、需要使用放射性同位素作為示蹤物，會(huì)對(duì)工作環(huán)境帶來(lái)污染,多重探針連接依賴性擴(kuò)增技術(shù) MLPA,multiplex probe ligation dependent amplification 原理 針對(duì)所有需要檢測(cè)突變的DNA序列，設(shè)計(jì)多對(duì)特異探針 固定在尼龍膜上 和待測(cè)樣品DNA雜交然后洗膜（正常序列和探針雜交后不被洗脫） 利用連接酶把探針連接起來(lái) 使用一套通用引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增 PCR產(chǎn)物用PCR儀進(jìn)行分析，DNA片段的缺失重復(fù)以及拷貝數(shù)以測(cè)序儀得到信號(hào)的有無(wú)及信號(hào)的峰高或面積進(jìn)行計(jì)算,優(yōu)點(diǎn)： 可以在1個(gè)PCR管中完成多達(dá)40個(gè)外顯子的缺失重復(fù)檢測(cè) 專門用于DMD缺失重復(fù)檢測(cè)的試劑盒，通過(guò)2個(gè)PCR反應(yīng)就可以完成79個(gè)外顯子及其非翻譯序列的缺失重復(fù)突變篩查 靈敏度高、操作簡(jiǎn)單、可重復(fù)性好、經(jīng)濟(jì)快捷,DMD患者(A)及其母親(B)的20-47號(hào)外顯子的MLPA檢測(cè)結(jié)果,變性高效液相色譜 DHPLC,denaturing high performance liquid chromatography 原理 用離子對(duì)逆向?qū)游龇ǚ蛛x并檢測(cè)異源雙鏈 通過(guò)三乙基醋酸鈉（TEAA)作為橋分子