（茶學(xué)專(zhuān)業(yè)論文）催化合成茶氨酸的菌株篩選與重組菌的構(gòu)建.pdf

摘要 茶氨酸 t h e a n i n e 是1 9 5 0 年首次從綠茶中分離得到的 是茶葉中的特征氨基酸 也是茶葉 的呈味物質(zhì)之一 具有很好的生理功能和商業(yè)價(jià)值 其制各研究是目前茶學(xué)研究中的一個(gè)熱點(diǎn) 由于從茶葉中提取高純度的茶氨酸 成本高昂 化學(xué)合成茶氨酸工藝較復(fù)雜 組織培養(yǎng)合成茶氫 酸產(chǎn)量低 開(kāi)展茶氨酸的生物合成研究具有重要的理論意義和實(shí)踐價(jià)值 本論文針對(duì)茶氨酸的微 生物發(fā)酵法制備技術(shù) 開(kāi)展了菌株篩選和工程菌構(gòu)建兩方面工作 將生物技術(shù)運(yùn)用到天然產(chǎn)物制 各技術(shù)中 本論文通過(guò)比較不同微生物催化l 一谷氨酰胺 l 吒l n 和鹽酸乙胺合成茶氨酸的能力 大小 對(duì)微生物進(jìn)行了篩選 明確了9 種微生物催化合成茶氨酸的能力 通過(guò)基因克隆技術(shù)構(gòu)建 了重組菌 優(yōu)化了重組菌催化合成茶氨酸的條件 重組菌株酶活達(dá)到出發(fā)菌株的1 5 倍 茶氨酸產(chǎn) 量達(dá)到2 9 4 0 9 l 主要研究結(jié)果如下 1 對(duì)9 種微生物催化l 一谷氨酰胺和鹽酸乙胺合成茶氨酸的能力進(jìn)行了測(cè)試 發(fā)現(xiàn)它們催化 合成茶氨酸的能力都很低 茶氨酸的最大生成量?jī)H為7 9 l l i g l 2 以培養(yǎng)好的西曲e 訂c 州ac o j id h 5n ec o j j d h 5n 菌液為模板進(jìn)行p c r 反應(yīng) 將擴(kuò) 增出的y 一谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶基因片斷和載體p e t 3 2 a 相連接構(gòu)建重組質(zhì)粒p e t g 6 t 將重組質(zhì)粒 p e t g g t 轉(zhuǎn)化至ec o j jb l 2 1 中 構(gòu)建重組菌 重組菌株經(jīng)0 0 5 枷i p t g 在3 2 誘導(dǎo)后 s d s p a g e 結(jié)果顯示出明顯的特征蛋白質(zhì)條帶 經(jīng)酶活性檢測(cè) 重組菌株每克濕菌體的酶活達(dá)到2 0 u 1 左 右 約是出發(fā)菌株ec o j jd h 5a 的1 5 倍 3 本實(shí)驗(yàn)優(yōu)化了重組菌催化l 一谷氨酰胺和鹽酸乙胺合成茶氨酸的反應(yīng)條件 重組菌經(jīng)3 7 培養(yǎng)2 h 左右 然后再加i p t g 至o 0 5 i h l l 于3 2 誘導(dǎo)表達(dá)4 h 收集菌體 1 m l 反應(yīng)體系 含0 3 5 ml 一谷氨酰胺 2 叫鹽酸乙胺 7 0 m g m 1 菌體 p h 9 5 于3 0 培養(yǎng)4 小時(shí) 茶氨酸的最大生成量 為2 9 4 0 9 l 即每克濕菌體可催化合成茶氨酸的量為4 2 0 9 l l 吒l n 轉(zhuǎn)化率為4 8 2 2 s u z u k i 等報(bào)道的用構(gòu)建的重組菌催化谷氨酰胺 g l n 和乙胺合成茶氨酸的量為2o 9 0 9 幾 g 1 n 轉(zhuǎn)化率為 6 0 本實(shí)驗(yàn)中的l g 1 n 轉(zhuǎn)化率稍低 但是茶氨酸產(chǎn)量有所提高 本實(shí)驗(yàn)構(gòu)建的重組菌具有較好的催化l 一谷氨酰胺和鹽酸乙胺合成茶氨酸的能力 可以嘗試 用其進(jìn)行發(fā)酵生產(chǎn)茶氨酸小試實(shí)驗(yàn) 可以嘗試將本實(shí)驗(yàn)構(gòu)建的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到不同表達(dá)載體系統(tǒng) 中 以尋找更適合y 珞氨酰轉(zhuǎn)肽酶大量表達(dá)的載體系統(tǒng) 本實(shí)驗(yàn)對(duì)于微生物發(fā)酵法工業(yè)化生產(chǎn)茶 氨酸等方面的工作具有較好的指導(dǎo)作用和實(shí)際價(jià)值 關(guān)鍵詞 篩選 茶氨酸 y 一谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶 重組菌 催化合成 a b s t r a c t t h e a i l i n e w h i c hw a sf i r s ts e p a r a t e d 行o mg r e e nt e ai n1 9 5 0 i sn o to n l ym em a i nf h e 蜘i n oa c i d c o m p o n e n to ft e a b u ta l s om em a j o ru m a r l l ic o m p o n e n to ft e a np o s s e s s e sh i g hp h y s i o l o 西c a la 1 1 d m e d i c a lb e n e f i t s t h ep r e p 鼬t i o no f t l l e a l l i n ei sar e s e 甜c hh o tp o i n t t h a ti ti sv e r yd i m c u l t 柚dm o r e e x p e 岫i v et oe x 呲iah i 曲 r 時(shí)t h e 鋤i n ed i r e c t l y 療o(wú) mt e al e a v e s t h et e c h n i c so fc h e m o s y n h e s i s m e a l l m ei sc o m p l i c a c e d t h ey i e l do f 也e 鋤i n eb y 廿s s u ec u l t i l r ei sl o w s o 廿1 eb i o s y n t h e s i so f t h e 柚i n e i sg c 砸n gm o r ea n dm o r ea t t e 確o n i nt l l i ss t u d y w es c r e e n e d 山em i c r o b ea n dc o n 蛐m c t 也e 陀c o m b i n 柚t s 訂a m t a i i n gt l l eb i a t c c h n d l o g yt ot h ep r e p 盯a t i o n0 fn a t u r a lm a t t e r i nm i sp 印e r t 1 