（土壤學專業(yè)論文）蚯蚓蛋白酶解工藝與氨基酸螯合鹽的制備及生物效應研究.pdf

山東農業(yè)大學碩十學位論文 中文摘要 蚯蚓蛋白資源化利用，已由原單方向的飼料化利用轉向了多功能產品 的開發(fā)利用。氨基酸螯合金屬鹽的制備是涉及到氨基酸的制備，螯合物的 合成及后期產物生物效應檢測( b i o a s s a y ) 的系統(tǒng)工作，螯合鹽在微量元 素肥料、液體肥料、動物飼料添加劑、種子包衣劑生產中的運用相當廣泛。 本研究利用蚯蚓蛋白作為氨基酸供體，對比了蚯蚓自溶和添加外源蛋白酶 水解產率的變化，并引入響應面( r s m ) 設計優(yōu)化酶解條件，篩選出螯合 銅、鋅鹽的最佳螯合條件，最后通過生物檢測，即小麥發(fā)芽率試驗和小麥 種芽敏感性試驗，檢驗f e s 0 4 ，e d t a f e ，a a f e 三種鐵鹽的生物效應， 評價了三種鐵鹽的對小麥種芽相關部位和功能體的靶位作用。主要研究結 果和結論如下： 1 整個水解過程中酸性蛋白酶處理的氨基態(tài)氮濃度都明顯高于自溶 處理，差異顯著，從3 h 到8 h 時，加酶處理水解度由1 2 7 提高到2 2 ， 自溶處理水解度由6 6 2 提高到1 6 0 5 ，同時酸性蛋白酶相對于自溶處 理的水解度提高率由9 1 8 下降到3 7 1 。 2 水解時問x 和氨基態(tài)氮濃度y 進行擬合，酸性蛋白酶處理與自溶 處理方程分別為：y = 0 4 3 2 x e x p ( 0 1 3 0 ；y = 0 2 6 0 x e x p ( o 1 4 3 x 1 ，模型的相關系 數分別為0 9 3 8 3 * ，0 9 9 2 8 * * 。自溶模型擬合度低于加酶處理模型，蚯蚓 自溶過程是一個不穩(wěn)定的反應過程。 3 生產工藝中原材料的保存方式對后期酶解工藝的影響甚為重要， 4 。c 和2 5 。c 條件保存及放置時間對后期蚯蚓自溶工藝的水解率產生了顯著 的影響，4 。c 存放蚯蚓勻漿物在相同放置時間內水解率均大于2 5 的水解 率，兩者差異顯著。4 。c 條件下存放有利于后期酶解流程中水解率的提高， 存放時間不宜超過4 h 。 4 編碼值溫度( a ) 、酶濃度( b ) 、酶解時間( c ) 的響應面分析試 驗，利用d e s i g ne x p e r t 7 1 回歸分析，得到水解率預測值( y ) 對編碼自 變量a ，b ，c 的回歸方程為： y = 2 2 8 6 + 1 6 6 a + 1 8 3 b + 0 9 2 c + 1 2 3 a b 0 7 0 a c 0 5 5 b c + 1 5 8 a 2 + o 2 4 8 2 - 0 5 c 2 ，系數顯著性檢驗后模型修正：y = 2 2 8 6 + 1 6 6 a + 1 8 3 b + 1 5 8 a 2 ，模型中 a ，b ，c 求偏導，得出最佳條件：溫度= 5 0 ，酶濃度= 5 ，酶解時間= 4 3 4 h 蚯蚓蛋亡| 酶解工藝與氨某酸整合鹽的制備及生物效心研究 5 銅螯合的最佳條件：溫度4 0 ，時間3 0 m i n ，質量比2 ：l ；鋅離 子螯合的最佳條件：溫度3 0 ，時間5 0 m i n ，質量比2 ：1 6 發(fā)芽率是生物檢測的常用方法，a a f e 在1 旺1 0 0m g l 一，對小麥 發(fā)芽率的促進和抑制均不明顯，2 5 0 m g l 。1 的發(fā)芽抑制率突然提高。鐵鹽 的品種不同對小麥根長的抑制程度不同，超過1 0 0m g l ，三種鐵鹽均抑 制伸長和質量，抑制率a a f e 最高。 7 三種鐵鹽濃度與發(fā)芽指數( g i ) 間的曲線模型可分析評估三種鐵 鹽的生物活性，三類鐵鹽模型分別為l n y = l n ( 9 9 6 3 7 8 ) 0 0 1 6 2 7 x ， y = 9 7 1 6 4 2 2 8 8 9 l g x + 8 5 8 8 ( 1 9 x ) z ，y = 9 9 4 6 4 0 4 7l g x ( x - 鐵鹽濃度， y ：發(fā)芽指數) 。 8 小麥種芽對鐵鹽的影響尤為敏感，最為直觀的反應為芽葉與根的 生物量和伸長度的變化。根在形態(tài)與質量上響應敏感度高于芽。濃度大于 1 0 0 m g l 。1 時，三種鐵鹽對根與芽葉的伸長，鮮重均產生不同程度的抑制， 其中以a a f e 的抑制程度最高，三種鐵鹽根伸長抑制率a a f e f e s 0 4 e d l a f e 。 9 從鐵鹽對小麥光合系統(tǒng)影響角度分析，a a f e 的對小麥的抑制起 始濃度在5 旺1o om g l 以之間，f e s 0 4 與e d t a f e 對小麥的抑制起始濃度 在1 0 0 _ _ 2 5 0m g l 。1 之間。三種鐵鹽對葉綠素的抑制性a a f e 最強，其次 為f e s 0 4 ，e d t a f e 最小 l o 芽葉和根m d a 濃度應鐵鹽品種和濃度的變化而變化，f e s 0 4 與 e d t a f e 處理的芽葉和根中m d a 的濃度隨鐵鹽濃度提高先上升，后稍有 下降，芽葉m d a 變化幅度分別為4 1 3 2 一1 7 2 和2 4 3 1 一1 4 8 9 6 ， 根m d a 變化幅度分別為7 5 一5 7 1 和9 0 7 8 哆仁乏8 5 8 2 ；a a f e 處理 的芽葉和根中m d a 的濃度隨鐵鹽濃度而提高，變化范圍分別為 2 6 0 4 一1 0 3 8 2 和2 l 5 2 4 8 ，m d a 在根中變化幅度大于芽葉。 