微生物藥物學--微生物資源與微生物新藥發(fā)現(xiàn)

第三章 微生物資源的多樣性與微生物新藥的發(fā)現(xiàn),第一節(jié) 稀有放線菌是產(chǎn)生微生物新藥的重 要源泉 第二節(jié) 黏細菌是一類值得關注的微生物新 資源 第三節(jié) 從植物內生菌中篩選微生物新藥 第四節(jié) 從海洋微生物中篩選微生物新藥,第一節(jié) 稀有放線菌是產(chǎn)生微生物 新藥的重要源泉,所謂的稀有放線菌 （rare actinomycetes)即為除鏈霉菌屬外的其它屬的放線菌。,稀有放線菌是產(chǎn)生微生物 新藥的重要源泉,到1974年止，放線菌來源的抗生素幾乎都是由鏈霉菌屬產(chǎn)生的（約占2000種抗生素中的95%）。但在隨后6年的報導中，由放線菌產(chǎn)生的僅占25%。事實證明，稀有放線菌是發(fā)現(xiàn)新抗生素的極好來源，且它們產(chǎn)生各種不同抗生素的能力不亞于鏈霉菌屬。同樣，細菌和霉菌也仍是產(chǎn)生新的生理活性物質的源泉，特別是近年來從霉菌的代謝產(chǎn)物中發(fā)現(xiàn)新的生理活性物質的數(shù)目正在不斷增加。,小單孢菌能產(chǎn)生獨特化學結構的生物活性物質,能產(chǎn)生獨特化學結構的生物活性物質。近年來從小單孢菌中發(fā)現(xiàn)了引人注目的結構新穎的烯二炔類抗腫瘤抗生素calicheamicin1（結構如圖所示），由棘孢小單孢菌.echinosporaspcalichensis所產(chǎn)生，與腫瘤細胞作用時,分子中烯二炔部分起“分子核彈頭”作用，三巰基部分起“扳機”作用，寡糖部分起“識別”作用，能選擇性地結合并切除雙鏈中的特定片段，如、和。,Calicheamicin1的化學結構,小單孢菌能產(chǎn)生獨特化學結構的生物活性物質,碳黑小單孢菌.carbonacea產(chǎn)生強效的抗耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（MRSA）的寡糖類抗生素ziracin(如圖3 所示)。它對甲氧西林和萬古霉素耐藥菌作用很強。對甲氧西林敏感和耐藥的肺炎鏈球菌的為00320125/，對青霉素耐藥菌的為01258/，對萬古霉素敏感和耐藥菌的為0452/。50為25/。靜注劑量1/的血濃度為10/。雖已進入期臨床試驗，但沒有獲得批準。除產(chǎn)生抗生素外，小單孢菌還產(chǎn)生許多非抗生素的生物活性物質。,Ziracin的化學結構,游動放線菌(Actinoplane sp.)ATCC 3076產(chǎn)生的抗細菌抗生素雷莫拉寧。,黏細菌 一類值得關注的微生物新資源,Epothilons是由粘細菌纖維束菌(Sorangium cellosum)產(chǎn)生的新型細胞毒化合物。它是一種新的16元環(huán)多酮大環(huán)內酯,含有一個噻唑基和環(huán)上的一個環(huán)氧結構(結構如圖所示)。該菌產(chǎn)生和兩種主要組分、四種次要組分以及36種極微量成分。,Epothilons的化學結構,從植物內生菌中篩選微生物新藥,要利用植物內生菌這一資源豐富的寶庫，首先要將內生菌從植物中有效地分離出來，然后應用分離色譜層析等生物分析方法從內生菌培養(yǎng)物濾液中分離并鑒定出令人感興趣的生物活性物質，如：紫杉醇、cryptocin、oocyclin、isopestacin、pseudomycin和ambuic acid等。本文主要闡述了植物內生菌分離的一般規(guī)則，其生物活性代謝產(chǎn)物的最新研究進展，以期讀者對植物內生菌的重要性有更深刻的認識。,天然藥物的篩選已成為現(xiàn)今的一個研究熱點，植物是天然藥物的主要來源之一。