1 es c r e e n i n go f m i c m b ew 船d o n e t l l ea b n i t yo f s y n t h e s i st h e a i l i r 圮a sac 甜a l y s to f n i n eh n d sm i c r o b ew e r ec o m p a r e d nw a sf b u n dt h a tt 1 1 ea b m l yo fn i n ek i l l d sm i c r o b ei sl a w w bc o n s 劬c l e dar e c o m b i n a n tg 廿a m t l l e c o n d n i o n so f b i o s y n m e s i st h e a i l i n ew e r eo p t i m i z 酣 t h ea c t i v i t yo f r e c o m b i l l a m 曲面ni sa b o u t1 5t i m e s h i 曲e rm 鋤廿i e 西幽眥枷c d 盯d h 5 d e c d 肛i h 5 n 1 1 1 em a i nr e s u l t sa r e f o l l o w s l t h ea b i l i t yo f s y n 血e s i st 1 1 e a l l i n e 拈ac a t a l y s to f n i n el i n d sm i c m b ew e r ec o m p a r e d i tw 器f o u n d l l l a ti i i n ek m d s 耐c m b eh a v eal o wa b i l h yo fs y n l l l e s i st l i e 柚i n e n em o s ty i e l do ft i l e 鋤i n ej so n l y 7 9 m 嘰 2 w eg o t 也eg 咖0 f t 群刪咖y 慨印印僦粥e 疳o me c o 矗d h 5 qb yp c r 耽er e c o m b i n 孤t p l 礎(chǔ)i dp e t g o tw 嬲c o n g 奸u c i e db y 也eg e mo ft 唱l u t 鋤y 1 訂a i i s p e p 乜d 觸e 孤dp e t 3 2 a t h e t e c 0 i n b 恤a mp l 蝴n i dp i 犴舶tw 勰打a n s f o n n e dt oe c d 對(duì)b l 2 1 1 g 1 1 i i a m y l 廿蜘s p e p t i d a s ew a s p r o d u c e d v i t i l0 0 5 m ml p t bi i i3 2 i n c u b 鰣o n t h ea c t i v 時(shí)o fl g 船s l lc e l l s0 f r c c o m b i n a n tg 啪l i i li s u 蚰a l l y2 0u n i t 鮒m l i ti sa b o u t1 5 廿m e sh i 曲e rt i 啪t h ee c d nd h 5 以 3 t h er c a d i 嘰c o n d m o n 矗竹s y l l 血e s i s 血e 鋤i n eo f 陀c o m b i n a n ts 刪nw e mi n v e s t i g a t e d t h e r e c o m b i n a ms 衄 mw 如i n c u b a l e da t3 7 f o r2 h n l e ni n c u b 種e da t3 2 w i t l lo 0 5 m mi p t gf o r5 h i n 1 m lr e a c 廿o ns y s i c m w h e no 3 5 ml g l nw 勰u s e d 2 o me t h y l 鋤i nh y d r o c h l o 瑚 7 0 m 咖lf r e s hc e l l s p h 9 5 鋤di n c u b a t i o na t3 0 f o r4 hw e r et l l eo p t 吼u mc o n d i d o n 1 1 1 ey i e l do f n i e 柚i n ew a s2 9 4 0 醵 e q u i v a l e n tt ol g 丘e s hc e u s c a l lp 同u c e4 2 0 班t h e a n m e t h ec o r l v e 倒o nr a t eo f 廣g 1 n 船t ot t l e 鋤i n e b e 噸4 8 2 2 c 唧a r e d 謝l l ls 1 j z i l l c i 礙p o r t 2 0 9 0 班m e a i l i n ew 船s y l l 也e s i z e d b yr e c o m b i n 枷 m i c r o b e t t l ec o n v e r s i o nr a t eo f l g i n t ot l l e a n i n eb e i n g6 0 t h er e c o m b i n a n ts 刪nh 船ag o o da b i m yo fs y n 也e s i st h e a l l i ea s ac a 塒y s t f o rt h ef l l t u r e m e e x p e r h n e n t a 廿o no f s y n t h e s i st l e a n i n eu 廿l i z i n g 廿1 er e c o m b m 柚ts 仃a hs h o u l db ed o n e t h er e c o m b i n 柚t p l a s i i l i dp e m g g ts h o u l db e 仃鋤s f 0 皿e dt 0d i 丘b r e n tc a i t i e rs t e m l o o k i n gf o rt 1 1 ec a r r i e rs y s t e mo f h i g he x p r e s s i o n 懈l u t 卸1 y l 咖s p e p t i d a s e t h i s 曲j d yh a sab e n e ri n s n u c o na n du t i l i z i n gv a l u ef o r p r o d u c e m gm e 鋤i n eo f m i c r o b e 挹r r i l e m k e yw o r d s t h e 鋤i n e s c r e e i l i i l g g l u t a m y l n 徹s p e p t i d a s e r e c o m b i