1 1 測定指標對于鐵鹽濃度的響應度上，抑制率指標 脂膜過氧化指 標 葉綠素指標，生長指標( 抑制率指標) 的響應度高于生理指標( 葉綠 素指標、脂膜過氧化指標) 。f e s 0 4 作用靶位主要為芽，e d t a f e 與a a f e 作用靶位主要為根；小麥根脂膜系統(tǒng)對f e s 0 4 和a a f e 的響應度高，幼 芽脂膜系統(tǒng)對e d t a f e 相對更敏感。 2 山東農業(yè)大學碩上學位論文 關鍵詞：蚯蚓蛋白，自溶，水解，響應面設計，螯合，小麥，生物檢測 蚯蚓蛋臼酶解工藝與氨基酸螯合鹽的制各及生物效應研究 e n z y m a t i ch y d r o l y s i so f e a r t h w o r mp r o t e i na n d p r o d u c t i o no f a m i n oa c i dc h e l a t e s a l t a n di t sb i o e f f e c t sc h a r a c t e r i s t i c s a b s t r a c t t h eu t i l i z a t i o no fe a r t h w o r mp r o t e i nh a ss w i t c h e dt or e s e a r c ht h e d e v e l o p m e n t o fm u l t i f u n c t i o n a l p r o d u c t s f r o m o r i g i n a l u t i l i z a t i o na s f e e d s t u f f t h ep r e p a r a t i o no fa m i n oa c i dc h e l a t e si sa s y s t e m a t i cp r o c e s sw h i c h r e f e r e dt ot h ep r o d u c t i o no fa m i n oa c i d ，c o m p o s i t i o no fc h e l a t ea n db i o a s s a y o f p r o d u c t i o n c h e l a t e s a l th a v e b e e nw i d e l yu s e di nc h e m i c a la n d a g r o c h e m i c a li n d u s t r y , s u c ha sm i c r o n u t r i e n tf e r t i l i z e r s ，l i q u i df e r t i l i z e r s ， a n i m a lf e e da d d i t i v e sa n ds e e dc o a t i n ga g e n t s t i l i sr e s e a r c hu s e dw o r m p r o t e i na sa m i n oa c i dd o n o r ，w a sc o m p a r e dt h ec h a n g e si nh y d r o l y z i n g d e g r e eo fa u t o l y s i sa n do u t e rp r o t e a s et r e a t m e n t s ，a n da l s ot h er e s p o n s e s u r f a c e m e t h o d o l o g y ( r s m ) w a s i n t r o d u c e dt o o p t i m i z eh y d r o l y z i n g c o n d i t i o n s ，a i m e da tt h eo p t i m u mc o n d i t i o no fm a k i n gc o p p e rc h e l a t e sa n d z i n cc h e l a t e s w h e a tg e r m i n a t i o nr a t ea n db u ds e n s i t i v i t ye x p e r i m e n tw e r e c o n d u c t e da sb i o a s s a ym e t h o d st ot e s tt h eb i o e f f e c t so ft h r e ek i n d so fi r o ns a l t s ( f e s 0 4 ，e d l a - f e ，a a f e ) a n de v a l u a t e dt a r g e tp o s i t i o na c t i o no fi r o ns a l to n w h e a tb u dr e g i o na