免疫組織化學(xué).ppt

免 疫 組 織 化 學(xué) Immunohistochemistry (IHC),第一章 免疫組織化學(xué)基本原理 及相關(guān)知識(shí),用標(biāo)記的抗體（或抗原）對(duì)細(xì)胞或組織內(nèi)的相應(yīng)抗原（或抗體）進(jìn)行定性、定位或定量檢測(cè)，經(jīng)過(guò)組織化學(xué)的顯色反應(yīng)之后，用顯微鏡、熒光顯微鏡或電鏡觀察。,蛋白質(zhì) 磷脂 多肽 多糖 核酸 受體 酶 病原體 激素,免疫組織化學(xué)技術(shù)的突出優(yōu)點(diǎn)： 高度的特異性 敏感性高 方法步驟統(tǒng)一 機(jī)能和代謝密切結(jié)合， 定性、定位、定量的統(tǒng)一,免疫組織化學(xué)技術(shù)在細(xì)胞、染色體或亞細(xì)胞水平原位檢測(cè)抗原分子，是其它任何生物技術(shù)難以達(dá)到和代替的。它能在細(xì)胞、基因和分子水平同時(shí)原位顯示基因及其表達(dá)產(chǎn)物，形成了新的檢測(cè)系統(tǒng)，為生物學(xué)、醫(yī)學(xué)和各個(gè)領(lǐng)域分子水平的研究與診斷，開(kāi)拓了廣闊的前景。, 基因探針 核酸分子雜交技術(shù) 原位PCR技術(shù) 核酸雜交和免疫組織化學(xué)雙標(biāo)記 電鏡雜交技術(shù),核酸分子探針-雜交-免疫組織化學(xué) 放大和顯示雜交信號(hào) 雜交免疫組織化學(xué),基因重組技術(shù) 免疫組織化學(xué) 圖像分析 單抗技術(shù) 技 術(shù) 流式細(xì)胞術(shù) 激光共聚焦顯微術(shù),免疫組織化學(xué)的全過(guò)程： 抗原的提取和純化 免疫動(dòng)物或細(xì)胞融合（單克隆抗體） 抗體效價(jià)檢測(cè)和提取、純化 標(biāo)記抗體 細(xì)胞、組織切片標(biāo)本的制備 免疫組織化學(xué)反應(yīng)和顯色 觀察和記錄結(jié)果,第二章 免疫組織化學(xué)中的技術(shù)問(wèn)題,技術(shù)問(wèn)題的重要性,第一節(jié) 有關(guān)的細(xì)胞和組織學(xué)技術(shù),一、取材 （一）細(xì)胞標(biāo)本的取材 印片法 穿刺吸取涂片法 體液沉淀涂片法 細(xì)胞數(shù)量多：直接涂片 細(xì)胞數(shù)量少：離心沉淀涂片, 培養(yǎng)細(xì)胞 直接收集 培養(yǎng)液離心涂片,（二）組織標(biāo)本的取材 活檢鉗的刀口必須鋒利，以免組織受擠壓 取材部位必須是主要病變區(qū) 必須取病灶與正常組織交界處 必要時(shí)取遠(yuǎn)離病灶區(qū)的正常組織作對(duì)照,新鮮組織 冰凍切片 液氮保存 -70冰箱,二、固定 固定劑：常用醛類固定劑 10%福爾馬林（甲醛10ml + 蒸餾水90ml） 10%中性緩沖福爾馬林（甲醛10ml + 0.01mol/L pH7.4 PBS 90ml ） 2.5%戊二醛 用于電鏡 丙酮 用于冰凍切片、細(xì)胞涂片 4,固定方法： 浸入法 灌注法,三、切片 1. 石蠟切片 2. 冰凍切片 3. 塑料切片 4. 超薄切片,四. 玻片處理和涂膠 載玻片和蓋玻片處理 蓋玻片、載玻片 清潔液中浸泡24h（硫酸 + 重鉻酸鉀） 清水沖洗 蒸餾水沖洗 95%酒精浸泡24h 烘干,載玻片涂粘附劑: APES 多聚賴氨酸,第二節(jié) 免疫組化染色中的技術(shù)問(wèn)題,一、抗體 新制備或購(gòu)進(jìn)的是原液或凍干品，抗血清為全血清，單克隆抗體是培養(yǎng)上清或腹水。,1. 抗體貯存 2. 抗體稀釋 按不同的免疫染色方法和抗原性強(qiáng)弱及抗原的多少，稀釋各種抗體原液，以便獲得最佳免疫染色效果。, 抗體最佳稀釋度的測(cè)定方法 二抗 一 抗 1 1:50 1:100 1:200 1:400 _ 1:50 + + + 1:100 + + + 1:200 + + 1:400 _, 以中等陽(yáng)性稀釋度為佳 抗體稀釋液的配制 0.01mol/L pH7.4 PBS or TBS,3抗體的選擇 (1) 多抗：雖然存在交叉反應(yīng)的問(wèn)題，但由于識(shí)別多個(gè)抗原表位，所以即使有少數(shù)幾個(gè)抗原表位被破壞，仍然不會(huì)影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果，這是多抗的優(yōu)點(diǎn)之一。 (2) 單抗：識(shí)別單個(gè)抗原表位，所以特異性高。但如果所識(shí)別的抗原表位被破壞，則會(huì)影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果，這也是單抗的缺點(diǎn)之一。