生活在植物組織中的植物內生菌，由于其與植物的關系密切，同時其產(chǎn)生的豐富多樣的次生代謝產(chǎn)物具有多種生物活性，因此從中發(fā)現(xiàn)新的有意義的化合物的潛力相當大，其作為新的治療藥物或前體藥物的潛在來源已經(jīng)引起人們的廣泛重視。,一、歷史概況,1898年 Vogl從黑麥草的種子中首次分離出第一株內生真菌。 但在此后的70年間，內生菌的研究進展緩慢；直到70年代，Bacon等人發(fā)現(xiàn)高羊茅中的內生真菌和毒素的產(chǎn)生有關， 從此以后植物內生菌的研究在國際范圍內引起了廣泛的重視。,二、植物內生菌,目前較常用的寬泛實用性概念：,植物內生菌是指那些在其生活史的一定階段或全部階段生活于健康植物的各種組織和器官內部的真菌和細菌，被感染的宿主植物（至少是暫時）不表現(xiàn)出外在病癥， 可通過組織學方法或從嚴格表面消毒的植物組織中分離或從植物組織內直接擴增出微生物DNA的方法來證明其內生。即我們可以把植物內生菌理解為植物組織內的正常菌群，它們不僅包括了互惠共利的和中性的內共生微生物，也包括了那些潛伏的宿主體內的病原微生物。,三、植物內生菌的生物多樣性,宿主植物種類多樣性 內生菌自身種類多樣性 內生菌在植物組織中分布多樣性,內生菌普遍存在于目前已研究過的各種陸生及水生植物中。目前全世界至少已在80個屬290多種禾本科植物中發(fā)現(xiàn)有內生真菌。自20世紀70年代后期， 內生菌在一些重要的經(jīng)濟林木如針葉類的各種冷杉、云衫、紅杉、紫杉、松柏等以及闊葉的桉樹、櫟樹、樺樹、榿木等植物樹皮、枝葉中相繼被發(fā)現(xiàn)并得到了廣泛的研究。進而在多種灌木、草本植物以及栽培作物、果樹甚至藻類、苔蘚和蕨類植物中也發(fā)現(xiàn)了內生菌。,對于一種植物而言，從中可分離到的內生真菌和細菌通常為數(shù)種至數(shù)十種，有的甚至多達數(shù)百種。在熱帶雨林植物中，內生菌的多樣性更為突出。 例如：Anorld等人最近分析了巴拿馬中部雨林中兩種植物葉子中的內生菌，結果發(fā)現(xiàn)分離自83片健康葉子上的內生菌可多達418個形態(tài)學種,主要內生真菌,子囊孢子類：核菌綱 盤菌綱 腔菌綱 廣泛分布的種屬：半殼霉屬 擬隱孢霉屬 擬莖點霉屬 葉點霉屬,常見內生細菌,大多數(shù)為土壤微生物類群： 假單孢菌屬 芽孢桿菌屬 腸桿菌屬 土壤桿菌屬,內生真菌的菌絲生長于植物組織的細胞間，分布于葉鞘、種子、花、莖、葉片和根。其中葉鞘和種子的菌絲含量最多而葉片和根的含量極微。,四、植物內生菌的作用,促進宿主植物的生長 增強宿主植物的抗逆性 產(chǎn)生具有生理活性的代謝產(chǎn)物,內生菌能產(chǎn)生IAA等植物生長激素 內生菌增強宿主植物對氮、磷等營養(yǎng)元素的吸收 如：禾本科農(nóng)作物上的內生細菌具有很強的固氮能力。感染內生真菌的牧草對氮、磷的攝取能力也有所提高。,感染內生菌的宿主植物對環(huán)境具有很強的抗逆性，如抗干旱、抗病原細菌和真菌、抗線蟲、阻抑昆蟲和食草動物的采食等。,在內生菌中，有對宿主植物體內某些活性成分的形成有重要影響者，也有產(chǎn)生和宿主植物相同或相似的生理活性成分。,五、植物內生菌產(chǎn)生的生理活性物質,抗生素類物質 抗腫瘤活性物質 植物生長調節(jié)物質 殺昆蟲物質 其他類型的活性產(chǎn)物,1.抗生素類物質,隨著細菌耐藥性的出現(xiàn)激發(fā)了人們尋求更多更好的抗菌素；同時，由于艾滋病和器官移植引起的真菌感染人數(shù)不斷增加，對于高效抗真菌制劑的需求也不斷增強；加之目前治療原生動物寄生感染藥物的匱乏，尋找更新更有效的治療藥物來解決這些問題已迫在眉睫。以往，抗生素的主要來源是土壤微生物。