n df u n c t i o n m a i nr e s u l t sw e r ea sf o l l o w e d ： 1 i nt h ew h o l ep r o c e s s t h ec o n c e n t r a t i o no fa m i n on i t r o g e ni no u t e r p r o t e a s et r e a t m e n tw a so b v i o u s l yh i g h e rt h a na u t o l y s i s ，w h i c hh a ds i g n i f i c a n t d i f f e r e n c e f r o m3 ht o8 h t h ec o n e e n t r a t i o no fa m i n on i t r o g e ni no u t e r t r e a t m e n tw a ss i g n i f i c a n ti n c r e a s e df r o m1 2 7 t o2 2 w h i l ea u t o l y s i s t r e a t m e n tw a si n c r e a s e df r o m6 6 2 t o16 0 5 b u ti n c r e a s e dr a t i oo f h y d r o l y z i n gd e g r e ed e c r e a s e df r o m9 1 8 t o3 7 1 2 n o n - l i n e a rr e g r e s s i o na n a l y s i sw a sm a d eb e t w e e nh y d r o l y s i st i m e ( x ) a n d a m i n on i t r o g e nc o n c e n t r a t i o n ( y ) o u t e rp r o t e a s ea n da u t o l y s i st r e a t m e n t sw a s s i m u l a t e db ye x p o n e n t i a le q u a t i o n s ，y = o 4 3 2 x e x p ( o 1 3 0 x ) ，y = o 2 6 0 x e x p ( o 1 4 3 ) ( ) ， c o r r e l a t i o nc o e m c i e n t sw e r e0 9 3 8 3 * a n d0 9 9 2 8 * * r e s p e c t i v e l y t h ee r r o rt e s t o ff i t t e dv a l u ei n d i c a t e dt h a t ，f i t t e dl e v e lo fa u t o l y s i st r e a t m e n tw a sl o w e rt h a n o u t e rp r o t e a s et r e a t m e n t j 玉er e s u l ta l s os h o w e d 函甜t h ea u t o l y s i so f e a r t h w o r mw a sa nu n s t a b l er e a c t i o np r o c e s s 3 s t o r a g em e t h o d so fm a t e r i a li np r o d u c t i o nw e r ei m p o r t a n tt oh y d r o l y s i s 4 山東農業(yè)大學碩士學位論文 p r o c e s s ，a n ds t o r a g et i m ea n dt e m p e r a t u r e ( 4 a n d2 5 c ) h a ds i g n i f i c a n t e f f e c t so nh y d r o l y z i n gd e g r e e n eh y d r o l y z i n gd e g r e eo fw o r mp u l pa t4 c w a sh i g h e rt h a na t2 5 u n d e rs a m es t o r a g et i m e ，w h i c hr e a c h e dv e r y s i g n i f i c a n tl e v e l s o4 cw a sb e n e f i c i a lt oh y d r o l y s i sp r o c e s sa n ds t o r a g et i m e s h o u l dn o te x c e e d4 h 4 t h r e ec o d e st e m p e r a t u r e ( a ) ，p r o t e a s ec o n c e n t r a t i o n ( b ) ，t i m e ( c ) ，a n d t h r e el e v e l sw e r ei n c l u d e di nr s md