n a n ts t r a i n c a t a l es y n 廿l e s i s 英文縮略表 英文縮寫(xiě)蕊文全稱(chēng) 中文名稱(chēng) a m pa m p i c i l l i n氨卞青霉素 腑 a d o s i n e 5 m p h o s p h a t e腺苷三磷酸 b pb a s e 弦i r堿基對(duì) e be i l l i d i mb r o m i d e 溴化乙錠 e d l a a t h y l e n ed i 鋤e m i n e t e 虹a a c e t i ca c i d乙二胺四乙酸 爭(zhēng)g g 下掣城a m y 銜a i l s 剛出 谷氨酰轉(zhuǎn)放酶 l g k 西u t a f n i n el 谷氨酰胺 h p l c h i 曲p e 喲m a c el i q u i dc h m a l o g r a p h y高效液相色譜法 p t g i s o p f o p y l t k o p 牡g 日l(shuí) a c t 0 s i d e 異丙基硫代 b d 半乳糖蟄 l bl w l a b e 衄d l b 培養(yǎng)基 m c 8 m u h i p l e c l 州n gs j t e多克隆位點(diǎn) o d o p d c a ld e n s 時(shí)光密度 ip c r p o l y m e r 罄ec b 斑輯a c 鑊o n蒙臺(tái)酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng) i 耶孫憾d n n n n 鈀h 銣n e t l l y l e l y l e n e d i 鋤i n en n n n 四甲基乙二胺 獨(dú)創(chuàng)性聲明 本人聲明所毓交的論文是我個(gè)人在導(dǎo)師指導(dǎo)下進(jìn)行的研究 l 作硬取得的研究成 糶 塔我所則 除了文中特別加以標(biāo)注和致謝的地方外 論文中刁 包含奠他人l 經(jīng)發(fā) 挺 e 撰o 過(guò)的研究成糶 j l 卅 包含為獲得中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院或 站 三 教阿目 構(gòu)的 化或 f 5 而使用過(guò)1 1 勺材料 與我一同t 作的同志對(duì)本研究所做的任何貢獻(xiàn)均已靠 淪文r 作了 明確的說(shuō)明并表示了謝意 研 究生簽名 諺 員動(dòng)良時(shí)間 爭(zhēng)曲紛莎月 礦h 關(guān)于論文使用授權(quán)的聲明 小人完令了解中國(guó)農(nóng) 科學(xué)院有關(guān)保留 使用學(xué)位論文的規(guī)定 u l j 小吲農(nóng) k 科 學(xué)院訂權(quán)保餾送交淪文的復(fù)印件和磁盤(pán) 允許論文被查閱和借i i 一j 以樂(lè)川始l i j 掰f 叫或掃描等復(fù)制手段保存 匯編學(xué)位論文 同意中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院可以用一i 力 式在 i 同媒體j 發(fā)表 傳播學(xué)位論文的全部或部分內(nèi)容 保密的學(xué)位論文在解密后應(yīng)遵守此協(xié)議 淪史f l j 斤鐫名 導(dǎo)師簽名 張浪 時(shí)1 1 l j 扣珞易月 l j 匆協(xié)孱6 媳 補(bǔ) 孛國(guó)農(nóng)娩辯學(xué)院碩士學(xué)位論文 第一章緒論 第一章緒論 1 1 茶氨酸研究的歷史與現(xiàn)狀 榮氨酸 t h e a n i n e 是茶葉中的特征氨基酸 也是茶葉的星味物質(zhì)之一 它是1 9 5 0 年由日本 酒戶(hù)彌 郎從玉露茶新梢中發(fā)現(xiàn)的 并命名為茶氨酸 酒戶(hù)彌二郎1 9 5 0 到目前為止 在其它 植物中很少有發(fā)現(xiàn)菸氟酸的報(bào)道 除了在葷 茶梅 蘑菇 油茶 級(jí)山茶中已檢測(cè)出微量存在外 在其它攮物中巍束發(fā)現(xiàn) 茶氨酸是茶樹(shù)中含量最高的游離氨基酸 在茶樹(shù)的薪攜棼咔中 7 0 左右 的游離氨基酸是茶氨酸 在茶鮮葉中 一般茶氮酸的含量占干重的1 2 有些名特優(yōu)茶含量可 超過(guò)2 在茶湯中 茶氨酸的浸出率可達(dá)8 0 對(duì)綠茶有重要作用 宛曉春2 0 0 3 近年對(duì)茶葉保 健成分的研究中 茶蟄e 酸是比較引人注慝的一個(gè)能奮物 它的誨多生理作用被發(fā)觀后 臺(tái)成及提 榮氨酸屬酰胺類(lèi)化合物 化學(xué)命名為 n 乙基一y l 一谷氨酰胺 n e t h y 卜y l g l u t a i n e 結(jié) 為l 黧 純晶為白色鐘狀結(jié)晶 熔點(diǎn)2 1 7 2 1 8 分解 a 鼉 7 妒 極易溶予水 面不滾 于羌永乙醇和乙醚 置溶解性 瞳溫度升高而增大 水溶液成微酸性 其有焦糖的羲睬和類(lèi)似味精 的鮮爽味 味覺(jué)閥值0 0 6 9 6 經(jīng)6 1 幾的鹽酸水解廂生成l 一谷氨酸和乙胺 茚三酮反應(yīng)成紫色 與堿式碳酸銅反應(yīng)生成淡紫色柱狀銅鹽 陳椽1 9 8 3 茶氨酸的性質(zhì)較穩(wěn)定 將茶氨酸溶液煮沸 5 畦n 或?qū)⒉璋彼崛苡枘? o 的溶液中并在2 5 下儲(chǔ)放1 2 個(gè)月 茶氪酸含量不變 因此在通常 睜食品加工 殺菌過(guò)穰中 茶氨酸的性質(zhì)不會(huì)發(fā)生變化 太入 c 棼 c 隧 c 啪o c 髭 i 豳1 1 茶氮酸結(jié)構(gòu)式 f 嚕l lm o h u l eg 響c 亡h 磚o f t k 髓j n c 輔曲y lg l u a 嘶l 船 作為茶葉的特征氨基酸 茶氨酸幾乎存在于茶樹(shù)的所有器官和組織中 經(jīng)大量研究表明 茶 氨酸在茶樹(shù)的根部形成 然后向新梢積聚 因而茶樹(shù)新梢中茶氨酸禽量最高 老葉 根部 莖部 也有少量分布 而果皮 子葉中含量媛少 茶氨酸靜形成是茶樹(shù)儲(chǔ)存氮救手段之一 這是因?yàn)椴?