艾滋病、梅毒和乙肝檢測方法介紹及選擇.ppt

艾滋病、梅毒、乙肝檢測方法介紹及選擇,湖北省疾病預(yù)防控制中心 彭庭海 2014年5月,艾滋病、梅毒、乙肝-概況,母嬰傳播,艾滋?。杭s1535% HIV陽性孕婦會發(fā)生母嬰傳播。90%以上兒童HIV感染者是由母親垂直傳播而感染 。 梅毒：流產(chǎn)、早產(chǎn)、死胎或馬鞍鼻、先天性耳聾等。 乙肝：在我國，人群中40-50%是由母嬰傳播積累而成。,主 要 內(nèi) 容,一.艾滋病實(shí)驗(yàn)室檢測技術(shù) HIV抗體檢測 核酸檢測 CD4+T淋巴細(xì)胞檢測 二.梅毒檢測技術(shù) 顯微鏡檢查法 血清學(xué)檢查法 三.乙肝檢測技術(shù) HBV免疫標(biāo)志物檢測 HBV-DNA,HIV抗體篩查樣品,血清/血漿/全血 濾紙干血斑 唾液 尿液,篩查試劑,國家食品藥品監(jiān)督管理局注冊批準(zhǔn) 有效期內(nèi) 酶聯(lián)免疫試劑應(yīng)批批檢合格 選擇敏感性和特異性高的試劑,篩查方法,酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA） 化學(xué)發(fā)光或免疫熒光試驗(yàn)：采用發(fā)光或熒光底物，用發(fā)光或熒光儀測定結(jié)果。 快速檢測（RT）及其它檢測試驗(yàn) (1)明膠顆粒凝集試驗(yàn)(PA) (2)免疫滲濾試驗(yàn) (3)免疫層析試驗(yàn),(1)酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）,HIV抗體檢測試劑：檢測HIV-1/2抗體 HIV抗原抗體聯(lián)合檢測試劑：可同時檢測血液中HIV-1P24抗原和HIV-1/2抗體 用酶標(biāo)儀測定結(jié)果,四代艾滋病酶聯(lián)免疫試劑比較,第四代,病毒裂解液 重組抗原合成肽 HIV-1 / -2 / -O anti-p24 Ab,IgM / IgG 抗體 HIV-1 / -2 / -O p24 抗原,病毒裂解液 重組抗原合成肽 HIV-1 / -2 / -O anti-p24 抗體,ELISA酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn) ELISA Enzyme linked immuno sorbent assay,+ ve,- ve,陰性對照,陽性對照,陰性,陽性,質(zhì)控,酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）,優(yōu)點(diǎn)：準(zhǔn)確性高、價格低廉、判斷結(jié)果標(biāo)準(zhǔn)客觀、結(jié)果便于記錄和保存 用途：流行病學(xué)監(jiān)測及臨床大量標(biāo)本的檢測,(2)化學(xué)發(fā)光或免疫熒光試驗(yàn),采用發(fā)光或熒光底物 既可檢測抗體，也可聯(lián)合檢測抗原抗體 酶或熒光標(biāo)記的HIV抗原或抗體，加發(fā)光或熒光底物 用發(fā)光儀或熒光儀測定結(jié)果,全血樣品 加50ul樣品于樣品墊中,手指血方法,靜脈血方法,加一滴緩沖液,15分鐘內(nèi)讀取結(jié)果,（3）快速檢測（RT）及其它檢測試驗(yàn),快速檢測（RT）及其它檢測試驗(yàn),優(yōu)點(diǎn):試驗(yàn)簡便快速，適用于應(yīng)急檢測、門診急診檢測。不需專門設(shè)備和人員培訓(xùn),一般可在1030分鐘內(nèi)得出結(jié)果。 缺點(diǎn):肉眼判斷較主觀、價格較貴、結(jié)果不易保存。