,多抗？單抗？ 抗原表位的豐富程度 也可應(yīng)用多個(gè)單抗 （a cocktail of monoclonal antibodies）解決抗原表位少的問(wèn)題,二、免疫染色 一般程序： 標(biāo)記抗體與標(biāo)本中的抗原反應(yīng)結(jié)合 用PBS洗去未結(jié)合的部分 直接觀察結(jié)果（免疫熒光）或顯色后再用顯微鏡觀察（免疫酶）,1. 增強(qiáng)特異性染色的方法 蛋白酶消化法 胃蛋白酶、胰蛋白酶 合適的抗體稀釋度 第一抗體 溫育時(shí)間 37 30-60 min, 4 過(guò)夜 多層染色法（雙層、三層）,2. 減少或消除非特異性染色的方法 加二抗動(dòng)物的正常血清 2%5%牛血清白蛋白,3. 顯色反應(yīng)的控制 顯色劑的濃度、溫育時(shí)間 4. 復(fù)染,三、對(duì)照 陽(yáng)性對(duì)照 陰性對(duì)照 阻斷試驗(yàn) 替代對(duì)照 空白對(duì)照 自身對(duì)照 吸收試驗(yàn),四、免疫組織化學(xué)染色結(jié)果的判斷 陽(yáng)性細(xì)胞染色分布有三種類型：胞漿、胞核、細(xì)胞膜表面, 陽(yáng)性細(xì)胞分布可分為灶性或彌漫性 由于細(xì)胞內(nèi)抗原含量不同，所以染色強(qiáng)度不一, 陽(yáng)性細(xì)胞染色定位于細(xì)胞，與陰性細(xì)胞相互交雜分布。 切片邊緣、刀痕或皺折區(qū)域 、壞死或擠壓的細(xì)胞區(qū)、膠原結(jié)締組織等，常表現(xiàn)為相同的陽(yáng)性染色強(qiáng)度，不能用于判斷陽(yáng)性。,第三章 免疫組織化學(xué)常用方法介紹,第一節(jié) 免疫酶細(xì)胞化學(xué),免疫酶細(xì)胞化學(xué)是免疫組織化學(xué)中最常用的方法，它是在抗原抗體特異反應(yīng)存在的前提條件下，借助于酶細(xì)胞化學(xué)手段，檢測(cè)某種物質(zhì)（抗原抗體）在組織細(xì)胞內(nèi)的存在部位。即預(yù)先將抗體與酶連結(jié)（酶標(biāo)抗體），再使其與組織內(nèi)特異性抗原反應(yīng)，經(jīng)細(xì)胞化學(xué)染色后，在光鏡或電鏡下觀察分析。,一、常用酶的種類 用于標(biāo)記的酶應(yīng)具備以下幾點(diǎn)： 酶催化的的底物必須是特異性的，且容易被顯示，所形成的產(chǎn)物易于在光鏡或電鏡下觀察。 所形成的終產(chǎn)物沉淀必須穩(wěn)定，不向周圍組織彌散。 較易獲得酶分子，最好有商品出售。, 中性pH時(shí)，酶應(yīng)穩(wěn)定，酶標(biāo)記抗體后，保存12年活性不應(yīng)改變。 酶標(biāo)過(guò)程中，酶與抗體連結(jié)，不能影響二者的活性。 被檢測(cè)組織中，不應(yīng)存在與標(biāo)記酶相同的內(nèi)源性酶或類似物質(zhì)。,免疫組織化學(xué)常用酶 名稱 分子量 內(nèi)源性 商品 HRP (POD) 40-50 kD + 有 ALP (AP) 80-120 kD + 有 , HRP/POD（辣根過(guò)氧化物酶） 顯色原理： HRP + H2O2 HRP H2O2 + 供氫體 （電子供體） HRP + H2O + 供氫體 （氧化型）,DAB（二氫基聯(lián)苯胺） 棕褐色 AEC（3-氫-9-乙基咔唑） 紅色 TMB（四甲基聯(lián)苯氨） 深藍(lán)色, ALP/AP（堿性磷酸酶） 底物：萘酚（As-Mx） 發(fā)色團(tuán)：Fast Blue Fast Red BCIP/NBT,血細(xì)胞、淋巴細(xì)胞 內(nèi)源性過(guò)氧化酶含量較高 可選用ALP/AP,二、染色步驟及原理 間接法： 1. 石蠟切片經(jīng)二甲苯脫蠟，下行酒精至水; 2. 未固定的冰凍切片，丙酮固定 2030 min，風(fēng)干1530min;,3. 用0.03%H2O2處理切片1530 min(室溫)，封閉內(nèi)源性過(guò)氧化酶的活性； 4. PBS洗滌2min; 5. 0.05% Tween-20/PBS，5min（室溫）；,6. 0.1%-1% BSA濕盒內(nèi)孵育1525 min（室溫），然后輕輕棄去孵育液（不沖洗） ；(或二抗動(dòng)物的正常血清); 7. 輕輕棄去孵育液，滴加PBS稀釋的第一抗體，濕盒內(nèi)孵育12 h （20-25）； 8. PBS充分沖洗， 5min 3次，以去除切片上非特異性吸附的抗體；,9. 滴加PBS稀釋的HRP標(biāo)記的第二抗體，濕盒內(nèi)孵育4560 min （室溫）； 10. PBS漂洗 5min 3 次； 11. 