氨酸被荼氪酸水解酶水解為谷氨酸和也胺 乙胺在胺氧仡酶的作用下產(chǎn)生氨和乙酸 氨可作為氮 源供茶樹(shù)的幼齡組織生長(zhǎng) 因此茶氨酸是茶樹(shù)幼芽光合作用開(kāi)始前謝機(jī)碳骨架合成的起始物 而 且也是茶樹(shù)中多酚類(lèi)物質(zhì)的重要前體 張瑩等2 0 0 3 茶氨酸在茶樹(shù)中的積累與光照 溫度和合 藏前體密切捃關(guān) 研究發(fā)現(xiàn)當(dāng)溫度為2 5 黑暗條件下 在培葬基中船入鹽酸乙胺縫明顯增熱茶 中國(guó)農(nóng)業(yè)群學(xué)院碩士學(xué)霞論文 第一章緒論 氨酸的積累 1 9 9 2 年我國(guó)學(xué)者李榮林等對(duì)茶樹(shù)新梢中茶氨酸的分布情況及其在不同攀節(jié) 不同品 種弄 不同栽培條件下臺(tái)量的變化作了較全面的研究 李榮林1 9 9 2 發(fā)現(xiàn) 隨著茶樹(shù)葉片成熟度的 增抽 薈氨酸的含量逐漸降低 因疵茶氨酸可作為茶鮮時(shí)嫩發(fā)雛銫學(xué)指標(biāo)之一 茶氨酸在新樓中 的含踅隨季節(jié)的不同存在顯著的差異 其在春茶新梢中的含量是在夏茶中的4 倍 怒在秋茶中的7 倍 環(huán)境對(duì)茶氨酸含麓也有較大的影響 土壤的p h 假下降 不利于茶氨酸的積累 而氨態(tài)氮的存 在和遮蔭環(huán)境有利予茶氨酸的積累 茶b 制作過(guò)程不弼 其茶中茶氮酸的含量也蠢明顯變化 綠 茶誰(shuí)i 造過(guò)程中由于豁氬酸的轉(zhuǎn)純使茶氨酸的含量呈增加趨勢(shì) 黃茶 青茶 黑茶镥4 建過(guò)程中谷氨 酸的燮化不明顯 茶氨酸呈減少趨勢(shì) 白茶制造過(guò)瑕中茶氨酸變化的特點(diǎn)是長(zhǎng)時(shí)間的萎凋中蛋自 質(zhì)分解 谷氨酸增多并向茶氨酸轉(zhuǎn)化 因此茶氨酸開(kāi)始表現(xiàn)為增加趨勢(shì)直至干燥才有所減少 而 紅茶發(fā)酵過(guò)程茶氨酸變化復(fù)雜 有增膏減 總趨勢(shì)是減少 1 9 9 7 年鐘俊輝等研究了不薅培養(yǎng)條件 不同碳源幫不霹耀境對(duì)茶愈傷組織培養(yǎng)及萁茶氪酸的積累的影響 發(fā)覡激素i a a 積6 一默結(jié)合作用 時(shí) 以i a a 2 m g l 和6 一b a4 m g l 時(shí)對(duì)茶氨酸積累最有利 而培養(yǎng)基中碳源不同 愈傷組織的增長(zhǎng)速 率及其茶氨酸的含最的差異并不顯著 但當(dāng)用不同濃度的蔗糖作為碳源時(shí)發(fā)現(xiàn) 隨糟蔗糖濃度的 增加茶氨酸豹積累里上升趨勢(shì) 鐘俊輝等1 9 9 7 1 9 9 7 年棄桂年等駢究表明 不固工藝殺青對(duì)氨 基酸綴分含量有一定的影響 萁氨蒸羧總量和茶氨酸含量均為蒸汽蓉青 鍋炒殺脊 滾籬殺青 并且提出可通過(guò)工藝技術(shù)對(duì)茶葉中茶氨酸和其它氨慕酸的含量進(jìn)行調(diào)控 齊桂年等1 9 9 7 雖然人們普遍認(rèn)為茶氨酸可作為評(píng)價(jià)綠茶質(zhì)量的熏要標(biāo)志之一 但對(duì)紅茶茶氨酸的含量與其 品矮的相關(guān)性悶題有蕾不同的看法 e k b o 疆 o t ik l 等在對(duì)1 7 靜茶的茶氮酸禽量進(jìn)露分析時(shí)發(fā)現(xiàn) 某些級(jí)茶中茶氨酸的禽量并不斃綠茶和烏龍茶低 有的紅茶 如中國(guó)的云南茶 中荼氨酸的含量甚 至還商于某些綠茶 e k b o 學(xué)o hk h 酣廿f1 9 9 7 趙和濤等在研究茶氨酸的生化特性時(shí)測(cè)定了我國(guó) 六大榮類(lèi)中茶氨酸的含量 結(jié)果發(fā)現(xiàn)以白茶中茶氨酸的含量最高 為3 0 0 7 9 l l l g 1 0 0 9 之間 其次是 綠茶和黃茶 在1 7 3 0 1 一1 9 鰉7 m g 1 0 0 9 乏闖 紅茶相對(duì)綠茶低一點(diǎn) 為1 4 6 1 6 m g l o o g 毒茶 為6 2 7 4 m g 1 0 0 9 含量最低的是黑茶 只有7 1 1 m g l o og 這可能是由于其加王過(guò)程中特有的 渥堆作用導(dǎo)致了茶氨酸大量損失 趙和濤1 9 9 4 因此也有學(xué)者認(rèn)為榮氨酸的含量也可作為紅茶品 質(zhì)的裁要評(píng)價(jià)因子之一 1 2 茶氨酸體內(nèi)生物合成途徑 茶氨酸在茶樹(shù)根部由茶氨酸合成簿催化谷氨酸和乙胺反應(yīng)合成 然后通過(guò)枝干送至葉部 并 積慕農(nóng)葉中 芽與第一臥中含量最高 往下逐漸降低 在光照射下茶氮酸會(huì)分解為谷氨酸和乙胺 谷氨酸成為氮源 乙胺氧化后被用于合成兒茶素 如圖1 2 這個(gè)分解代謝在蔽光條件下受到抑 制 因此遮蔭栽培的茶葉中茶氨酸宙量較高 相反則是多酚類(lèi)含景商 楊賢強(qiáng)1 9 8 2 村松敬一郎 1 9 9 1 日本的玉露 輾茶 抹茶原料 的栽培就是采用遮贅?lè)ㄒ蕴岣卟枞~中茶氨酸含量 2 乏妊 善簍 二二 西氯t 磐囂穗 聿 r 乙胺 知幾縈囊 驀?yán)?二二二 冒1 2 茶戴馥在茶樹(shù)體內(nèi)代謝途徑 f 培1 2 硪t e 髓i n e m d 曲0 1 i s m 軸v i v i d t e 8 p l b n t 茶樹(shù)中茶氨酸合成產(chǎn)蘸體是谷氨敬和己胺 這一點(diǎn)己用1 示蹤的方法得剄7 證實(shí) t 呔e ot 1 9 7 4 竹尾忠一1 9 8 1 乙胺是由丙氨酸脫羧而來(lái) t a d a i c a z u t1 9 7 4 丙氨酸和谷氨酸雖然廣泛 存在子各種動(dòng)植物體內(nèi) 但卻只有茶樹(shù)才獒有大憊合成茶氨酸的能力 這是因?yàn)椴铇?shù)體內(nèi)其有l(wèi) 谷氨酸 乙胺連接酶 l g l u t a t e e t h y l i n e1 i g s e 又稱(chēng)茶甄醒合成酶 該酶催化如下反 應(yīng) l 谷氨酸 乙胺 a t p 茶氨酸十a(chǎn) d p 磷酸 該酶己波k s a s a o k a 等從茶的籽根中分離出來(lái) 并證實(shí)對(duì)谷氨酸 乙胺和盯p 共有較商的特異紊和力 豆僅海茶樹(shù)所特有 值該酶在體外板易失 活 s u s k ak 1 9 6 5 茶氨酸體內(nèi)合成過(guò)程中另一重要的酶是丙氨酸脫羧酶 卜a l a m i n e d e c a r b o x y l a s e 它催化丙氨酸脫羧形成乙胺 在體外的穩(wěn)定性比茶氨酸合成酶要嵩得多 1 3 茶氯酸的生理功能研究與開(kāi)發(fā)利用前景 從茶氨酸自發(fā)現(xiàn)以來(lái) 一越是被作為茶時(shí)的主要品度成分廣為磷究 近尼年來(lái) 茶氨酸其有 的一些特殊生理功能不斷地被發(fā)現(xiàn)和研究 特別是其具有的藥用功能成為研究的熱點(diǎn) 茶氨酸的 主要生理功能有 1 降赧壓作嗣 敞o g o s h ih 等擐道了茶氨貔對(duì)先天性高血壓患者具有降壓俸用 y o k o g o s h i h1 9 9 8 a 