,HIV抗體篩查檢測流程圖,HIV抗體確證試驗(yàn),確證試驗(yàn)的試劑： 必須是經(jīng)國家食品藥品監(jiān)督管理局注冊批準(zhǔn)、在有效期內(nèi)的試劑。 確證樣品： 可采用血清、血漿、濾紙干血斑 確證試驗(yàn)方法： 免疫印跡試驗(yàn)(WB)、條帶免疫試驗(yàn)(LIATEK HIV)、放射免疫沉淀試驗(yàn)(RIPA)及免疫熒光試驗(yàn)(IFA)。國內(nèi)常用的確證試驗(yàn)方法是WB。,HIV抗體確證實(shí)驗(yàn)結(jié)果,初篩檢測陽性標(biāo)本,兩種篩查試劑,報告陰性,陰性反應(yīng),一陰一陽,陽性反應(yīng),確證試劑,復(fù)檢試驗(yàn),根據(jù)具體情況進(jìn)一步 檢測HIV-2,報告陰性,出現(xiàn)HIV-2指示條帶,陰性反應(yīng),不確定反應(yīng),報告HIV-1 陽性,HIV-1 陽性反應(yīng),結(jié)合流行病學(xué)資料，可以在4周后隨訪檢測，如帶型沒有進(jìn)展或呈陰性反應(yīng)， 則報告陰性；如隨訪期間出現(xiàn)陽性反應(yīng)，則報告陽性；如隨訪期間帶型有進(jìn)展， 但不滿足陽性標(biāo)準(zhǔn)，應(yīng)繼續(xù)隨訪到8周。如帶型沒有進(jìn)展或呈陰性反應(yīng)則報告 陰性；滿足HIV抗體陽性診斷標(biāo)準(zhǔn)則報告陽性，不滿足陽性判斷標(biāo)準(zhǔn)可視情況 決定是否繼續(xù)隨訪。,HIV抗體確證檢測流程圖,產(chǎn)時艾滋病抗體檢測及服務(wù)流程,實(shí)驗(yàn)室需備有： 12種HIV-1/2抗體ELISA（化學(xué)發(fā)光）試劑 2種HIV-1/2抗體快速試劑 百度“HIV抗體試劑臨床評估”,HIV抗體 母親 HIV 抗體經(jīng)胎盤進(jìn)入胎兒，出生時新生兒和嬰兒早期抗體陽性，不一定是感染 出生時母親的抗體，8090% 在生后 912 個月消失，出生后 18 個月基本上全部消失 18 個月后兒童 HIV抗體仍然陽性，視為自身感染產(chǎn)生的抗體,18個月以下嬰幼兒的HIV診斷,嬰幼兒HIV感染的抗體檢測,適用于： HIV感染產(chǎn)婦所生嬰幼兒； 母親HIV感染狀態(tài)不詳，兒童出現(xiàn)HIV相關(guān)臨床表現(xiàn)，臨床懷疑HIV感染的兒童。 嬰兒12個月時進(jìn)行HIV抗體檢測 陰性排除感染，納入正常兒童保?。?陽性者繼續(xù)追蹤隨訪，至18個月再次進(jìn)行HIV抗體檢測，結(jié)果陰性排除感染。,艾滋病病毒感染產(chǎn)婦所生兒童,陽,陰,用另一種不同原理或不同廠家 生產(chǎn)的篩查試劑再次檢測,12個月進(jìn)行HIV抗體篩查試驗(yàn),確證試驗(yàn),18個月時再進(jìn)行HIV抗體篩查試驗(yàn),報告HIV抗體檢測結(jié)果陰性,艾滋病感染產(chǎn)婦所生兒童HIV抗體檢測流程,陽性,陰性,陰性,陽性,用另一種不同原理或不同廠 家生產(chǎn)的篩查試劑再次檢測,陰性,陰性,陽性,報告HIV抗體檢測結(jié)果陽性,提供咨詢，繼續(xù) 隨訪，4周后再次 進(jìn)行確證試驗(yàn),不確定,陽性,18個月以下嬰幼兒的HIV診斷,核酸檢測 HIV 前病毒 DNA（HIV DNA） 檢測已整合到外周血液中血細(xì)胞基因組上的 HIV DNA 基于 PCR 技術(shù) 高特異度(98%)和高靈敏度 (99%),18個月以下嬰幼兒的HIV診斷,HIV 病毒載量（HIV RNA） 用來監(jiān)測已知的HIV 感染病人的病毒載量試驗(yàn)； 真陽性的結(jié)果通常 100,000 拷貝/毫升, 而假陽性結(jié)果 1,000拷貝/毫升 RT-PCR、NASBA、CDNA、熒光定量PCR,嬰幼兒HIV感染的核酸檢測,可檢測HIV RNA也可檢測HIV DNA 首選檢測HIV DNA HIV DNA檢測不受母親圍產(chǎn)期抗逆轉(zhuǎn)錄病毒治療和人乳汁中抗逆轉(zhuǎn)錄病毒藥物以及嬰幼兒預(yù)防性抗逆轉(zhuǎn)錄病毒治療的干擾 考慮母親血液污染因素，不推薦使用臍帶血進(jìn)行HIV核酸檢測 。