顯色，0.01% - 0.1% H2O2 0.01% -0.05% DAB, 1015 min； 12. 細(xì)胞核復(fù)染（甲基綠或蘇木素）； 13. 封片、觀察、記錄。,親和組織化學(xué)（affinity histochemistry） 植物凝集素與糖類 生物素與抗生物素 葡萄球菌A蛋白與IgG 陽(yáng)離子與陰離子 激素、維生素、糖類與受體,第二節(jié) 抗生物素-生物素免疫細(xì)胞化學(xué)染色法,一、基本原理 抗生物素（卵白素） avidin 分子量68 000 糖蛋白 生 物 素 （維生素H） biotin 分子量 244,biotin,avidin,biotin,biotin,biotin,二、抗生物素-生物素-過(guò)氧化酶復(fù)合物技術(shù) (Avidin-Biotin-peroxidase Complex technique, ABC法) 其特點(diǎn)是利用抗生物素分別連接生物素標(biāo)記的第二抗體和生物素標(biāo)記的酶。,second antibody-biotin + Avidin + biotin-HRP,ABC complex,操作步驟： 1. 石蠟切片脫蠟，系列酒精至水； 2. 冰凍切片丙酮固定10min，PBS洗滌5min 3；,2. 第一抗體，室溫孵育60 min ； 3. PBS洗滌 5 min 3次 4. 生物素標(biāo)記的第二抗體，孵育45 min 5. PBS洗滌 5 min 3次,6. ABC復(fù)合物， 45 min 7. PBS洗滌 5 min 3次 顯色（H2O2/DAB）、復(fù)染、封片 觀察、記錄,second antibody-biotin + Avidin + biotin-HRP,ABC復(fù)合物的配制： biotin：avidin 1：4 avidin 10g/ml biotin 2.5g/ml 臨用前30分鐘配制,ABC法特點(diǎn)： 敏感性強(qiáng)，具有放大作用 特異性強(qiáng)，背景染色淡 方法簡(jiǎn)便，節(jié)約時(shí)間 由于生物素與抗生物素具有與多種示 蹤物結(jié)合的能力，可用于雙重或多重染色,注意事項(xiàng) 內(nèi)源性生物素活性及其消除：肝、腎、白細(xì)胞、乳腺預(yù)先以0.01%抗生物素和0.01%生物素溶液分別作用20 min，以消除內(nèi)源性生物素。 試劑的差異，應(yīng)進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn)。 ABC試劑盒保存以4為佳。,第三節(jié) 葡萄球菌蛋白A（SPA）,葡萄球菌蛋白A（ staphylococal protein, SPA）是一種從金黃色葡萄球菌細(xì)胞壁分離的蛋白質(zhì)。 早在1940年，Vevwey發(fā)現(xiàn)某些金黃色葡萄球中，含有一種物質(zhì)，在雙向擴(kuò)散試驗(yàn)中能與正常人血清形成沉淀，1959年將其命名為A抗原。,一、免疫學(xué)特性 SPA具有與人及多種動(dòng)物（豚鼠、豬、小鼠、猴等）IgG結(jié)合的能力。SPA結(jié)合部位是Fc段而不是Fab段，這種結(jié)合不會(huì)影響抗體的活性。SPA具有的結(jié)合力是雙價(jià)的，每個(gè)SPA分子可以同時(shí)結(jié)合兩個(gè)IgG分子，也可一方面同IgG結(jié)合，一方面與標(biāo)記物如熒光素、過(guò)氧化物酶、膠體金、鐵蛋白等相結(jié)合。,SPA對(duì)IgG免疫球蛋白亞型的結(jié)合有選擇性，如 SPA 與人 IgG 亞型IgG1 、IgG2 、IgG4 有結(jié)合力，與IgG3沒(méi)有結(jié)合力。,二、SPA在免疫組化中的作用 可作為二抗或標(biāo)記抗體。SPA的最大優(yōu)點(diǎn)是不受種屬特異性的限制，還具有染色時(shí)間短、靈敏性高和背景染色淡等優(yōu)點(diǎn)。,SPA-膠體金技術(shù)（PGA技術(shù)）可在電鏡水平檢查抗原抗體反應(yīng)的定位，是一種較為理想的免疫電鏡技術(shù)。,SPA-HRP用于間接法的操作步驟： 切片脫蠟 第一抗體，37，孵育30min或4，2448 h PBS 沖洗， 5min 3次 SPA-HRP（1:100 1:400）， 30 min DAB-H2O2顯色 復(fù)染、封片、觀察、記錄,第四節(jié) 凝集素,凝集素（lectin）是指一種從各種植物、無(wú)脊椎動(dòng)物和高等動(dòng)物中提純的糖蛋白或結(jié)合糖的蛋白質(zhì)，因其能凝集紅細(xì)胞（含血型物質(zhì)），故名凝集素。,植物凝集素 刀豆蛋白A （ConA） 麥胚素 （WGA） 花生凝集素 （PNA） 大豆凝集素 （SBA）,一、基本原理 生物膜中含有一定量的糖類，主要以糖蛋白和糖脂的形式存在。