血壓是通過(guò)人體的中樞及末梢神經(jīng)系統(tǒng)的遞質(zhì)兒茶酚胺和5 一羥基色胺的分泌量來(lái)調(diào)節(jié) 的 y o k o 9 0 8 h ih 等通過(guò)實(shí)驗(yàn)證明 服用茶氨酸后5 一羥基色胺在老鼠大腦中的含成減少了 且增 加了5 一羥基色胺在老鼠丈藏中翡分解 老瓤肄魂豹5 一羥基色胺的含量驤顯降低 在給自發(fā)襤嵩盤(pán) 壓老鼠注射不同劑量的茶氨酸時(shí) 血壓也量下降趨勢(shì) 并且下降的撩度與注射的荊量呈正比關(guān)系 但茶氨酸對(duì)血壓正常的犬鼠沒(méi)有降巔壓作用 y o i 0 9 0 s h ih1 9 9 8 b 2 增強(qiáng)抗葺孛癌藥物的療效 近期的研究表明荼氨酸本身壕無(wú)抗舯癌活動(dòng) 卻斃提高多種抗辨 瘤藥物的療效 抗癌藥毒殺索 d o x o r u b i c i n 與茶氨酸配合應(yīng)用時(shí) 可抑制m 5 0 7 6 卵巢內(nèi)癟向肝 臟轉(zhuǎn)移 當(dāng)將茶氨酸與抗癌藥阿霉 d o x o r u b i c i n d 0 x 同時(shí)使用時(shí) 增強(qiáng)了阿霉索抗癌的功效 茶氨酸因囂被認(rèn)為具有騎癌抗癭的作用 s 勰邵k a y d 胡9 9 8 2 0 0 2 茶氨酸每d 0 x 一起使朔時(shí) 3 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院碩士學(xué)位論文 第一章緒論 不但提高d 0 x 的抗腫瘤活性 而且還提高其抑制腫瘤轉(zhuǎn)移活性 其原理均為防止d 0 x 從腫瘤細(xì)胞中 流出 從而提高了d o x 在腫瘤細(xì)胞中的濃度 s u 舀y a r n a t 甜口f1 9 9 9 2 0 0 1 年 s a d z u k ay 等研究了 茶氨酸提高抗癌藥阿霉素 d 0 x 抗癌活性的途徑 s a d z u l a y 甜甜2 0 0 1 研究認(rèn)為谷氨酸鹽進(jìn)入 細(xì)胞后生成谷胱甘肽 谷胱甘肽會(huì)與抗癌藥結(jié)合而被泵出細(xì)胞外 而茶氨酸能減少細(xì)胞對(duì)谷氨酸 的吸收 使細(xì)胞中谷胱甘肽的生成量減少 從而抑制了抗癌藥物的流出 z h a n gg 等研究了綠茶粉 末 p g t 和茶氨酸的直接抗癌作用 指出它們對(duì)惡性腫瘤和由惡性腫瘤引發(fā)的高血脂具有抑制作 用 z h g g 酊口j 2 0 0 2 3 松弛神經(jīng)緊張 焦慮等作用 t e r a s h i m a 等人發(fā)現(xiàn)茶氨酸的主要受體是腦 茶氨酸通過(guò)大 腦屏障進(jìn)入大腦后 使大腦細(xì)胞中線(xiàn)顆粒內(nèi)的神經(jīng)遞質(zhì)多巴胺顯著增加 而多巴胺是腎上腺素和 去甲腎上腺素的前驅(qū)體 是傳達(dá)腦神經(jīng)細(xì)胞興奮程度的重要物質(zhì) 它的釋放會(huì)大大影響人的情緒 t e m s h i i n a t 甜甜1 9 9 9 另外 y o k o g o s h i 等人通過(guò)使用血清素 5 一羥色胺 代謝抑制劑研究發(fā) 現(xiàn)茶氨酸可對(duì)大腦血清素的合成和分解產(chǎn)生影響 服用茶氨酸后 大腦中色氨酸的含量明顯增加 或有增加趨勢(shì) 可使血清素的含量減少 茶氨酸可能會(huì)減少血清數(shù)的合成及增加其分解 或抑制 血清素的釋放 y o k o g o s h i h 甜講1 9 9 8 咖啡因有提神興奮的作用 茶葉中也含有較多的咖啡因 單獨(dú)攝入咖啡因?qū)θ梭w有一定的危 害 而飲用茶后 卻不會(huì)產(chǎn)生飲入等量咖啡因的興奮作用 1 9 7 5 年木村等人研究證明了茶氨酸對(duì) 咖啡因產(chǎn)生的興奮有拮抗作用 木村趙平等1 9 7 5 2 0 0 0 年有學(xué)者用腦電圖儀評(píng)價(jià)方法進(jìn)一步確定 茶氮酸和咖啡因在幾乎相同摩爾濃度的情況下 對(duì)咖啡因的刺激作用產(chǎn)生拮抗 這也是飲茶后能 使人心情平靜 情緒穩(wěn)定的原因 k a k u d a t 2 0 0 0 有報(bào)道指出茶氨酸能促進(jìn)大腦皮層產(chǎn)生n 波 而n 波的產(chǎn)生是人身體產(chǎn)生舒暢 愉快感覺(jué)的標(biāo)志 并且茶氨酸沒(méi)有引起睡眠狀態(tài)時(shí)發(fā)生的 波 的數(shù)量的增加 因此茶氨酸在使人情緒穩(wěn)定的同時(shí)還能使注意力更集中 4 對(duì)腦神經(jīng)細(xì)胞保護(hù)作用 谷氨酸是興奮神經(jīng)傳遞物質(zhì) 在神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)含量保持在1 1 0 m o l 幾 在細(xì)胞外為1 2 岫o l 幾 當(dāng)腦缺血時(shí) 細(xì)胞內(nèi)因0 2 供應(yīng)中斷 使細(xì)胞內(nèi)的能源物質(zhì)a t p 生成量減少而逐步枯竭 神經(jīng)細(xì)胞膜分離 谷氨酸過(guò)多的向細(xì)胞外釋放 并作用于受體 使細(xì)胞 內(nèi)鈣離子濃度持續(xù)增高 激發(fā)各種分解酶的活性 并最后作用于細(xì)胞而使之破壞 死亡 而茶氨 酸對(duì)谷氨酸受體有競(jìng)爭(zhēng)保護(hù)作用 因此茶氨酸對(duì)腦組織有保護(hù)作用 可避免由腦缺血所致腦神經(jīng) 細(xì)胞死亡 而腦缺血所致的腦神經(jīng)細(xì)胞死亡是腦梗塞 腦中風(fēng)和血管性癡呆癥主要病因 凌關(guān)庭 2 0 0 3 5 促進(jìn)大腦功能作用 茶氨酸能影響人體大腦的功能 服用茶酸后 人的記憶力能得到提高 這是由于茶氨酸影響了與學(xué)習(xí) 記憶有關(guān)的腦內(nèi)中樞神經(jīng)遞質(zhì)5 羥色胺的活性 茶氨酸能活化5 一 羥色胺 杜榮茂等2 0 0 2 6 改善經(jīng)期綜合癥 經(jīng)期綜合癥 簡(jiǎn)稱(chēng)p m s 是女性在月經(jīng)前3 到1 0 日中出現(xiàn)的精神及身 體上的不舒適的癥狀 j u n e j a 等考察了茶氨酸對(duì)p m s 的改善作用 讓2 4 名女性每日服用茶氨酸 2 0 0m g 兩個(gè)月后p m s 癥狀有明顯改善 具體有頭痛 腰痛 胸部脹痛 無(wú)力 易疲勞 精神無(wú) 法集中 煩躁等癥狀得到改善 呂毅等2 0 0 3 其機(jī)理還需進(jìn)一步調(diào)查 可能與茶氨酸的鎮(zhèn)靜作 用有關(guān) 7 減肥作用 用混有o 