,嬰兒的早期診斷,HIV感染母親所生小于 18個月齡的嬰兒，不同時間的兩次HIV核酸檢測均為陽性即可作出診斷。 18個月齡以上兒童診斷與成人相同：有急性HIV感染綜合癥或流行病學(xué)史，且不同時間的兩次HIV核酸檢測結(jié)果均為陽性，即可診斷。,HIV感染產(chǎn)婦所生嬰兒,嬰兒滿3個月，再次采集 血標(biāo)本，送檢,盡快采集第二份血標(biāo)本，送檢,出生后6周采集第一份血標(biāo)本（可制備成 濾紙片干血斑（DBS），或EDTA抗凝全血），送檢,繼續(xù)隨訪,報告陽性,艾滋病感染產(chǎn)婦所生兒童HIV感染早期診斷檢測流程,呈陰性反應(yīng),呈陽性反應(yīng),呈陽性反應(yīng),呈陰性反應(yīng),呈陽性反應(yīng),盡快再次采集血樣，送檢,報告陰性,呈陽性反應(yīng),呈陰性反應(yīng),呈陰性反應(yīng),嬰幼兒HIV感染的核酸檢測,需要注意： 不同時間“嬰兒HIV感染早期診斷”檢測均呈陰性反應(yīng)的喂哺母乳的兒童，應(yīng)在完全停止喂哺母乳后的6周和3個月（若6周時檢測結(jié)果為陽性可盡快）再次采血進(jìn)行核酸定性檢測。兒童滿18個月后則可直接進(jìn)行抗體檢測。,嬰幼兒HIV感染的核酸檢測方法,HIV-DNA 1） Roche Amplicor HIV-1 DNA PCR, version 1.5試劑盒 2）IN-HOUSE（國內(nèi)開展，2009年檢測技術(shù)規(guī)范）,Amplicor HIV-1 DNA簡介,樣本： 濾紙片干血斑、EDTA抗凝全血 方法學(xué)：PCR-ELISA 結(jié)果類型：定性 靶物質(zhì)：感染宿主細(xì)胞中的pro-viral HIV-1 DNA,濾紙片干血斑,將全血滴在特定的濾紙片上制備。 它主要應(yīng)用于臨床醫(yī)學(xué)中新生兒先天性缺陷疾病的早期篩查。如：苯丙酮尿癥，先天性甲狀腺機(jī)能低下，維生素缺乏和一些感染性疾病的檢測。,濾紙片干血斑用于嬰兒HIV診斷,樣本量非常小， (20 l to 200l)特別適宜采集嬰兒樣本。 容易收集: 指尖血、后跟血。能提取全血，血漿、血清。 短期運(yùn)輸可在常溫下長期可貯存在20C 樣本可在常溫下運(yùn)輸: 不需要干冰 DBS 可作為一種無感染性材料運(yùn)輸（在美國）,濾紙片的選擇,Whatman 903濾紙片（可用于HIV抗體、HIV前病毒DNA和HIV RNA檢測 ） FTA標(biāo)準(zhǔn)卡濾紙片 （可用于HIV前病毒DNA檢測 ）,采集樣本所需要的材料,血樣本采集卡 片(濾紙片)； 可密封的塑料袋； 濕度指示卡； 干燥劑（1-2g/袋）；,怎樣采集末梢血DBS,應(yīng)用通用的安全防護(hù)措施； 清晰準(zhǔn)確地在卡片上標(biāo)記識別碼； 完成針刺指尖程序； 均一地使每個印圈飽和地吸附血液；,兩個充分吸附血液 的印圈比五個不完全吸附 的印圈要好,怎樣采集抗凝靜脈血DBS,靜脈血充分與EDTA混合； 最好采集后立即制備干血斑； 血漿與血細(xì)胞分層的全血在制備干血斑前，應(yīng)輕柔地上下顛倒采血管（避免血細(xì)胞破裂），使血液混勻后制備；,用移液槍加代濾芯槍頭移取75-80ul血液； 槍頭對準(zhǔn)印圈的中心緩慢將血液滴于濾紙上； 避免有氣泡；,怎樣干燥DBS,避免觸摸或涂抹血斑； 室溫空氣中水平干燥（至少4個小時）； 避免陽光直曬； 在干燥過程中不允許加熱，疊加或?qū)BS接觸其他表面；,在包裝前充分干燥DBS,濾紙片干血斑的包裝與運(yùn)輸,將完全干燥的濾紙片干血斑樣本用塑料袋進(jìn)行獨(dú)立包裝，或者用秤量紙隔開，以避免樣本之間的污染。 