凝集素的最大特點(diǎn)在于它們能識(shí)別糖蛋白或糖脂，特別是細(xì)胞膜中復(fù)雜的碳水化合物結(jié)構(gòu)，即細(xì)胞膜表面的碳水化合物決定簇。一種凝集素具有對(duì)某一種特異性糖基專一性結(jié)合的能力。因此，凝集素可以作為一種探針來(lái)研究細(xì)胞膜上特定的糖基。,麥芽素 N-乙酰糖胺 菜豆凝集素 N-乙酰乳糖胺 刀豆素 -D-吡喃糖基甘露糖,凝集素具有多價(jià)結(jié)合的能力，能與熒光素、生物素、酶、膠體金和鐵蛋白等示蹤物質(zhì)結(jié)合。,二、操作程序 直接法：標(biāo)記物直接標(biāo)記在凝集素上，使之直接與切片中的相應(yīng)糖蛋白或糖脂相結(jié)合。,1. 切片脫蠟至水； 2. 凝集素標(biāo)記物（100 g/ml），室溫，30min； 3. 熒光素標(biāo)記物，封片用熒光顯微鏡觀察； 4. PBS洗滌，5min 3次； 5. 顯色、封片、觀察、記錄。, 間接法：將凝集素直接與切片中的相應(yīng)糖基結(jié)合，而將示蹤物質(zhì)標(biāo)記在抗凝集素抗體上。,1. 切片脫蠟至水； 2. 凝集素稀釋液（10 g/ml），室溫，30min； 3. PBS洗滌，5min 3次； 4. 標(biāo)記的抗凝集素抗體（1:100），孵育30min； 5. PBS洗滌，5min 3次； 6. 顯色、封片、觀察、記錄。, 糖-凝集素-糖法：過(guò)量的凝集素與組織切片中特定的糖基相結(jié)合，再與有過(guò)氧化物酶標(biāo)記的特異性糖基相結(jié)合，形成一個(gè)三明治樣的糖基-凝集素-糖基的結(jié)合物。,1. 切片脫蠟至水； 2. 凝集素稀釋液（10 g/ml），室溫，30min； 3. PBS洗滌，5min 3次； 4. HRP標(biāo)記糖基（10 g/ml），孵育30min； 5. PBS洗滌，5min 3次； 6. 顯色、封片、觀察、記錄。,三、應(yīng)用 作為細(xì)胞分化和成熟的標(biāo)記 淋巴細(xì)胞的分群 小鼠胸腺皮質(zhì)內(nèi)不成熟的T淋巴細(xì)胞呈PNA陽(yáng)性反應(yīng)，在小鼠小腸集合淋巴小結(jié)的生發(fā)中心也發(fā)現(xiàn)有20%左右的PNA陽(yáng)性反應(yīng)細(xì)胞，后者是否屬于不成熟的 T 淋巴細(xì)胞，值得進(jìn)一步研究。, 作為細(xì)胞特殊類型的標(biāo)記 研究人視網(wǎng)膜，PNA標(biāo)記視錐細(xì)胞而不標(biāo)記視桿細(xì)胞。 乳腺上皮細(xì)胞呈PNA陽(yáng)性反應(yīng)，肌上皮細(xì)胞呈PNA陰性反應(yīng)。,刀豆素A和蓖麻素存在于腎臟各部，PNA和雙花扁豆凝集素（DBA）主要分布于遠(yuǎn)曲小管和集合小管上皮細(xì)胞，荊豆凝集素（UEA）主要分布在血管內(nèi)皮細(xì)胞，而麥芽素分布在腎小球。, 腫瘤中凝集素結(jié)合的改變 腫瘤細(xì)胞伴有細(xì)胞膜的改變，細(xì)胞膜上的糖基也會(huì)產(chǎn)生相應(yīng)的變化，可用凝集素檢測(cè)出來(lái)。 凝集素可作為腫瘤特異性診斷的標(biāo)記，腫瘤惡性的標(biāo)記和不同腫瘤的分化標(biāo)記。,第五節(jié) 鏈霉菌抗生物素蛋白檢測(cè)系統(tǒng),鏈霉菌抗生物素蛋白是從鏈霉菌中分離出來(lái)的不含糖基鏈的蛋白質(zhì)，分子量47kD，含4個(gè)亞基，每個(gè)亞基都能與一個(gè)生物素分子結(jié)合。,抗生物素蛋白等電點(diǎn)為10，而鏈霉菌抗生物素蛋白等電點(diǎn)為6.5，接近中性，幾乎不與組織中的內(nèi)源性凝集素樣物質(zhì)發(fā)生非特異性結(jié)合。因此，可產(chǎn)生低背景、高放大的效果。,一、SP法 （ Streptavidin Peroxidase conjugated method ） 生物素標(biāo)記的第二抗體與鏈霉菌抗生物素蛋白連接的過(guò)氧化物酶結(jié)合。,操作步驟： 石蠟切片，脫蠟至水； 過(guò)氧化酶阻斷溶液，以阻斷內(nèi)源性過(guò)氧化酶的活性； 第一抗體； 生物素標(biāo)記的第二抗體； 鏈霉菌抗生物蛋白-過(guò)氧化物酶溶液； 顯色、復(fù)染、封片、觀察。,S-P試劑盒包括以下內(nèi)容： A. 內(nèi)源性過(guò)氧化酶阻斷劑 B. 正常動(dòng)物非免疫血清 C. 生物素標(biāo)記的第二抗體 D. 鏈霉菌抗生物素蛋白-過(guò)氧化酶,二、SABC法 鏈霉菌抗生物蛋白與一定濃度的生物素化酶混合后，就能形成鏈霉菌抗生物素-生物素-酶復(fù)合物(SABC)。