e s i g n d e s i g ne x p e r t7 1 r e g r e s s i o n a n a l y s i sw a su s e dt oo b t a i nr e g r e s s i o nb e t w e e np r e d i c t e dv a l u eo fh y d r o l y z i n g d e g r e e ( y ) ，a n dc o d ei n d e p e n d e n tv a r i a b l ea ，b ，c ：y = 2 2 8 6 + 1 6 6 a + 1 8 3 b + 0 9 2 c + 1 2 3 a b 0 7 0 a c o 5 5 b c 十1 5 8 a + o 2 4 b 二一o 5 c 2 a f t e r c o e f ! f i c i e n t t - t e s t ，m o d e l w a sm o d i f i e d i n t o ：y = 2 2 8 6 + 1 6 6 a + 1 8 3 b + 1 5 8 a 2 ，t h e o p t i m u mc o n d i t i o nw e r ec a l c u l a t e d ：t e m p e r a t u r e = 5 0 ，c o n c e n t r a t i o n = 5 ， t i m e = 4 4 3 h 5 t h eo p t i m u mc o n d i t i o no fc o p p e rc h e l a t e ：t e m p e r a t u r e4 0 c ，t i m e3 0 m i n ， m a s sr a t i o2 ：1 ；t h eo p t i m u mc o n d i t i o no fz i n cc h e l a t e ：t e m p e r a t u r e3 0 c ，t i m e 5 0 m i n m a s sr a t i o2 ：1 6 g e r m i n a t i o nr a t ew a sac o m m o nm e t h o df o rb i o a s s a y , a t1m 一10 0m g l 一 a a f eh a dn om a r k e ds t i m u l a t i o na n di n h i b i t i o ne f f e c to nw h e a tg e r m i n a t i o n r a t e ，b u tt h ei n h i b i t i o nr a t i oo fa a f ea t2 5 0m g l 。1 w a sg r e a t e rt h a nf e s 0 4 a n de d t a f e t y p e so fi r o ns a l th a dd i f f e r e n ti n h i b i t i o ne f f e c t so nl e n g t ho f w h e a tr o o t ，c o n c e n t r a t i o no v e r r u n e d10 0m g l 一，t h el e n g t ha n db i o m a s sw e r e r e s t r a i n e db yt h r e ei r o ns a l t s ，t h eg r e a t e s ti n h i b i t i o nt r e a t m e n tw a sa a - f e 7 c u r v er e g r e s s i o nm o d e l ，b e t w e e nc o n c e n t r a t i o no fi r o ns a l ta n d g e r m i n a t i o ni n d e x ( g i ) ，w a sa ne f f e c t i v ew a yt oa n a l y z ea n de s t i m a t et h e b i o e f f e c t so fi r o ns a l t t h r e em o d e l sw e r el n y = l n ( 9 9 6 3 7 8 ) 0 0 16 2 7 x y = 9 7 16 4 2 2 8 8 9 l g x + 8 5 8 8 ( 1 9 x ) 上，y = 9 9 4 6 4 0 4 7l g x ，r e s p e c t i v e l y ( w h e r ex i sc o n c e n t r a t i o no fi r o ns a l t ；yi sg e r m i n a t i o ni n d e x ) 8 w h e a ts h o o tw e r ee s p e c i a l l ys e n s i t i v et oa d d i t i o no fo u t e rc h e m i c a l s u b s t a n c ea n dt h ee f f e c tc a nb eo b s e r v e di nl e n g t ha n db i o m a s so fs h o o ta n d r o o t 。