而今，植物內生菌這一多樣性十分豐富卻尚未開發(fā)的微生物類群看來是一巨大資源,刺盤孢屬內生菌Colletotrichum gloeosporicoides 產(chǎn)生的Colletotric acid,抗微生物活性,內生菌Colletotrichum sp產(chǎn)生的,6-isopenylindole-3-carboxylic acid,3,5-dihydroxy-6-acetoxy-ergosta-7,22-diene,3,5-dihydroxy-6-phenylacety-loxy-ergosta-7,22-diene,抗微生物活性，對人畜和植物病原真菌和細菌有良好抑制作用,內生真菌Cryptosporiopsis cf. quercina 產(chǎn)生的新型環(huán)肽抗生素cryptocandin,對癬菌及白色念珠菌等人類病原真菌具有強烈抑殺作用其MIC與臨床應用的抗真菌藥amphotericin B相當，具有良好開發(fā)前景,內生真菌Cryptosporiopsis cf. quercina 產(chǎn)生的酰胺類生物堿cryptocin,對稻瘟病菌及其他多種植物病原真菌具有很強的抑殺作用,內生菌Cytonaema sp.產(chǎn)生的 Cytonic Acid A (1) 和 Cytonic Acid B (2),抑制人細胞肥大病毒組裝,鐮孢霉屬內生真菌Fusarium sp. CR377產(chǎn)生的一種新型的酮內酯（pentaketide）化合物,對白色念珠菌有較強活性,內生真菌Fungus CR115 產(chǎn)生的一個二萜化合物Guanacastepene A,對多種革蘭氏陽性和陰性細菌和白色念珠菌有活性,內生菌Geniculosporium sp.產(chǎn)生的 Geniculol (1) 和 Cytochalsin F (2),殺藻劑,內生真菌Pestalotiopsis jesteri 產(chǎn)生的新的環(huán)己烯酮環(huán)氧化合物Jesterone,對引起大多數(shù)植物致病的致病真菌有選擇性活性,內生菌Pestalotiopsis microspora 產(chǎn)生的Ambuic acid,抗真菌劑,內生菌Phoma sp. NRRL 2 5697 產(chǎn)生的5種新的化合物Pginadecakubs A-D (1-4) & Pginaoebtebibe A (5) 具有抗革蘭氏陽性菌活性,擬點霉屬內生菌Phomopsis sp.產(chǎn)生的 Phomoxanthones A (1) & B (2)是兩個新的氧雜蒽酮二聚體,具有顯著的抗瘧疾和抗結核活性,分離自錫蘭桂小枝的內生菌Muscodor，其所釋放的揮發(fā)性物質（醇，酯，酮，酸和脂）對人及植物的致病真菌和細菌有很強的殺傷性 。,分離自歐洲紫杉（Taxus baccata）的內生真菌Acremonium sp.產(chǎn)生的白灰制菌素A具有抗真菌活性。,分離自歐洲杜松（Juniperus communis）的內生真菌Hormonema，從其發(fā)酵液中分離出一種新的三萜糖苷對念珠菌屬和曲霉屬的真菌具有很強的活性,2.抗腫瘤活性物質,1） 紫杉醇（Taxol） 紫杉醇是一種以極低含量存在于各種紫杉屬植物樹皮和樹葉中的萜類化合物，臨床上是治療乳腺癌、子宮癌和卵巢癌的良效藥物，自1992年投入市場以來，取得了臨床療效和市場效應的極大成功。,Taxol,1993年美國學者Stierle等人首次從短葉紫杉（Taxus brevifolia）的樹皮中分離出一株內生的真菌新種Taxomyces andreanae，在培養(yǎng)液種能產(chǎn)生紫杉醇和其他紫杉烷類化合物。,至今已在短葉紫杉、喜馬拉雅紅豆衫、歐洲紅豆衫、南方紅豆衫、云南紅豆衫、落羽衫、榧樹中分離到了許多種能產(chǎn)生紫杉醇的內生真菌和放線菌。