,SABC試劑盒包括以下內(nèi)容： 正常動(dòng)物血清 生物素化二抗 SABC復(fù)合物,SABC具有以下特點(diǎn)： 高敏感性 低背景 簡(jiǎn)便快速 結(jié)果穩(wěn)定,第六節(jié) 免疫金技術(shù)（膠體金）,1971年，F(xiàn)aulk和Taylor首先將兔抗沙門氏菌抗血清與膠體金顆粒結(jié)合，用直接免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù)檢測(cè)沙門氏菌的表面抗原。 膠體金技術(shù)逐漸得到完善和成熟，應(yīng)用膠體金為標(biāo)記物的免疫金染色（IGS）與免疫金銀染色（IGSS）方法在光鏡和電鏡下可以單標(biāo)記和雙標(biāo)記或多種標(biāo)記同時(shí)觀察細(xì)胞和組織結(jié)構(gòu)，可以定性、定位、定量研究。,一、基本原理 膠體金即金的水溶液 分散體系：分散相 + 分散介質(zhì) 離子分散體系：以小分子或離子狀態(tài)分散 膠體分散體系：分散相顆粒1100nm 粗分散體系：,二、膠體金的一般性狀 1. 膠體金的顏色 膠體金顆粒在520nm之間，吸收波長(zhǎng)520nm，呈葡萄酒紅色 2040nm之間，吸收波長(zhǎng)530nm，呈深紅色 60nm，吸收波長(zhǎng)600nm，呈蘭紫色,2. 膠體金的穩(wěn)定性 溶液的穩(wěn)定性介于小分子離子溶液和粗分散系之間，溶膠的膠顆粒作布朗運(yùn)動(dòng)，不易受重力影響而下沉。然而溶膠又是不穩(wěn)定體系，它的膠粒溶劑化作用很弱，總表面積表大，當(dāng)膠粒相互碰撞時(shí)，有自動(dòng)合并為較大、較重的顆粒的傾向。,三、在免疫細(xì)胞化學(xué)中的應(yīng)用 （一）免疫金染色 1. 免疫金法 1978年，Geoghegan等首次應(yīng)用免疫金探針檢測(cè)B淋巴細(xì)胞表面抗原，建立了光鏡水平的免疫金法（immunogold staining, IGS）,間接法：（以人肝組織HBsAg的定位為例） 石蠟切片脫蠟至水； 鼠抗HBsAg單克隆抗體（一抗），4過(guò)夜 金標(biāo)兔抗鼠抗體（二抗） ， 37，45min ( 可以金標(biāo)SPA代替) 復(fù)染（蘇木素）、封片、觀察、記錄,2. 蛋白A-膠體金（ PAG）放大法（以5-HT定位為例） 石蠟切片脫蠟至水； 兔抗5-HT抗體，4過(guò)夜，或 37 1 h PAG 37 1 h 抗A蛋白抗體， 45min，37 PAG， 37， 45min 復(fù)染、封片、觀察、記錄,PAG放大法的優(yōu)點(diǎn)： 使用試劑單一； 可大大提高IGS的敏感性，從而使應(yīng)用IGS方法定位抗原時(shí)使用高稀釋度的抗體成為可能； 背景干凈。,（二）免疫金銀法 將IGS與銀顯影方法相結(jié)合創(chuàng)立了免疫金銀法（ immunogold-silver staining, IGSS）,基本原理： 膠體金顆粒起著一種催化劑作用，用對(duì)苯二酚還原劑將銀離子（Ag+）還原成銀原子(Ago)，被還原的銀原子圍繞金顆粒形成一個(gè)“銀殼”，“銀殼”一旦形成本身亦具有催化作用，從而使更多銀離子還原并促使“銀殼”越長(zhǎng)越大，最終抗原位置得到清楚放大。,以人肝細(xì)胞內(nèi)HBsAg定位為例 石蠟切片脫蠟至水； 馬抗HBsAg抗體，4過(guò)夜或37，12h PAG，37，45min 銀顯影 復(fù)染（蘇木素）、封片、觀察、記錄,四、優(yōu)點(diǎn) 1. 制備簡(jiǎn)單； 2. 標(biāo)記簡(jiǎn)單：抗體、SPA、酶可通過(guò)物理吸附作用與膠體金顆粒形成穩(wěn)定的金標(biāo)復(fù)合物； 3. 適用范圍廣：光鏡、透射電鏡、掃描電鏡、X線能譜分析等。 4. 特異性強(qiáng)：免疫金探針的非特異性吸附作用小，特異性高。,5. 敏感性高：用于電鏡，其檢測(cè)抗原或抗體的效率遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過(guò)酶反應(yīng)物，大大改進(jìn)了免疫組化在電鏡水平上的分辯率。光鏡金顆粒經(jīng)過(guò)銀顯影后得到放大，敏感性比PAP法高200倍，比ABC法高6倍，是迄今為止最為敏感的免疫細(xì)胞化學(xué)方法，特別適用于檢測(cè)微量抗原及石蠟切片標(biāo)本中的微弱抗原。,雙標(biāo)記及多重標(biāo)記：膠體金制備成不同大小的顆粒，分別標(biāo)記不同的抗原或抗體。