r o o t m o r p h o l o g y a n d g r o w t h w a sm o r es e n s i t i v et h a ns h o o t c o n c e n t r a t i o no v e r r u n e d1 0 0m g l ，d i f f e r e n ti n h i b i t i o ne f f e c to ft h r e ek i n d s o fi r o ns a l to nt h el e n g t ha n dw e i g h to fr o o ta n ds h o o tw e r eo b s e r v e d a n d a a f ew a st h eg r e a t e s t ，i n h i b i t i o nr a t eo nr o o tg r o w t hw e r e ：a a f e f e s 0 4 e ：d t a f e 5 蚯蚓蛋 j 酶解t 藝與氨基酸螯合鹽的制備及生物效心研究 9 t h r o u g ha n a l y z e dt h ee f f e c to fi r o ns a l to nw h e a tp h o t o s y n t h e t i cs y s t e m ， t h eb e g i n n i n gi n h i b i t i o nc o n c e n t r a t i o no fa a - f ew a sb e t w e e n5 0 - 1 0 0m g l ， w h i l e f e s 0 4a n de d t a f eb e t w e e n1o o 2 5 0m g l - 1 t h ei n h i b i t i o no f c h l o r o p h y l lw a s ：a a f e f e s 0 4 e d 7 f a f e 10 t h em a l o n a l d e h y d e ( m d a ) c o n c e n t r a t i o nw e r ec h a n g e dw i t ht y p e sa n d c o n c e n t r a t i o no fi r o n s a l t i n f e s 0 4a n de d t a f et r e a t m e n t s ，m d a c o n c e n t r a t i o ni ns h o o ta n dr o o ti n c r e a s e dw i t ht h ei n c r e m e n to fc o n c e n t r a t i o n o fi r o ns a l t a n dt h e nd e c r e a s e ds l i g h t l y t h ec h a n g eb o u n do fm d ai ns h o o t w a s 一4 1 3 2 一1 7 2 a n d2 4 3 1 一1 4 8 9 6 i nr o o tm d ac h a n g eb e t w e e n 7 5 一5 7 1 a n d9 0 7 8 - 2 8 5 8 2 r e s p e c t i v e l y i n c r e m e n t o fa a f e c o n c e n t r a t i o ni n c r e a s e dm d ai ns h o o ta n dr o o t ，a n dm d ai n c r e a s e db v 2 6 0 4 一10 3 8 2 a n d21 _ 6 5 2 4 8 r e s p e c t i v e l y t h ec h a n g eb o u n do f m d ai nr o o tw a sw i d e rt h a ni ns h o o t 1 1 f o rr e s p o n s ed e g r e e ，i n h i b i t i o nr a t ei n d e xw a sg r e a t e s t ，f o l l o w e db yl i p i d p e r - o x i d a t i o ni n d e x ，a n dc h l o r o p h y l li n d e xl e a s t ；b e s i d e s ，g r o w t hi n d e xw a s h i g h e rs e n s i t i v et h a np h y s i o l o g yi n d e x a c t i o nt a r g e tp o s i t i o no ff e s 0 4 f i x e di ns h o o t s a n da a f ea n de d t a f ef i x e di nr o o t s 耶1 er o o tl i p i d p e r o x i d a t i