miRNA及其發(fā)展和應(yīng)用.ppt

miRNA及其研究和應(yīng)用 謝東君2015202030079 RNA在生命過(guò)程中的作用 mRNA 合成蛋白質(zhì)的藍(lán)圖rRNA 合成蛋白質(zhì)的工廠(chǎng)tRNA 合成蛋白質(zhì)的搬運(yùn)工miRNA 被關(guān)注的RNA研究 2000年 RNAi的研究進(jìn)展被Science雜志評(píng)為重大科技突破 2001年 RNAi作為當(dāng)年最重要的科學(xué)研究成果之一 再次入選 十大科技突破 2002年12月20日 Science雜志將 SmallRNA RNAi 評(píng)為2002年度最耀眼的明星 同時(shí) Nature雜志亦將SmallRNA評(píng)為年度重大科技成果之一 2003年 microRNA的研究第四次入選 十大科技突破 2005年 microRNA的研究第五次入選 十大科技突破 2006年 RNAi獲得當(dāng)年的諾貝爾生理學(xué)或醫(yī)學(xué)獎(jiǎng) 并且microRNA的研究第六次入選 十大科技突破 RNA研究的突破性進(jìn)展 是生物醫(yī)學(xué)研究領(lǐng)域近20年來(lái) 可與HGP相提并論的最重大成果之一 什么是miRNA miRNA的發(fā)現(xiàn) miRNA的產(chǎn)生過(guò)程 miRNA的作用機(jī)制 miRNA的特點(diǎn) 與其他寡核苷酸相比 主要有三點(diǎn)不同 沒(méi)有開(kāi)放閱讀框架及蛋白質(zhì)編碼基因的特點(diǎn)通常的長(zhǎng)度約為22個(gè)核苷酸 但在3 端可以有幾個(gè)堿基的長(zhǎng)度變化成熟的miRNA5 端有一磷酸基團(tuán) 3 端為羥基 miRNA的生物學(xué)功能 miRNA的保守性 miRNA靶基因的尋找 盡管數(shù)百種miRNA在最近幾年中被發(fā)現(xiàn)了 但是只有非常少量的miRNA被確定其作用 許多其他的miRNA基因的作用還沒(méi)有被闡明 因此發(fā)現(xiàn)miRNA的作用靶點(diǎn)成為了解其在不同的生理過(guò)程中的功能的關(guān)鍵 目前主要利用生物信息學(xué)方法和生物學(xué)實(shí)驗(yàn)方法尋找miRNA的靶基因 生物信息學(xué)方法尋找miRNA靶基因 生物信息學(xué)方法主要是利用某種算法對(duì)靶基因樣本進(jìn)行評(píng)分及篩選 主要遵循以下幾個(gè)常用原則 miRNA與其靶位點(diǎn)的互補(bǔ)性miRNA靶位點(diǎn)在不同物種之間的保守性miRNA mRNA雙鏈之間的熱穩(wěn)定性miRNA靶位點(diǎn)處不應(yīng)有復(fù)雜二級(jí)結(jié)構(gòu)miRNA5 端與靶基因的結(jié)合能力強(qiáng)于3 端常用的算法有 miRanda TargetScan RNAhybrid PicTar miTarget等 生物學(xué)實(shí)驗(yàn)方法尋找miRNA靶基因 由于計(jì)算機(jī)模擬在預(yù)測(cè)miRNA靶基因時(shí)存在一定的局限性 因此很多學(xué)者也希望能夠利用生物學(xué)實(shí)驗(yàn)方法直觀地尋找miRNA靶基因 一般可以從兩個(gè)水平去尋找miRNA靶基因從mRNA水平尋找miRNA靶基因從蛋白質(zhì)水平尋找miRNA靶基因 從mRNA水平尋找miRNA靶基因 基因芯片法 將miRNA成熟體雙鏈或腺病毒載體轉(zhuǎn)染至細(xì)胞中 使得miRNA在細(xì)胞中過(guò)表達(dá) 之后利用基因芯片分析mRNA的變化以找出相應(yīng)miRNA的靶基因 由于miRNA在體內(nèi)通過(guò)翻譯抑制或影響mRNA的穩(wěn)定性起作用 