,第七節(jié) 半抗原交聯(lián)抗體法,近年來(lái)，為提高敏感性和減低非特異性染色，在常規(guī)免疫組化技術(shù)的基礎(chǔ)上，發(fā)展了半抗原交聯(lián)抗體法（hapten-coupled technique），可作免疫酶或免疫熒光染色。,基本原理：半抗原標(biāo)記第一抗體 半抗原：阿散酸（對(duì)氨基苯砷酸）、對(duì)氨基苯酰甘氨酸、亞對(duì)氨苯酰甘氨酸、二硝基苯氨基丙睛亞胺酸脂（DNP），通過(guò)酰胺化反應(yīng)把半抗原結(jié)合到抗體分子上。,操作程序： 間接法（二步法）： 石蠟切片脫蠟至水； 半抗原標(biāo)記的特異性抗體（一抗）； 熒光素或酶標(biāo)記的抗半抗原抗體 ； 熒光顯微鏡觀察，或加底物顯色。,優(yōu)點(diǎn)： 1. 敏感性高：由于本法是通過(guò)酰胺化反應(yīng)標(biāo)記半抗原，對(duì)抗體活性損失極小，抗體保留較高的活性，能結(jié)合大量半抗原，平均每個(gè)球蛋白分子可同時(shí)結(jié)合20個(gè)半抗原分子，每個(gè)半抗原又可與抗半抗原抗體相結(jié)合，特異性免疫反應(yīng)明顯放大，其敏感性明顯高于常規(guī)的免疫酶和免疫熒光染色技術(shù)，特別有助于發(fā)現(xiàn)滴度低的同種抗血清和含抗原量較少的組織。,2. 可用于雙重免疫染色：利用兩種無(wú)交叉反應(yīng)的半抗原（如阿散酸、對(duì)氨基苯酰甘氨酸）分別標(biāo)記來(lái)自同一種動(dòng)物的兩種特異性第一抗體，即可在同一張切片內(nèi)同時(shí)顯示兩種不同的抗原。 3. 特異性強(qiáng)，敏感性高，背景染色低。,第八節(jié) 多聚螯合物酶法,多聚螯合物酶二步法，也稱非生物素檢測(cè)系統(tǒng)，與簡(jiǎn)單的二步法相比，具有敏感性和特異性高、穩(wěn)定性好的優(yōu)點(diǎn)。,一、EnVision System ( DAKO ) EnVision System是將二抗和酶通過(guò)一個(gè)多聚化合物（葡聚糖）骨架聯(lián)接成一個(gè)多聚體（即 EnVision ），每一個(gè)分子的復(fù)合物中約含70個(gè)分子的POD和10個(gè)分子的第二抗體，復(fù)合物中的POD的絕對(duì)數(shù)量遠(yuǎn)高于其他復(fù)合物，直接放大信號(hào) 4050倍，把傳統(tǒng)的二抗、三抗分別孵育合為一次孵育。同時(shí)，人體內(nèi)不存在該多聚化合物，無(wú)特異性干擾，故背景染色淺。,EnVision System工作程序： 1. 脫蠟、水化組織切片； 2. 一抗孵育 1030min; 3. PBS漂洗; 4. EnVision TM孵育1030min; 5. PBS漂洗 6. 顯色、復(fù)染、封片。,特點(diǎn)： 敏感 省時(shí) 方便 背景低 （避免了內(nèi)源性生物素干擾）,二. PowerVisionTM二步法: 是美國(guó)PowerVision公司推出的產(chǎn)品，其檢測(cè)效率高于En Vision法。,三. EPOS法 EPOS法（enhanced ploymer one-stop staining）是DAKO公司近年來(lái)推出的一步染色法。原理是采用一種惰性的多聚化合物（葡聚糖）為骨架，將特異性抗體（一抗）和POD結(jié)合在一起，形成POD-多聚化合物-特異性抗體巨大復(fù)合物。復(fù)合物內(nèi)不含第二抗體及親和素。,EPOS法操作程序： 1. 石蠟切片常規(guī)脫蠟至水; 2. Dako EPOS/POD試劑，孵育3060min; 3. PBS漂洗 3min 3次; 4. 顯色、復(fù)染、封片。,四. UIP法 UIP（universal immuno-enzyme polymer）法，其原理是以氨基酸類為骨架，形成POD-氨基酸-二抗復(fù)合物（N-Histofine復(fù)合物）。由于多聚物中有N末端暴露，形成的電荷能與組織發(fā)生靜電吸附，可造成非特異性染色，染色時(shí)需平衡靜電荷。,第九節(jié) 組織芯片技術(shù),組織芯片又稱組織微陣列，是生物芯片的一種，將數(shù)十種、上百種甚至上千種的不同組織點(diǎn)在一張固體載體（通常是載玻片）?？梢园凑詹煌男枨笤O(shè)計(jì)組織排列，具有高通量、可比性強(qiáng)、節(jié)約大量成本的優(yōu)點(diǎn)，減少了實(shí)驗(yàn)誤差，尤其適用于大樣本的研究。對(duì)研究疾病不同病理發(fā)展階段各基因表達(dá)的動(dòng)態(tài)變化、相關(guān)基因驗(yàn)證、治療靶點(diǎn)的定位、抗體和藥物的篩選等均有重大的使用價(jià)值。,組織芯片的制備： 1. 芯片的設(shè)計(jì)； 2. 根據(jù)設(shè)計(jì)將載體蠟塊打孔； 3. 