o nw a sm o r es e n s i t i v et of e s 0 4a n da a f e ，a n ds h o o tw a st o e d t a f e k e y w o r d s ：e a r t h w o r mp r o t e i n ；a u t o l y s i s ；h y d r o l y s i s ；r e s p o n s es u r f a c e m e t h o d o l o g y ；c h e l a t e ；b i o e f f e c t 6 縮寫 a a f e e d t a f e f e s 0 4 m d a c o n r i r s i r t q i r r q i r s q i r c h l a c h l b c h l a b c a r m d a r m d a s a a c u a a z n r s m g i g 4 8 g 1 0 0 h s l d h 英文縮略表 英文 a m i n oa c i dc h e l a t ei r o n e d t ai r o n i r o n ( i i ) s u l f a t e m a l o n d i a l d e h y d e c o n c e n t r a t i o n r o o ti n h i b i t i o nr a t i o s h o o ti n h i b i t i o nr a t i o t o t a lq u a l i t yi n h i b i t i o nr a t i o r o o tq u a l i t yi n h i b i t i o nr a t i o s h o o tq u a l i t yi n h i b i t i o nr a t i o c h l o r o p h y l la c h l o r o p h y l lb c h l o r o p h y l la + b c a r o t e n o i d m a l o n d i a l d e h y d ei nr o o t m a l o n d i a l d e h y d ei ns h o o t a m i n oa c i dc h e l a t ec o p p e r a m i n oa c i dc h e l a t ez i n c r e s p o n s es u r f a c em e t h o d o l o g y g e r m i n a t i o ni n d e x g e r m i n a t i o nr a t ei n4 8h g e r m i n a t i o nr a t ei n10 0h k m n 0 4 一t r e a t e ds e e d s s a n d f i l t e rp a p e r d e g r e eo fh y d r o l y s i s 中文說明 氨基酸螯合鐵 乙二胺四乙酸螯合鐵 硫酸亞鐵 丙二醛 濃度 根伸長抑制率 芽葉伸長抑制率 總質量抑制率 根質量抑制率 芽質量抑制 葉綠素a 葉綠素b 葉綠素總量 類胡蘿卜素 根中丙二醛濃度 根中丙二醛濃度 氨基酸螯合銅 氨基酸螯合鋅 響應面設計 發(fā)芽指數 4 8 小時發(fā)芽率 1 0 0 小時發(fā)芽率 高錳酸鉀處理種子 沙子 濾紙 水解度 關于學位論文原創(chuàng)性和使用授權的聲明 本人所呈交的學位論文，是在導師指導下，獨立進行科 學研究所取得的成果。對在論文研究期間給予指導、幫助和 做出重要貢獻的個人或集體，均在文中明確說明。本聲明的 法律責任由本人承擔。 本人完全了解山東農業(yè)大學有關保留和使用學位論文 的規(guī)定，同意學校保留和按要求向國家有關部門或機構送交 論文紙質本和電子版，允許論文被查閱和借閱。本人授權山 東農業(yè)大學可以將本學位論文的全部或部分內容編入有關 數據庫進行檢索，可以采用影印、縮印或其他復制手段保存 論文和匯編本學位論文，同時授權中國科學技術信息研究所 將本學位論文收錄到中國學位論文全文數據庫，并向社 會公眾提供信息服務。 保密論文在解密后應遵守此規(guī)定。 論文作者簽名： 導師簽名： 山東農業(yè)大學碩士學位論文 1 引言 1 1 蛋白質水解產物的特殊價值和開發(fā) 1 1 1 多( 小) 肽物質的價值 組成蛋白質的氨基酸構成的物質中，有一類不同于蛋白質的中間物 質，這種物質具有特殊的功能，人們稱之為肽( p e p t i d e ) ，由兩個氨基酸組 成的肽稱為二肽，多個氨基酸分子以肽鍵相連接則稱為多肽( 王鏡巖， 2 0 0 2 ；劉玉德，2 0 0 2 ) 這些多肽多以非活性狀態(tài)存在于蛋白質長鏈中，當 被酶解成適當的長度時，它們的活性就會表現(xiàn)出來。 無論是植物蛋白還是動物蛋白經水解后都可以得到肽。大豆分離蛋 白經酶解后，易于被人體消化吸收，同時生成的多肽具有很多生物學功能 特性( 肖懷秋，2 0 0 7 ；劉文輝，2 0 0 3 ) 。