0 2 8 嘲 氨酸的飼料喂養(yǎng)小鼠1 6 周后 其體重比對(duì)照群有明顯減少 腹腔脂肪減少到對(duì)照群的5 8 同時(shí)血液中脂肪級(jí)膽固醇減少了2 8 因此 茶葉的減肥作用是 4 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院碩士學(xué)位論文第一章緒論 指茶葉中包括茶氨酸在內(nèi)的多種成分共同作用的結(jié)果 研究發(fā)現(xiàn)茶氨酸尤其對(duì)減少體內(nèi)膽固醇有 效 呂毅等2 0 0 3 8 抗疲勞作用 王小雪等研究了茶氨酸的抗疲勞作用 小鼠經(jīng)口給予茶氨酸3 0 h 后 采用負(fù) 重游泳實(shí)驗(yàn) 觀察記錄小鼠游泳死亡時(shí)間 小鼠游泳一定時(shí)間后采血檢測(cè)清尿素氦 血乳酸 取 肝臟檢測(cè)肝糖原 結(jié)果經(jīng)口給予小鼠不同劑量的茶氨酸3 0 h 后 能明顯延長(zhǎng)小鼠負(fù)重游泳時(shí)間 減 少肝糖原的消耗量 降低運(yùn)動(dòng)時(shí)血清尿素氮水平 對(duì)小鼠運(yùn)動(dòng)后血乳糖升高有明顯的抑制作用 能促進(jìn)運(yùn)動(dòng)后血乳酸的消除 王小雪等2 0 0 2 李敏等研究指出 茶氨酸具有延緩運(yùn)動(dòng)性疲勞作 用 其機(jī)制可能與茶氨酸增加腦組織中d a 多巴胺 含量 抑制5 一h t 5 一羥色胺 的合成和釋放 等效應(yīng)有關(guān) 李敏等2 0 0 5 9 提高免疫力 防御病毒 2 0 0 3 年5 月美國(guó) 國(guó)家科學(xué)院進(jìn)度報(bào)告 發(fā)表了哈佛大學(xué)研究 人員k a a t ha 等就茶氨酸在人體肝臟分解為乙胺和谷氨酸后 前者調(diào)動(dòng)了 伽瑪一德耳塔1 型 細(xì)胞 這種人體血液免疫細(xì)胞作出抵御外界侵害的反應(yīng) 成為抵御放大細(xì)菌 病毒因子的第一道 防線(xiàn) 繼而t 型細(xì)胞促進(jìn)干擾紊的分泌量激增5 倍 對(duì)細(xì)菌的殲滅反應(yīng)提高1 0 倍 可是喝咖啡 者的免疫細(xì)胞的干擾素分泌量沒(méi)有變化 k a m a t h a b 口 2 0 0 3 這種調(diào)節(jié)機(jī)體免疫系統(tǒng)的功能 使茶中的 l 茶氨酸 可制成藥物以提高體內(nèi)的抗傳染能力 b u k o w s k ij f 酣口f1 9 9 9 美國(guó)的科學(xué)家研究發(fā)現(xiàn)榮氮酸可以讓人體對(duì)疾病的抵抗力提高五倍 這種物質(zhì)具有調(diào)動(dòng)免疫 細(xì)胞活力的功能 從而使肌體可以更好地抵抗細(xì)菌 病毒 真菌等 可以預(yù)計(jì)未來(lái)有一天會(huì)把這 種物質(zhì)轉(zhuǎn)化成治療藥物 尤其在s a r s 期間 國(guó)內(nèi)外專(zhuān)家都提出 飲用綠茶有助于增起人體免疫 力 預(yù)防傳染病 美國(guó)的最新研究 這些可能均與茶氨酸的作用有關(guān) 哈佛醫(yī)學(xué)院布考斯基博士 通過(guò)對(duì)志愿者進(jìn)行測(cè)試 證明茶氨酸可以通過(guò)調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞來(lái)增強(qiáng)人體的免疫系統(tǒng) 抵抗致病微 生物如病毒 細(xì)菌 真菌的入侵 林智2 0 0 3 茶氨酸除了具有i l 上藥用價(jià)值外 在食品領(lǐng)域也有很好的應(yīng)用價(jià)值 早在1 9 8 5 年 美國(guó)食品 和藥物管理局 f d a 就認(rèn)可了茶氨酸 并確認(rèn)人工合成茶氨酸是一種公認(rèn)安全的物質(zhì) g r a s 在使用過(guò)程中不作限制用量的規(guī)定 其安全陛實(shí)驗(yàn)表明 茶氨酸的大鼠急性毒性在5 9 k g 以上 連 續(xù)服用2 8 天 每天2 9 k g 茶氨酸的亞急性實(shí)驗(yàn)中 大鼠未見(jiàn)任何毒性反應(yīng) 在致突變實(shí)驗(yàn)中也沒(méi) 有發(fā)現(xiàn)茶氨酸的任何誘變作用 細(xì)菌恢復(fù)突變實(shí)驗(yàn)也證明未導(dǎo)致基因變異 良好的安全性和穩(wěn)定 性 使茶氨酸已在食品如飲料 焙烤點(diǎn)心 冷凍點(diǎn)心等中得到廣泛的應(yīng)用 可被用作飲料的品質(zhì) 改良劑 功能性食品的添加劑 風(fēng)味改鏖劑 茶氨酸是一種安全 無(wú)毒 具有多種生理功能的茶葉天然產(chǎn)物 具有廣闊的開(kāi)發(fā)前景 總的 來(lái)說(shuō) 在技術(shù)方面 利用生物技術(shù)獲得更多的茶氨酸 其中微生物發(fā)酵法生產(chǎn)茶氮酸具有很好的 發(fā)展前景 在應(yīng)用方面 除作為食品添加劑外 應(yīng)開(kāi)發(fā)功能性食品 拓寬茶氨酸在食品領(lǐng)域的應(yīng) 用 在開(kāi)發(fā)方面 利用茶氨酸的特殊生理功能 開(kāi)發(fā)功能性藥物 降低血壓 治療腫瘤 預(yù)防老 年癡呆癥等 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院碩士學(xué)位論文第一章緒論 1 4 茶氪酸制備技術(shù)的研究 1 4 1 提取分離技術(shù) 1 4 1 1 特殊試劑沉淀法提取茶氨酸 特殊試劑沉淀法是采用某些有機(jī)或無(wú)機(jī)試劑與相應(yīng)氨基酸形成不溶性衍生物的一種分離方 法 茶氨酸與堿式碳酸銅生成淡紫色柱狀銅鹽 利用此性質(zhì)可將茶氨酸分離 傳統(tǒng)的提取方法是 因茶葉中存在的游離氨基酸為水溶性的 選用熱水浸提 用醋酸鉛沉淀去除茶湯中的蛋白質(zhì) 多 酚類(lèi)和部分色素 通地s 去除過(guò)剩的鉛 用氯仿萃取去除咖啡堿 茶湯中茶氨酸經(jīng)堿式碳酸銅成 鹽后 過(guò)濾除去其它組分 茶氨酸銅鹽經(jīng)稀硫酸溶解 加入h z s 和適量b a 0 l i 抽濾去濾渣 濃 縮 精制后得天然茶氨酸純品 但是此法收率較低 引入雜質(zhì)重金屬離子p 礦 c u 2 用硫化氫除 p b c 一 硫化氫制氣比較麻煩 后又加入b a o 1 沉淀硫酸根離子 工序較多 茶氨酸銅鹽 在稀硫酸中溶解度不大 為使銅鹽溶解 加入稀硫酸量相當(dāng)大 這樣造成除銅鹽硫酸根時(shí) 形成 大量硫酸鋇沉淀 且造成茶氨酸損失 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院茶葉研究所1 