觀察組織切片，在供體蠟塊上準(zhǔn)確標(biāo)記所需要的靶點(diǎn)； 4. 利用打孔儀鉆取靶點(diǎn)組織，并轉(zhuǎn)移至載體蠟塊相應(yīng)的孔位上，制成所需要的陣列蠟塊； 5. 常規(guī)切片。,第十節(jié) 原位雜交免疫組織化學(xué) （in situ hybridization histochemistry, ISHH）,分子雜交： 液相核酸分子雜交：在溶液中進(jìn)行，通過(guò)平衡密度梯度離心分離雜交體。 固相核酸分子雜交：斑點(diǎn)雜交 Southern 印跡雜交 Northern印跡雜交 原位分子雜交,一、原位雜交技術(shù)的發(fā)展 1970年，國(guó)外有學(xué)者利用同位素標(biāo)記核酸探針進(jìn)行細(xì)胞或組織的基因定位，從而開(kāi)創(chuàng)了原位雜交技術(shù)。 熒光素標(biāo)記探針進(jìn)行原位雜交 熒光顯微鏡觀察 2,4二硝基苯甲酸（DNP）標(biāo)記DNA探針，再結(jié)合酶標(biāo)記抗DNP抗體（分子雜交 + 免疫組化技術(shù)） 地高辛標(biāo)記探針 生物素標(biāo)記探針 + ABC法,核酸探針?lè)诸悾?1. 放射性探針 非放射性探針 2. DNA探針、RNA探針 cDNA探針、cRNA探針 寡核苷酸探針,原位分子雜交在近20年的發(fā)展可以說(shuō)是飛躍的，在生命科學(xué)的研究中可視為一項(xiàng)革命性的技術(shù)，它使我們的研究從器官、組織和細(xì)胞水平走向分子水平，為各個(gè)學(xué)科的研究帶來(lái)突破性進(jìn)展。,二、原位雜交技術(shù)的基本方法 雜交前準(zhǔn)備：包括固定、取材、玻片和組織的處理（增強(qiáng)核酸探針的穿透性，減低背景染色等） 雜交 雜交后處理 顯示：包括放射性自顯影和非放射性標(biāo)記的顯色。,1. 固定 要兼顧到三個(gè)方面： 保持細(xì)胞結(jié)構(gòu)； 最大限度地保持細(xì)胞內(nèi)DNA或RNA水平； 使探針易于進(jìn)入細(xì)胞或組織。,對(duì)于DNA來(lái)說(shuō)，固定劑的種類和濃度并不十分重要。相反，在RNA的定位上，要使RNA的降解減少到最低水平。所以，不僅固定劑的種類、濃度和時(shí)間十分重要，而且取材后應(yīng)盡快冷凍或固定。,固定劑： 4%多聚甲醛 10%中性緩沖福爾馬林,2. 玻片和組織切片的處理 玻片的處理： 蓋玻片、載玻片 清潔液中浸泡24h（硫酸 + 重鉻酸鉀） 清水沖洗 蒸餾水沖洗 95%酒精浸泡24h 烘干（150，以去除任何RNA酶）,由于原位雜交的實(shí)驗(yàn)周期較長(zhǎng)，實(shí)驗(yàn)程序繁雜。因此，要應(yīng)用粘附劑預(yù)先涂沫在玻片上，常用的粘附劑有3-amino propy eriethoxy silame(APES)和多聚賴氨酸。,增強(qiáng)組織的通透性和核酸探針的穿透性： 稀釋的酸洗滌，Triton X-100，酒精或某些消化酶（胃蛋白酶、胰蛋白酶、膠原蛋白酶和淀粉酶等）。常用蛋白酶K，1g/ml，37，孵育15-20 min，然后應(yīng)用0.1 mol/L 的甘氨酸溶液清洗以終止蛋白酶K的消化作用。 4%多聚甲醛后固定 20 min。, 減低背景染色： 預(yù)雜交：預(yù)雜交液和雜交液的區(qū)別在于前者不含探針和硫酸葡聚糖。將組織切片浸入預(yù)雜交液中可達(dá)到封閉非特異性雜交點(diǎn)的目的，從而減低背景染色。 42 30min, 防止RNA酶的污染： 戴消毒手套 高溫（240）烘烤 雜交前及雜交時(shí)所應(yīng)的溶液均需 經(jīng)高壓消毒處理,3. 雜交 核酸探針進(jìn)入細(xì)胞或組織與其內(nèi)靶核苷酸結(jié)合，雜交是原位雜交技術(shù)的關(guān)鍵的一步。 雜交是將雜交液滴于切片的組織上，加蓋硅化的蓋玻片，也可不加蓋玻片。, 探針的濃度：0.5-5.0g/ml，一般應(yīng)用1-2g/ml。雜交液的量要適當(dāng)，以10-20l/每張切片為宜。 探針的長(zhǎng)度：50-100個(gè)堿基之間。探針短，易進(jìn)入細(xì)胞，雜交率高，雜交時(shí)間短。, 雜交的溫度和時(shí)間：解鏈溫度（融解溫度）Tm：DNA探針90，RNA探針95。加30-50%甲酰胺于雜交液中，降低Tm。1%甲酰胺，Tm可降低0.72。原位雜交的溫度在Tm-25左右，即比Tm降低25，大約在30-60之間。,DNA探針或細(xì)胞內(nèi)靶核苷酸為DNA，則必須在80-95加熱使其變性，時(shí)間5-15 min。然后在冰上擱置1 min ，使之迅速冷卻，以防復(fù)性，再置入濕盒內(nèi)，37-42孵育雜交16-20h。