如干酪蛋白酶解液對人腸桿菌，金 黃色葡萄球菌、枯草芽抱桿菌均有很強的抑制作用，證明該酶解液不僅對 陽性菌和陰性菌有較強的抑制作用，而且對球菌和桿菌都有較強的抑制作 用，超濾后的活性測定說明活性物分子量均在3 0 0 0 u 以下( 李海芹，2 0 0 6 ) 。 h e e g u kb y u n 等( 2 0 0 1 年) 從阿拉斯加青鱈皮中提取的膠原蛋白并采用 a l c a l a s e ，p r o n a s ee 和膠原蛋白酶在三步循環(huán)的酶膜反應器中依次順序 水解，發(fā)現(xiàn)第二步采用p r o n a s ee 水解完分子量在l1 5 1 5 k d a 肽組成的 產物抗氧化能力最強。 蚯蚓蛋白水解液含有豐富的氨基酸和多種礦質元素，其中游離的氨基 酸以分子狀態(tài)穿過細胞膜進入植物細胞內，容易被植物吸收。蚯蚓水解液 中含有的多功能多肽具有抗病和促進植物生長作用，是多功能生物農藥的 開發(fā)依據( 蔡明才，2 0 0 4 ) 。 1 1 2 蚯蚓蛋白質水解產物的功能 抗菌肽是動物機體具有天然免疫力的重要原因，到目前為止已發(fā)現(xiàn)5 大類約5 0 多種。研究最多的是殺菌肽( e i e r o p i n ) ，爪蟾抗菌肽( m a g a i n i n ) 和防衛(wèi)肽( d e e f n s n i ) ( 付清泉等，2 0 0 2 ) ，其分子量一般在1 0k d a 以下( 王沖， 孫振鈞，2 0 0 6 ) 。蚯蚓經過長期的進化逐漸形成了抵抗外來微生物侵襲的機 制，自身也產生一些抗菌成分。蚯蚓體液中分離到了三種分子質量為4 0k u ， 4 2k u 和4 5k u ，具抗菌、溶血和凝血功能的蛋白質命名為f e t i d i n s ，近來發(fā) 現(xiàn)的e p l 6 的不同分子大小的小肽結構，其對鶉雞腸球菌、綠膿桿菌、鮑 7 蚯蚓蛋 j 酶解工藝與氨基酸螯合鹽的制各及生物效應研究 氏不動桿菌、土生克雷伯氏菌、糞腸球菌有一定的抑制作用( 張希春，孫 振鈞2 0 0 2 ) 。 蚯蚓氨基酸生物制劑對小麥生理代謝和生長的都有促進作用。使用蚯 蚓氨基酸生物制劑，在小麥種子萌發(fā)期其過氧化氫酶、酸性磷酸酯酶活性 和三磷酸腺苷酶含量分別比對照提高1 1 9 1 ，1 1 9 和3 7 5 。在小麥幼苗 時期，硝酸還原酶活性和幼苗吸收磷的能力分別比對照提高9 8 6 和 2 8 2 。在小麥發(fā)芽期，種子活力指數比對照提高2 8 9 ，小麥三葉期苗 高、根長和干重分別比對照提高1 3 2 ，1 9 2 和2 4 1 ( 劉大永，萬兆良 1 9 9 4 ) 1 2 蛋白酶解條件的研究 1 2 1 氨基酸的制備工藝 1 2 1 1 蛋白的預處理 通常作為氨基酸供體的蛋白多為動物蛋白，少量為植物蛋白( 大豆 蛋白) 。但由于蛋白體通常與角質油脂物成為復合體，水解加工前為提高 水解效率常采用一些方法，增加蛋白與酶的接觸面積，減少油脂等的負效 應。如有機溶劑脫脂法( 敬承衡，1 9 9 5 ) ，這其中包括索式提取法和浸提 發(fā)( 鄭仕遠，2 0 0 3 ；錢俊青，2 0 0 2 ) ，鄭仕遠( 2 0 0 7 ) 提出索式提取法優(yōu)于 浸提法，有機提取劑丙酮為佳。如蠶蛹含油高，也有采用氫氧化鈉分離蛋 白和甲殼，指出氫氧化鈉溶液浸泡0 0 0 。c 、2 0 m i n ) 脫脂蛹，引起蛋白質、 甲殼素膨脹，且對蛋白層與甲殼層的層間有劈開作用等組織結構的變化 ( 鄭仕遠，2 0 0 7 ) 1 2 1 2 化學工藝與生物工藝的利弊 蛋白質的水解方式較多，主要有化學降解法和生化降解法即酶法降解 ( 王鏡巖，2 0 0 2 ) ?；瘜W方法是利用酸或堿水解蛋白質，雖然方法簡單、成 本低廉，可是反應條件劇烈，生成過程中氨基酸受損嚴重，破壞了氨基酸 的構形，使l 一氨基酸變成d 一氨基酸，而且很難按規(guī)定的水解程度控 制水解，故現(xiàn)在很少采用。而酶解能在溫和的條件下進行，并且可以在特 定的條件下進行定位水解，分裂產生特定的肽，水解的程度易于控制，因 而能很好的滿足生產活性肽的需要。反應產物與相同組成的氨基酸具有特 殊的理化性能和生理功能，己成為蛋白質水解制品的主要發(fā)展方向 8 山東農業(yè)大學碩上學位論文 ( a d u a m a n k w ab ，19 81 ；s u t h a s i n e en i l s a n g ，2 0 0 5 ；郝曉霞，2 0 0 7 ) 。 利用酸法或堿法進行氨基酸制備的研究不是太多，馬建濱( 2 0 0 1 ) 等 利用酸解毛發(fā)蛋提取胱氨酸時，指出溫度、毛酸比、時間等因素影響到毛 發(fā)蛋白的水解率和產品肽氨酸的總收率。烏云( 2 0 0 2 ) 利用6 m 0 1 l 1 鹽酸 溶液酸解羊胎盤下腳料，在1 0 5 1 1 0 水解2 4 h 。林瑞余( 2 0 0 2 ) 比較了酸 解和堿解的區(qū)別，得到了硫酸水解率高，水解率高達7 9 4 4 ，堿解法得 到水解率5 8 6 ，硫酸濃度為3m 0 1 l 一，可以看出酸解和堿解的特點是水 解率高，能耗也高，同時水解物的分離利用工序復雜，成為利用的瓶頸。 1 2 1 3 水解過程不同酶的運用 工業(yè)化生產中水解蛋白關鍵是選好酶，可供選擇的酶眾多，其作用 機制對于氨基酸的生產至關重要。