9 8 3 1 4 1 2 離子交換法提取茶氨酸 離子交換技術(shù)是氨基酸工業(yè)中應(yīng)用最為廠泛的提取方法之一 同其它氨基酸一樣 茶氨酸作 為兩性物質(zhì) 選擇適當(dāng)?shù)膒 h 值 用離子交換樹(shù)脂也可以分離提取茶氨酸 但這方面的報(bào)道很少 僅1 9 9 8 年陳瑛等報(bào)道了用離子交換法提取茶氨酸 他們選用國(guó)產(chǎn)7 3 2 陽(yáng)離子交換樹(shù)脂 從茶愈傷 組織浸提液中提取茶氨酸 通過(guò)靜態(tài) 動(dòng)態(tài)實(shí)驗(yàn) 對(duì)洗脫液的p h 離子強(qiáng)度 樣液濃度和流速等 因素進(jìn)行了考察 比較了在不同條件下 樹(shù)臘對(duì)茶氨酸的吸附情況 茶氨酸的得率為7 0 陳瑛 等1 9 9 8 a 由于茶葉中茶氨酸的含量不高 單純的從茶葉中提取茶氨酸成本很高 但是 從提取茶多酚 后的殘留液中用離子交換樹(shù)脂提取茶氨酸 卻是一項(xiàng)很有經(jīng)濟(jì)價(jià)值的工藝技術(shù) 對(duì)茶葉加工生產(chǎn) 廠家來(lái)說(shuō) 這將為茶葉的綜合利用與開(kāi)發(fā)提供新的方向 此外 2 0 0 4 年張瑩等對(duì)茶氨酸在制各色譜分離時(shí)其在反相c 一 色譜分離柱上的熱力學(xué)及動(dòng)力學(xué) 色譜行為進(jìn)行了研究 結(jié)果表明 為提高茶氨酸產(chǎn)率 以采用體積超載方式為好 并可采用峰寬 對(duì)體積超載進(jìn)行表征 當(dāng)w 增寬1 5 2 0 時(shí) 表示色譜柱處于體積超載狀態(tài) 為提高制備量 可采 用較大顆粒的填料 張瑩等2 0 0 4 1 4 2 化學(xué)合成技術(shù) 茶氨酸傳統(tǒng)合成制法是谷氨酸的吡咯烷酮化 1 9 4 2 年以色列人l i c h t e n s t e i n 首次在實(shí)驗(yàn)室 中用乙胺和吡咯烷酮酸在水溶液中反應(yīng)得到茶氨酸 1 9 5 1 年 日本的橋爪斌改進(jìn)了合成方法 即 用l 毗咯烷酮酸與純乙胺 而不是在水溶液中 放置 以提高茶氨酸產(chǎn)率 橋爪斌1 9 5 1 1 9 6 1 年 6 孛囂農(nóng)她群學(xué)院碩士學(xué)往論文 第一章緒論 y y a l i l d a 等利用反應(yīng)物與生成物之間溶解性的差異 將l 吡咯烷酮酸先形成銅鹽 再與純乙胺 反應(yīng)合成了茶氨酸 丈大提高了反應(yīng)的收率 y a i i l d aye t 舒1 9 6 1 2 0 0 3 年 y 脒s h o uh e 等報(bào) 道了一耱改連的茶氨酸 一谷醛基乙胺 豹合成方法 包括卜答氨酸自孽去氫成為嗽咯靛醺羥酸 p c a 然后再加純的乙胺 9 9 氣 液 反應(yīng) 得率9 2 6 稃在8 4 乙醇溶液中重結(jié)晶后 高純度茶氨酸 a 型 的得率3 7 4 8 型茶氨酸從l p c a 合成 用h p l c 分析證明 a 和b 型茶氨 酸是混合異構(gòu)體 a 型含4 7 9 的l 一蕊氨酸 b 型含9 0 9 的l 茶氨羧 y a n s h o u ee 2 0 0 3 套氨酸的虢咯烷黎優(yōu)并菲是臺(tái)成茶氨酸的唯一方法 t f u y 柵8 等于1 9 6 4 年采用 硫化碳保 護(hù)a 氨基而合成了茶氨酸 1 9 6 5 年 n l i c h t e n s t e i n 改用谷氨酸乙醛為原料 用鈀碳催化還原 合成茶氨酸 并在以色列申請(qǐng)了專(zhuān)利 n l i c h t e n s t e i n1 9 6 5 2 0 0 1 年王三永等先將l 一谷氨酸與 無(wú)水矗醇反應(yīng)生成l 一貉氨酸一y 一乙慕酯 再用三苯基氧甲烷保護(hù)氨基后 與乙胺反盛生成n 三苯 甲基一b 一谷氨酸一y z t 黻 最后除去量苯甲基褥至l 茶氨酸 魏法的特點(diǎn)為反應(yīng)中閡產(chǎn)物無(wú)需分離 提純就可進(jìn)行下一步操作 比較簡(jiǎn)便 王三永等2 0 0 1 2 0 0 5 年 錢(qián)紹松等以廉價(jià)的l 一谷氨酸為原 料 采用鄰苯二甲酰慕作為保護(hù)基 保護(hù)l 一谷氨酸的d 氨基 醋酐回流1 0m i n 使其分子內(nèi)脫水生成 n 鄰舉二甲酰一卜谷氮潑醞在常溫 常壓條件下 分別與2m o l l 氨水和2m o l l 乙胺水溶液反應(yīng)生 成中問(wèn)產(chǎn)物舯鄰苯二甲酰 l 一谷氨酰胺 鄰苯二甲酰一卜荼氨酸 中間產(chǎn)物在室溢條件下與o 5 m 0 1 l 水合肼反應(yīng)4 8 h 脫除保護(hù)基 分別以5 7 6 1 的收率得到l 谷氨酰胺和l 一茶氮酸 錢(qián)紹松等 2 0 0 5 目前 丑本雙筠化生產(chǎn)流程考慮 仍然采用l 一谷氨酸加熱脫水生成l 啦咚烷酮酸 然后再與 無(wú)水己胺反應(yīng)生成茶氨酸 化學(xué)合成手段制備茶氨酸成本低 操作復(fù)雜 魘應(yīng)條件苛刻 化學(xué)合成制造的都是d l 型消 旋體 需要進(jìn)行拆分才能得到l 型產(chǎn)品 日本學(xué)者在這方面進(jìn)行了大量工作 他們采用微生物固 化酶分離d l 一型氨慕酸彀褥了成功 1 4 3 組織培養(yǎng)技術(shù) 棱物組織培養(yǎng)合成茶氨酸是采用茶樹(shù)細(xì)脆或茶樹(shù)愈傷組織培葬來(lái)產(chǎn)生茶氨酸 然后透過(guò)離子 交換法提取茶氨酸 1 9 9 0 年o r i h 8 r ay 等采用茶樹(shù)細(xì)胞培養(yǎng)生產(chǎn)茶氨酸和其它y 一谷氨酰衍生物 發(fā)現(xiàn)在2 5 下 黑暗中振蕩培養(yǎng)能獲得最高的茶氨酸含量 0 r i h a r a ye ta 兒9 9 0 同年m a t s v v r a t 等研究了合成前體 光照和溫度對(duì)茶樹(shù)愈傷組織中茶氨酸積累的影響 發(fā)現(xiàn)在培養(yǎng)基中加入濃 度為2 5 刪螅鹽酸乙胺 2 5 黑跨條律下 斃壤耱茶氨酸積累 據(jù)囂本報(bào)道 采用3 g 新鮮細(xì)胞 在5 0 l 培養(yǎng)液中 2 5 懸浮培養(yǎng)4 7 天 培養(yǎng)液經(jīng)提取 濃縮和干燥 可得純度8 0 左右粗茶氨酸 4 8 1 9 產(chǎn)量比愈傷組織培養(yǎng)法提高約1 倍 鐘俊輝等對(duì)不躁培養(yǎng)條件下愈傷組織生長(zhǎng)及茶氨酸積累情況進(jìn)行了研究發(fā)現(xiàn) 不同碳源對(duì)愈 