, 硫酸萄聚糖和甲酰胺 硫酸萄聚糖的主要作用是促進(jìn)雜交率。 甲酰胺的主要作用是調(diào)節(jié)雜交反應(yīng)溫度。,4. 雜交后處理： 雜交后有非特異性探針片段粘附在組織切片上，從而增加了背景染色。應(yīng)用系列不同濃度、不同溫度的鹽溶液漂洗。 2 SSC（Standard Saline Citrate） 0.1 SSC,5. 顯示（檢測(cè)系統(tǒng)） 同位素標(biāo)記：放射自顯影 銀顆粒 酶標(biāo)記：堿性磷酸酶（過(guò)氧化物酶） 底物：四氮唑藍(lán)（NBT） 5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸鹽（BCIP） 30l/每張切片，置暗處顯色30 min 2 h， 產(chǎn)物紫藍(lán)色（棕紅色）,6. 對(duì)照實(shí)驗(yàn) 以不加核酸探針雜交液進(jìn)行雜交 將切片應(yīng)用RNA酶或DNA酶進(jìn)行預(yù)處理后雜交,ISHH是最大優(yōu)點(diǎn)是它的高度特異性，可測(cè)定組織、培養(yǎng)的單個(gè)細(xì)胞或細(xì)胞提取物中的核苷酸含量。,三、DNA探針在原位雜交中的應(yīng)用 Dig標(biāo)記DNA探針在石蠟包埋切片檢測(cè)病毒DNA中的應(yīng)用。 1. 組織前處理 固定 脫蠟 蛋白酶K 甘氨酸液 4%多聚甲醛后固定,2. 預(yù)雜交 封閉非特異性雜交位點(diǎn)，20l/每張切片，42 30min 3. 雜交 10-20l/每張切片，將切片置于95 10 min，使探針及病毒DNA變性，然后迅速置于冰上1 min，然后將切片置于盛有2SSC濕盒內(nèi)，42 16-18 h,4. 雜交后漂洗 酶標(biāo)（AP）抗地高辛抗體 37 30 min 5. 顯色：NBT + BCIP,四、原位雜交與免疫組織化學(xué)結(jié)合法 可在同一張切片或兩個(gè)相鄰的切片進(jìn)行染色，這樣就可在同一細(xì)胞中顯示某種mRNA和相應(yīng)的蛋白、多肽或其它抗原，從而可更好地了解某一基因的轉(zhuǎn)錄和蛋白、多肽合成的動(dòng)力學(xué)。,可在相鄰切片上分別進(jìn)行原位雜交和免疫組化，也可先后在同一切片上進(jìn)行原位雜交和免疫組化，往往首先進(jìn)行原位雜交，然后進(jìn)行免疫組化。,堿性磷酸酶標(biāo)記的抗地高辛抗體是經(jīng)木瓜蛋白酶處理的，只有抗體的Fab段，沒(méi)有Fc段。而免疫組化應(yīng)用的抗體即有Fab段，又有Fc段。由于抗體的這一特性，可在原位雜交和免疫組化孵育時(shí)將檢測(cè)核酸的抗地高辛抗體Fab段與檢測(cè)蛋白、多肽的兔抗血清混合在一起，一同孵育切片。 產(chǎn)物：藍(lán)色，棕色,第十一節(jié) 細(xì)胞凋亡檢測(cè)方法,一、細(xì)胞凋亡的研究方法 光鏡或電鏡形態(tài)學(xué)觀察 細(xì)胞DNA提取物的DNA Ladder電泳實(shí)驗(yàn) 凋亡細(xì)胞DNA斷裂點(diǎn)的原位標(biāo)記實(shí)驗(yàn)（TUNEL） 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè) 有關(guān)凋亡相關(guān)基因表達(dá)測(cè)定（原位分子雜交、免疫組化）,TUNEL 末端轉(zhuǎn)移酶（TdT）介導(dǎo)的dUTP缺口末端標(biāo)記（Terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated dUTP nick end-labling，）是檢測(cè)細(xì)胞凋亡較常用的方法,其主要原理為： 細(xì)胞凋亡中DNA斷裂是內(nèi)切酶的作用，其斷端3-OH暴露，這是凋亡細(xì)胞DNA斷裂的特征，以此區(qū)別細(xì)胞壞死DNA斷裂。 TdT是一種DNA修飾酶，它可以催化DNA斷裂點(diǎn)的3-OH末端合成多核苷酸聚合物，即DNA片斷加尾。在此反應(yīng)中，帶有地高辛、生物素、熒光素等標(biāo)記物的單核苷酸可以被摻入到加尾聚合物中，完成對(duì)斷裂點(diǎn)的標(biāo)記。,TUNEL是一種將生化技術(shù)與免疫組化相結(jié)合，在組織切片或細(xì)胞涂片上顯示細(xì)胞凋亡的新技術(shù)。由于不需要模板，每一標(biāo)記處平均摻入4個(gè)左右的標(biāo)記dUTP，因此敏感性較高。,操作程序（以熒光素-dUTP為例 POD TdT 3-OH端標(biāo)記） 1. 石蠟切片，二甲苯脫蠟至水 2. 0.3%甲醛配H2O2處理，消除內(nèi)源性過(guò)氧