已獨(dú)立包裝好的樣本一起放入密封塑料袋中 ，加入幾包干燥劑,加入濕度指示卡。 將包裝好的濾紙片干血斑，連同相應(yīng)的文件（如采樣/送樣單等）放入大信封中。 密封后可郵寄運(yùn)輸。,放入密封袋,加入干燥劑,加入濕度指示卡,標(biāo)記袋中內(nèi)容物,核酸檢測,2次檢測陽性可早期診斷HIV感染，如果不具備條件，也可用HIV病毒載量法來代替，2次檢測陽性也可診斷HIV感染，18個月齡以后再做抗體檢測確認(rèn)。,HIV核酸定量檢測,通過SFDA審批的試劑盒、方法 NASBA EasyQ Amplicor Taqman bDNA340 440 M2000 PG,CD4+T淋巴細(xì)胞檢測,CD4+T淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù),廣泛應(yīng)用于HIV感染者的臨床管理中，協(xié)助判斷感染者的預(yù)后、指導(dǎo)實(shí)施抗病毒治療和療效觀察以及藥物預(yù)防機(jī)會性感染等方面。,CD4+T淋巴細(xì)胞檢測,對于免疫功能相對較好，CD4+T淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)350/mm3的艾滋病感染孕產(chǎn)婦，采用預(yù)防性抗病毒用藥方案； 對于CD4+T淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)350/mm3的艾滋病感染孕產(chǎn)婦，采用治療性抗病毒用藥方案。,常規(guī)CD4+T淋巴細(xì)胞檢測的方法和程序,流式細(xì)胞儀檢測方法 雙平臺方法 單平臺方法 樣品：EDTA、枸櫞酸（ACD）或肝素抗凝全血 運(yùn)送條件： 室溫（1825）保存和運(yùn)輸樣品 避免極端溫度（結(jié)冰或大于37） 高溫季節(jié)，需用隔熱容器盛裝樣品，并將其置于有冰袋和吸熱物質(zhì)的容器中。,常規(guī)CD4+T淋巴細(xì)胞檢測的方法和程序,48小時內(nèi)染色，染色后6小時內(nèi)分析； 如采血后24小時內(nèi)染色，可在染色后24小時內(nèi)分析； 利用CD45單克隆抗體設(shè)淋巴細(xì)胞門，可檢測放置72小時的樣品； 在血球分析儀生產(chǎn)商允許的樣品采集時間范圍內(nèi)檢測。,FACSCalibur流式細(xì)胞儀,二、梅毒檢測技術(shù) 顯微鏡檢查法 血清學(xué)檢查法 梅毒特異性抗原血清學(xué)檢測 梅毒非特異性抗原血清學(xué)檢測,各期梅毒的取材部位和檢查方法,臨床表現(xiàn) 取材部位 檢查方法 一期梅毒 潰瘍、淋巴結(jié) 暗視野檢查 血液 血清學(xué)檢查 二期梅毒 皮損、淋巴結(jié) 暗視野檢查 血液 血清學(xué)檢查 三期梅毒 血液、腦脊液 血清學(xué)檢查 隱性梅毒 血液 血清學(xué)檢查 胎傳梅毒 皮損、胎盤 暗視野檢查 血液 血清學(xué)檢查,（一)、顯微鏡檢查法,1.暗視野顯微鏡檢查 2.直接免疫熒光試驗(yàn)（DFA） 3.渡銀染色檢查,1.暗視野顯微鏡檢查,暗視野顯微鏡下，典型的梅毒螺旋體呈白色發(fā)光, 其螺旋較密而均勻。運(yùn)動規(guī)律，運(yùn)動性較強(qiáng)，其運(yùn)動方式包括旋轉(zhuǎn)式，圍繞其長軸旋轉(zhuǎn)；蛇行式, 全身彎曲如蛇行；伸縮其螺旋間距離而移動。