其中內生真菌微孢擬盤多毛孢的紫杉醇產(chǎn)量已初步顯示出其商業(yè)潛力。,一些能夠產(chǎn)生紫杉醇類物質的植物內生菌及其植物宿主,這些發(fā)現(xiàn)為人類突破植物資源周期長、不可再生等限制，利用植物內生菌來工業(yè)化發(fā)酵生產(chǎn)重要植物藥物提供了新的思路。,2）ras法呢基轉移酶抑制物,抑制法呢基蛋白轉移酶（FPTase）或ras法呢基轉移酶的化合物往往具有抗腫瘤活性。,A. Lingham RB等曾報道毛殼屬內生真菌Chaetomella acutisea產(chǎn)生的長鏈脂肪酸Chaetomellic acid A和B以及從一種小檗葉的某種內生真菌中發(fā)現(xiàn)的天然產(chǎn)物oreganic acid可選擇性抑制法尼基蛋白轉移酶（FPTase），具有抗癌活性。,B. Ishii T等報道，從Phoma sp.中分離得到的一種生物堿TAN1813可抑制鼠腦ras法尼基轉移酶，對各種人體腫瘤細胞的增殖也有抑制作用，并可引起NIH3T3/kras細胞形態(tài)的改變。 此外，內生菌Coniothyrium sp.產(chǎn)生的醌類化合物對ras法呢基轉移酶也具有很高的抑制活性。,3）植物黃酮類物質,植物中的一些黃酮類物質，如香豆素，異香豆素等，具有綜合的抗癌活性，在分離自加拿大Cirsium arvense的一個內生真菌Mycelia sterila的發(fā)酵液提取物中發(fā)現(xiàn)了新的異香豆素。從中國南海紅樹嫩葉分離出來的內生真菌No.2533，其發(fā)酵液提取物分離出2種新的異香豆素類化合物enalin A和B，均具有抗癌活性。,4）生物堿類,從來源于傳統(tǒng)藥用植物雷公藤的內生真菌Rhinocladiella sp. 中發(fā)現(xiàn)了三種新生物堿，實驗結果表明它們對多種人腫瘤細胞有很強的抑制作用,此外，從Ficus microcarpa L的樹皮中分離到的一株未鑒定的內生菌的發(fā)酵液中分離到一種新的生物堿nomofungin，該化合物能干擾培養(yǎng)的哺乳類細胞微絲并且對于Lo Vo和KB細胞有輕微的毒性，是一種新型的微絲干擾劑,5）其它,Brady SE等通過BIA法從一株內生真菌分離到具有抗癌活性的二蒽醌類化合物cytoskyrin A。 Huang Y等也使用MTT法從三種藥用植物中篩選具有抗癌活性的植物內生真菌。這些結果表明植物內生真菌是新的抗癌藥物或前體的重要來源。,已有多篇文章報道內生真菌可產(chǎn)生植物生長激素物質,如：Mcinroy等人從玉米、棉花上分離到具有促進植物生長的內生細菌。 從柑橘屬果樹中分離出來的Penicillium. Italicum也能產(chǎn)赤霉素（GA）。 在對5種從藥用植物中分離到的內生菌進行研究時發(fā)現(xiàn)，它們各自的發(fā)酵液中都含有至少一種植物激素：GA，IAA，ABS（Abscisic acid），Z（Zeatin），ZR（Zeatin riboside）,這些由內生真菌產(chǎn)生的植物激素是揭示內生真菌促進藥用植物生長機制的重要物質,禾本科植物內生真菌能產(chǎn)生4大類 即： 有機胺類（peramine） 吡咯里西啶類（loline） 吲哚二萜衍生物類（lolitrem B） 麥角堿類（ergovaline） 多達十種的生物堿，這些生物堿具有抗病原菌，抗線蟲，增強植物他感作用等多種生物學活性，其中大多數(shù)對食草昆蟲乃至哺乳動物（牛、羊）具較強的毒性。,從內生菌感染的一種草熟禾中分離到數(shù)個對蚊子幼蟲有毒性的黃酮類化合物。 從云杉等針葉樹的內生真菌的次生代謝產(chǎn)物中，F(xiàn)indlay等人發(fā)現(xiàn)了一系列具抗蟲活性的物質。