因此這種方法在尋找起翻譯抑制作用的miRNA的靶基因時(shí)存在一定困難 從mRNA水平尋找miRNA靶基因 免疫共沉淀法 利用AGO蛋白家族既能結(jié)合miRNA又能結(jié)合mRNA的特性 分別使用AGO 1和AGO 2蛋白的單克隆抗體在人類(lèi)細(xì)胞中進(jìn)行免疫共沉淀 得到與AGO 1和AGO 2蛋白結(jié)合的mRNA各600條 并通過(guò)克隆測(cè)序?qū)@些mRNA進(jìn)行鑒定 同時(shí)從與AGO 1蛋白結(jié)合的mRNA中隨機(jī)挑選6條進(jìn)行熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè) 發(fā)現(xiàn)其中有5條都是miRNA的靶基因 從蛋白質(zhì)水平尋找miRNA靶基因 細(xì)胞培養(yǎng)穩(wěn)定同位素標(biāo)記技術(shù) 分別將成熟miRNA雙鏈轉(zhuǎn)染HeLa細(xì)胞 利用細(xì)胞培養(yǎng)穩(wěn)定同位素標(biāo)記技術(shù) stableisotopelabelingwithaminoacidsincellculture 將轉(zhuǎn)染了成熟miRNA雙鏈的細(xì)胞和正常細(xì)胞分別培養(yǎng)于含輕 重型穩(wěn)定同位素標(biāo)記必需氨基酸的培養(yǎng)基中 經(jīng)過(guò)若干次細(xì)胞倍增后 穩(wěn)定同位素按照序列特異的方式完全摻入到新合成的蛋白質(zhì)中 通過(guò)比較標(biāo)記前后同一肽段的質(zhì)譜峰值變化實(shí)現(xiàn)對(duì)蛋白質(zhì)的精確定量 在檢測(cè)了2000 5000個(gè)蛋白后 兩個(gè)研究組分別發(fā)現(xiàn) 轉(zhuǎn)染一條miRNA后有幾百個(gè)蛋白的表達(dá)水平發(fā)生了改變 許多改變?cè)趍RNA水平上不能得到體現(xiàn) miRNA靶基因的鑒定 目前最為常用的miRNA靶位點(diǎn)鑒定方法是熒光素酶報(bào)告基因法 其基本原理是首先構(gòu)建熒光素酶表達(dá)載體 將希望鑒定的miRNA靶基因的3 UTR構(gòu)建到熒光素酶基因的3 UTR中 之后將構(gòu)建好的載體轉(zhuǎn)染細(xì)胞并改變細(xì)胞中相應(yīng)miRNA的表達(dá)水平 最后檢測(cè)熒光素酶的表達(dá)情況以分析轉(zhuǎn)染3 UTR中是否含有miRNA的靶位點(diǎn) miRNA在在腫瘤研究中的應(yīng)用 隨著對(duì)miRNA認(rèn)識(shí)和了解 越來(lái)越多的研究認(rèn)識(shí)到它與腫瘤的形成有密切的關(guān)系 如抑制癌基因的miRNA表達(dá)降低 可導(dǎo)致癌基因的過(guò)表達(dá) 而抑制抑癌基因的miRNA表達(dá)過(guò)度 可導(dǎo)致抑癌基因表達(dá)降低 致癌基因的過(guò)表達(dá)與抑癌基因表達(dá)降低均可使腫瘤發(fā)生 例如miR 155是由人BIC基因編碼的miRNA 在hodgkin淋巴瘤和burkitt淋巴瘤中均高表達(dá) 在burkitt淋巴瘤中 miR 155的前體RNA出現(xiàn)10 30倍的蓄積現(xiàn)象 但是在非hodgkin淋巴瘤中幾乎沒(méi)有發(fā)現(xiàn)它的表達(dá) miRNA的研究現(xiàn)狀和展望 目前已發(fā)現(xiàn)了大量的小 分子 它們?cè)谛蛄?結(jié)構(gòu) 表達(dá)及功能等方面都不同程度地表現(xiàn)出了多樣性 其中miRNA的表現(xiàn)尤為突出 它很可能在生命活動(dòng)中起著重要作用 對(duì)基因表達(dá) 生