蛋白質水解酶根據來源可分為來自植物 組織的蛋白酶( 如木瓜蛋白酶、菠蘿蛋自酶、無花果蛋白酶等) ，來自動物 組織的蛋白酶( 如：胃蛋白酶、胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶等) 和來自微生物的 蛋白酶( 劉文輝，2 0 0 3 ) 。一般來說，來自動、植物的蛋白酶安全性較高，但 是其產量低，價格高，催化活性普遍較低，微生物蛋白酶與動物蛋白酶和 植物蛋白酶相比溶解性好，活力高，對蛋白質作用強烈，非常適合于對蛋 白質進行較深度的水解。根據酶作用靶位功能來分，分為內切蛋白酶，如 a l c a l a s e ( a l c ) 和n o v op r o d ( n p d ) ；肽鏈端解酶，如風味蛋白酶( f l a ) 和c o r o l a s e ( f o r ) ( c h u l a p o mk a m n e r d p e t c h ，2 0 0 7 ) 目前，三種較為常見的微生物蛋白酶是：地衣芽抱桿菌( b a c i l l u s l i c h e n i f o r m i s ) 深層發(fā)酵產生的堿性蛋白酶，在堿性條件下具有較高的催化 活性；枯草桿菌( b a c i l l u ss u b t i l i s ) 深層發(fā)酵產生的中性蛋白酶，在中性條件 下具有較高的催化活性；5 7 9 酸性蛋白酶，一種在酸性環(huán)境下催化蛋白質 水解的酶制劑，適用于酸性介質中水解動植物蛋白質。文獻中常出現(xiàn)的有 丹麥諾和諾德( n o v o n o r d i s k ) 公司生產的堿性蛋白酶( a l c a l a s e ) 和中性蛋白 酶( n e u t l a s e ) ，中國無錫星達生物工程有限公司( 原無錫酶制劑廠) 的酸性蛋 白酶、堿性蛋白酶和中性蛋白酶等( 劉文輝，2 0 0 3 ) ，北京東華強盛生物技 術有限公司( 原房山酶制劑總廠) 的5 7 9 酸性蛋白酶、2 7 0 9 堿性蛋白酶 和1 3 9 8 中性蛋白酶( 王彬彬，聶俊華2 0 0 9 ) 。 目前酶解處理在蛋白酶品種上的選擇，還出現(xiàn)了多酶聯(lián)合作用的研 9 蚯蚓蚯白酶解t 藝與氨基酸螯合鹽的制備及生物效心研究 究，提出由于酶的專一性，采用單酶水解時它只能從幾個固定的氨基酸殘 基進水解，因此水解率并不會特別高，而采用雙酶水解則可以提高它的水 解速度。原因為蛋白質先經酶解后，所生成的肽片斷已大大減小，消弱了 側鏈集團對肽的屏蔽保護作用，減小了它們之間的空間阻擋效應，再用另 一種酶進行水解就能使得水解較為徹底( 王文亮，2 0 0 6 ) 。c h u l a p o m k a m n e r d p e t c h ( 2 0 0 7 ) 等利用兩種蛋白內切酶( a l c 、n p d ) 和肽鍵外 切酶( f l a 、c o r ) 進行的單因素和兩因數對馬鈴薯蛋白的水解率的比較， 發(fā)現(xiàn)由于蛋白的某些特性，酶的作用程度是有很大區(qū)別的，a l c 和f l a 適合馬鈴薯蛋白的酶解，n p d 和c o r 處理的水解率就很低，最高水解率 4 4 來自2 a l c + 5 f l a ( w w ) 。王文亮( 2 0 0 6 ) 利用的胰蛋白酶和木 瓜蛋白酶的雙酶酶解研究，研究發(fā)現(xiàn)不同濃度的酶配比均對水解率有不同 程度的提高。 s t e i ni v a ra s p m o ( 2 0 0 5 ) 采用魚內臟胞外蛋白酶配以七種商業(yè)蛋白酶 每一種進行單獨組合溶解蛋白效能的研究，發(fā)現(xiàn)魚內臟胞外蛋白酶的溶解 產率達到7 5 ，雖然其他處理最高到9 5 ，提出加入外源酶是否是經濟 的考慮。 1 2 2 水解條件的優(yōu)化研究進展 1 2 2 1 影響水解率的各因素條件優(yōu)化 影響水解過程的主因素條件包括酶濃度、酶解時間、酶解溫度、底物 濃度( 王鏡巖，2 0 0 2 ；肖懷秋，2 0 0 7 ) ，還與反應體系的離子強度、產物 類型和其它組分等構成因子有關( 劉文輝，2 0 0 3 ) 。m c m a 7 r q u e z ( 1 9 9 9 ) 等人提出了酶解因素( 底物濃度、酶濃度、溫度、反應時間) 與水解度的 酶動力模型，這為簡化酶解試驗設計提供了參考，但運用的不是很廣泛。 肖懷秋等采用a s l 3 9 8 中性蛋白酶作為水解大豆分離蛋白的酶源， 通過對酶解效果和影響因素的研究，確定最佳水解工藝條件，正交試驗表 明，以溫度對水解率影響最為顯著，優(yōu)化方案為：5 底物濃度，5 0 0 0 u g ， 5 5 和水解4 5 h 。孫衛(wèi)青( 2 0 0 7 ) 探究了不同種的蛋白酶對新鮮羊骨的酶 解，提出中性酶效果理想，發(fā)現(xiàn)酶解溫度，底物濃度，酶用量對水解率有 重要影響，而作用時間和p h 的影響不顯著。木瓜蛋白酶、胰蛋白酶、枯 草桿菌蛋白酶酶解鯉魚在最佳條件下酶解效能分析可知，枯草桿菌蛋白酶 1 0 山東農業(yè)人學碩- 上學位論文 酶解效果較好( 殷金蓮，2 0 0 7 ) 。 鈉、鉀、鈣、鎂、鋅離子等均對胰蛋白酶酶解黃粉蟲蛋