,雷公藤的內生真菌Fusarium subglutinans產(chǎn)生的2中二萜化合物subgutinol A和B,具有無細胞毒性的免疫抑制作用,subgutinol A,六、前景,從各個層次上深入探討內生菌寄主之間的相互作用，將有助于了解內生菌的生物學本質以及未知生態(tài)學作用 從傳統(tǒng)藥用植物以及一下特殊環(huán)境中植物的內生菌代謝產(chǎn)物中尋找新型活性物質，將繼續(xù)是內生菌研究的主流 分子生物學手段將在內生菌研究的各個方面發(fā)揮重要作用,植物內生菌的生境特殊性決定了其既有理論研究的廣度和深度，又有多方面的應用潛力，是個潛力巨大，尚待開發(fā)的微生物新資源。,第四節(jié) 從海洋微生物中篩選微生物新藥,一、研究背景和現(xiàn)狀 二、海洋微生物的生活習性及其多樣性 三、海洋微生物活性成分的研究及藥物 的開發(fā) 四、海洋微生物藥物研究展望,一、研究背景和現(xiàn)狀, 陸棲微生物的代謝產(chǎn)物，已成為像抗生素這樣生物活性物質的源泉。根據(jù)下列的理由，深信海洋微生物的代謝產(chǎn)物，也是希望之所在。,一、研究背景和現(xiàn)狀,(1) 自然界里，微生物的種類和數(shù)量是明顯地隨著環(huán)境不同而改變。 (2) 微生物代謝產(chǎn)物的生產(chǎn)，會受所使用的培養(yǎng)條件調節(jié)。 (3) 已經(jīng)知道許許多多生物活性物質是通過次級代謝而產(chǎn)生的，也因此將同時產(chǎn)生小量其他的相關物質。如果引進更敏感的測定方法來檢測；更有效的的分離方法來純化；更精密的方法來分析，將能得到新生物活性化合物，即使其在發(fā)酵液里含量甚少。,一、研究背景和現(xiàn)狀,(4) 已經(jīng)知道大多數(shù)生物活性化合物的產(chǎn)生是菌株特異的，而不是分類學上種屬特異的。因此，可以直接培養(yǎng)分離到的菌株以取得新生物活性化合物，而無須先進行菌株分類。 (5) 要成功地發(fā)現(xiàn)新的生物活性物質，用于分離微生物菌株的樣品的采集是一個重要環(huán)節(jié)。近來，樣品采集的設計已為發(fā)現(xiàn)新生物活性化合物作出了重大貢獻。最近，已實現(xiàn)通過肉眼觀察，采集深海海底的樣品。 (6) 最近開發(fā)的在不減壓的情況下分離和培養(yǎng)嗜壓微生物的方法和設備，將對新微生物的生物活性產(chǎn)物的研究作出貢獻。,二、海洋微生物的生活習性 及其多樣性,1、耐鹽性：一般地講，海洋細菌的鹽耐受性使最適宜生長于含2%4%的培養(yǎng)基。從放線菌來說，大多數(shù)海洋鏈霉菌比陸棲鏈霉菌有較廣的鹽而受性(1%7%NaCl)，盡管有一些對小于1%的NaCl仍敏感，和另一些能而受大于7%NaCl。由此可見，某些鏈霉菌的先祖可能來自陸地。,二、海洋微生物的生活習性 及其多樣性,2、耐壓性：靜壓力是深海的很重要的環(huán)境參數(shù)。只有那些嗜壓和耐壓的細菌才能在深海的高靜壓下生存。,二、海洋微生物的生活習性 及其多樣性,3、寄生性：一些完全適應了海洋寄生、處于寄主體內微環(huán)境中的海洋微生物完全可能發(fā)展了非鈉依賴的其它特性。,海洋微生物的種類,關于海洋微生物的種類，目前還無法做出準確的判斷。只知道海洋中的微生物種類可能約為陸生微生物的20倍以上。其中的土著海洋微生物與外來微生物的比例同樣不清楚。,開發(fā)海洋微生物資源的意義, 海洋豐富的微生物資源為新藥發(fā)現(xiàn)提供了多樣的物種基礎，它的開發(fā)將使人類進一步認識自然； 新抗生素由于結構與作用機制可能有別于陸生來源的抗生素，將極大地克服目前的抗藥性，同時為新藥的合成提供新的“母核”； 微生物易于培養(yǎng)、發(fā)酵，可無限再生而無需過度開采野生資源，經(jīng)濟和社會價值較大。,三、海