觀察其運(yùn)動形式有助于與其他螺旋體相鑒別。 未檢出螺旋體不能排除梅毒的診斷，陰性結(jié)果可能說明：螺旋體數(shù)量不足(單次暗視野顯微鏡檢查陽性率小于50%)。患者已接受抗生素或殺滅梅毒螺旋體的藥物治療。損害接近自然消退。損害不是梅毒。,2.直接免疫熒光試驗(yàn)（DFA),在熒光顯微鏡下可見到發(fā)蘋果綠色的梅毒螺旋體。 臨床意義與暗視野顯微鏡檢測相同。 DFA的特異性及敏感性均大于暗視野顯微鏡檢測。,3.梅毒螺旋體渡銀染色檢查,梅毒螺旋體具有親銀性，顯微鏡下可見到染成棕色的梅毒螺旋體。臨床意義基本同暗視野顯微鏡檢查法。,(二)、血清學(xué)檢查法,血清學(xué)檢查是輔助診斷梅毒的重要手段。 當(dāng)人體感染梅毒螺旋體后410周左右，血清中可產(chǎn)生一定數(shù)量的抗類脂質(zhì)抗原的非特異性反應(yīng)素（主要是IgM、IgG）和抗梅毒螺旋體抗原的特異性抗體（主要是IgM、IgG）。這些抗體均可用免疫學(xué)方法進(jìn)行檢測。,梅毒血清學(xué)檢測方法,1.非梅毒螺旋體抗原血清試驗(yàn),1.1 性病研究實(shí)驗(yàn)室試驗(yàn)（Venereal Disease Research Laboratory test，VDRL） 1.2 快速血漿反應(yīng)素環(huán)狀卡片試驗(yàn)（Rapid plasma reagin circle card test，RPR） 1.3 甲苯胺紅試驗(yàn)（Toluidine red unheated serum test，TRUST） 方法簡便、快速，敏感性和特異性較好。對一期梅毒的敏感性為7487，二期梅毒達(dá)100，三期梅毒3494。特異性9699。,非梅毒螺旋體抗原血清試驗(yàn)臨床意義,適用于各期梅毒的診斷。早期梅毒經(jīng)治療后血清滴度可下降或轉(zhuǎn)陰，故可用于療效觀察、判愈、判定復(fù)發(fā)或再感染。也適用于人群的篩查、產(chǎn)前檢查及健康體檢等。 VDRL試驗(yàn)適用于神經(jīng)梅毒的腦脊液檢查, 特異性高，但敏感性低。 可在某些傳染病及膠原病時出現(xiàn)假陽性反應(yīng)，因此對陽性反應(yīng)應(yīng)結(jié)合臨床進(jìn)行鑒別，或做梅毒螺旋體抗原血清試驗(yàn)以進(jìn)一步證實(shí)之。,2.梅毒螺旋體抗原血清試驗(yàn),采用梅毒螺旋體作抗原，為特異性抗原，檢測血清中抗梅毒螺旋體IgG或IgM抗體。 敏感性和特異性均較高。一期梅毒的敏感性為70100，二期梅毒達(dá)100，三期梅毒9598，特異性94100。,梅毒螺旋體明膠顆粒凝集試驗(yàn)（TPPA）,原理 TPPA試驗(yàn)用梅毒螺旋體致敏明膠顆粒，此致敏顆粒與人血清中的抗梅毒螺旋體抗體結(jié)合，產(chǎn)生可見的凝集反應(yīng)。明膠顆粒為玫瑰紅色，便于肉眼觀察結(jié)果。,梅毒螺旋體酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（TP-ELISA）,原理 用經(jīng)純化及超聲裂解處理的梅毒螺旋體為抗原包被固相板條 加入待檢血清和辣根過氧化酶標(biāo)記的抗人IgG抗體，利用酶免疫法檢測患者血清中的抗梅毒螺旋體特異性抗體。 采用特異的梅毒螺旋體重組蛋白作為抗原，使試驗(yàn)更加敏感、特異。,梅毒IgM抗體血清學(xué)試驗(yàn),梅毒特異性IgM抗體是梅毒感染最早期產(chǎn)生的抗體。 IgM分子量較大不能通過胎盤屏障。因此在新生兒血中檢測到IgM抗體表明有先天感染。 如在患者的腦脊液檢測到IgM抗體表明有活動性神經(jīng)梅毒。 血液中或腦脊液中出現(xiàn)抗梅毒IgM抗體均表示需要治療。,梅毒螺旋體