傷組織生長(zhǎng)及茶氨酸積累相近 增加耱濃度有稠于次生代謝物翦積累 愈往組織的凝適培莽溫度 和榮氨酸積累溫度都是2 5 暗培養(yǎng)更有利于茶氨酸的積累 鐘俊輝筠1 9 9 7 1 9 9 8 年陳瑛等研究 了多種激素對(duì)愈傷組織合成茶氨酸的影響 試驗(yàn)證明 以4 m g l6 一b a 十2 口l g li 從或3 m g l6 b a 十1 5 m g 幾i a a 十2 m g lt a 的組合 添加于璐培養(yǎng)基上 茶愈傷組織嫩長(zhǎng)和茶氨酸積累均皂好 茶 氨酸禽量最離可達(dá)1 7 0 m g g 陳臻等1 9 9 8 7 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院碩士學(xué)位論文第一章緒論 成浩 高秀清對(duì)不同外植體來(lái)源的茶樹(shù)培養(yǎng)細(xì)胞的茶氨酸生物合成能力 適宜培養(yǎng)細(xì)胞合成 茶氨酸的培養(yǎng)基條件 培養(yǎng)細(xì)胞茶氨酸生物合成動(dòng)態(tài)和更新培養(yǎng)基對(duì)提高培養(yǎng)細(xì)胞茶氨酸累積含 量的效果等進(jìn)行了分析 結(jié)果表明 在一個(gè)培養(yǎng)周期中 培養(yǎng)細(xì)胞的茶氨酸累積高峰出現(xiàn)在第1 1 d 左右 在以每1 0 d 更新 次培養(yǎng)基的條件下 培養(yǎng)細(xì)胞茶氨酸合成能力可維持在第3 0 d 達(dá)到細(xì)胞 干重的近2 0 9 6 成浩等2 0 0 4 呂虎等進(jìn)行了茶葉細(xì)胞發(fā)酵罐懸浮培養(yǎng)試驗(yàn) 結(jié)果表明 發(fā)酵罐放大培養(yǎng)取得了與搖床懸浮 培養(yǎng)類(lèi)似的效果 從茶氨酸生產(chǎn)效率來(lái)看 細(xì)胞培養(yǎng)周期以2 0 2 2 d 為宜 發(fā)酵罐大規(guī)模培養(yǎng)時(shí)采 用槳葉式攪拌器 細(xì)胞增長(zhǎng)量和茶氨酸合成量?jī)?yōu)于標(biāo)準(zhǔn)板攪拌器先加入一定量鹽酸乙胺再每天進(jìn) 行少量補(bǔ)充 茶氨酸合成量比一次性加入的效果要好 并且培養(yǎng)基中鹽酸乙胺濃度維持在20 l i i m 0 l l 以上時(shí)茶葉愈傷組織的茶氨酸合成量和細(xì)胞生長(zhǎng)量即可保持良好狀態(tài) 呂虎等2 0 0 5 組織培養(yǎng)合成茶氨酸由于產(chǎn)量低 最高達(dá)1 9 4 1 6 m g g 干細(xì)胞重 產(chǎn)品分離純化過(guò)程復(fù)雜及 生產(chǎn)工藝的控制難度大等限制了該方法的工業(yè)化 m a t s u u r a t1 9 9 4 1 4 4 微生物發(fā)酵技術(shù) 隨著生物技術(shù)的發(fā)展和應(yīng)用 利用微生物發(fā)酵來(lái)生產(chǎn)酶 進(jìn)而利用酶的提取物來(lái)進(jìn)行目的物 的生產(chǎn)越來(lái)越被廣泛地應(yīng)用 與化學(xué)合成法相比 微生物發(fā)酵法生產(chǎn)茶氨酸具有完全不同的特色 由于酶促反應(yīng)所具有的高度專(zhuān)一性 所以無(wú)需對(duì)n 一氨基進(jìn)行乙胺基化 但是由于生物體內(nèi)合成茶 氨酸需要a t p 水解成a d p 來(lái)提供能量 而 t p 的獲得與再生要靠葡萄糖的降解來(lái)推動(dòng) 因此 茶氨酸 的合成反應(yīng)必須與葡萄糖的降解反應(yīng)相偶聯(lián) 微生物發(fā)酵合成茶氨酸的反應(yīng) 實(shí)際上是運(yùn)用微生 物中的谷氨酰胺酶在特殊的條件下 高乙胺濃度和特定的p h 值 進(jìn)行的非特異反應(yīng) 而該酶在通常 情況下對(duì)氮的親和力比乙胺大得多 1 9 9 3 年日本報(bào)道了已應(yīng)用于實(shí)際生產(chǎn)的酶促合成茶氨酸的反應(yīng) 利用的是細(xì)菌中的谷氮酰胺 酶在特殊條件下 高乙胺濃度和特定的p h 值 進(jìn)行的非特異反應(yīng) a b e l i m 甜口 1 9 9 3 具體方 法是先將一種硝基還原假單胞z 細(xì)菌i f 0 1 2 6 9 4 p s e u d o m o n a sn i t r o r e d u c e n s 培養(yǎng)物懸浮在0 9 n a c l 溶液中 將4 5 k 角叉菜膠在8 0 下溶解并冷卻至4 5 時(shí)與細(xì)菌懸浮液混勻 使細(xì)菌固 定成直徑3 的顆粒 填充于四根1 7 4 0 c m 的柱型反應(yīng)器中 以0 7 m m 乙胺和0 3 刪l 一谷氨 酰胺為底物 在o 0 5 刪硼酸緩沖液 p h 9 5 中 3 0 條件下 底物以0 3 個(gè)床體積每小時(shí)通過(guò)反 應(yīng)器 該方法制各的反應(yīng)器活性可持續(xù)幾個(gè)星期以上 預(yù)計(jì)生產(chǎn)半衰期可達(dá)1 2 0 次反應(yīng) 第5 1 次反應(yīng) 茶氨酸的產(chǎn)量仍可達(dá)到4 0 m 0 1 h 粗產(chǎn)物用離子交換柱層析就可分離出茶氨酸 得率可 達(dá)所消耗谷氨酸的9 5 左右 而此法嚴(yán)格而言為半生物合成 并因底物試劑乙胺和谷氨酰胺的消 耗及反應(yīng)周期較長(zhǎng)提高了成本 同時(shí)該酶在通常情況下對(duì)氨的親和力比乙胺大得多 h i d e y u k is u z u k i 等報(bào)道了利用從細(xì)菌中得到的谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶作催化劑 將2 0 0 m m 谷氨酰胺 和1 5m 乙胺在p h 為1 0 溫度為3 7 的條件下 保持5 小時(shí) 獲得1 2 0 m m 茶氨酸 轉(zhuǎn)化率為6 0 h i d e y u j c is u z u l i 甜可2 0 0 2 采用微生物發(fā)酵法可直接得到l 茶氨酸 可大量生產(chǎn)茶氨酸 適合工業(yè)化生產(chǎn) 但設(shè)備規(guī)模 較龐大 成本相對(duì)較高 8 串霜農(nóng)盈科學(xué)院碩士學(xué)位論文 第一章緒論 1 5 茶氨酸測(cè)定方法 茶氨羧的測(cè)定方法有綴多種 婦堿式碳酸銅沉淀法 芬三弱顯色的薄層色譜法 強(qiáng)酸性陰離 子交換樹(shù)脂層析法 氣相色譜法 磷效渡相色譜法 膠束電動(dòng)毛緞色譜分析法 紫外光吸收光譜 法 曰立8 3 5 5 0 型 氨基酸自動(dòng)分析儀 紅外線(xiàn)分光