脫氫酶的測定.doc

活性污泥脫氫酶活性的測定1 目的和原理 有機物在生物處理構筑物中的分解，是在酶的參與下實現(xiàn)的，在這些酶中脫氫酶占有重要的地位，因為有機物在生物體內(nèi)的氧化往往是通過脫氫來進行的?；钚晕勰嘀忻摎涿傅幕钚耘c水中營養(yǎng)物濃度成正比，在處理污水過程中，活性污泥脫氨酶活性的降低，直接說明了污水中可利用物質營養(yǎng)濃度的降低。此外，由于酶是一類蛋白質，對毒物的作用非常敏感，當污水中有毒物存在時，會使酶失活，造成污泥活性下降。在生產(chǎn)實踐中，我們常常在設置對照組，消除營養(yǎng)物濃度變化影響因素的條件下，通過測定活性污泥在不同工業(yè)廢水中脫氫酶活性的變化情況來評價工業(yè)廢水成分的毒性，評價對不同工業(yè)廢水的生物可降解性。 脫氫酶是一類氧化還原酶，它的作用是催化氫從被氧化的物體（基質AH）中轉移到另一個物體（受氫體B）上：為了定量地測定脫氫酶的活性，常通過指示劑的還原變色速度，來確定脫氫過程的強度。常用的指示劑有2,3,5三苯基四氮唑氯化物（TTC）或亞甲藍，它們在從氧化狀態(tài)接受脫氫酶活化的氫而被還原時具有穩(wěn)定的顏色，我們即可通過比色的方法，測量反應后顏色深度，來推測脫氫酶的活性。例如： TTC（無色） TF（紅色）2 材料與器皿 （1）72型分光光度計、超級恒溫器、離心機（4000轉分）、15毫升離心管、移液管、黑布罩 （2）試劑： TrisHCl緩沖液（0.05M）：稱取三羥甲基氨基甲烷6.037克，加1.0MHCl 20毫升，蒸餾水定容至1L，pH為8.4。（備注M指mol/L） 氯化三苯基四氮唑（TTC）（0.4）：稱取0.4克TTC溶于100毫升蒸餾水中，即成0.4的TTC溶液（每周新配）。 亞硫酸鈉（0.36）：稱0.3657克亞硫酸鈉溶于100毫升蒸餾水中。 丙酮、甲醛（分析純）。 10%硫化鈉：稱取10克硫化鈉（分析純），定容至100mL棕色容量瓶中. 0.1molL葡葡萄糖溶液：稱取198179葡萄糖(分析純)溶于100mL蒸餾水。3 方法與步驟（1）標準曲線的制備 配制1mg/毫升TTC溶液：稱取50.0mgTTC，置于50毫升容量瓶中，以蒸餾水定容至刻度 配制不同濃度TTC液：從1mg/毫升TTC液中分別吸取1、2、3、4、5、6、7毫升放入每個容積為50毫升的一組容量瓶中，以蒸餾水定容至50毫升，各瓶中TTC濃度分別為20、40、60、80、100、120、140g/毫升。 每只帶塞離心管內(nèi)加入Tris-HCl緩沖液2毫升2毫升蒸餾水1毫升TTC液（從低到高濃度依次加入）；對照管加入2毫升Tris-HCl緩沖液+3毫升蒸餾水，不加入TTC，所得每只離心管TTC含量分別為20、40、60、80、100、120、140g。 每管各加入1mL的10%硫化鈉溶液，混合置于暗處20min，使TTC全部還原，生成紅色的TF。 在各管加入5毫升丙酮（或正丁醇和甲醇），抽提TF。 放入37恒溫振蕩萃取10min。 在4000轉/分下，離心10分鐘。 在721型分光光度計上，于485nm波長下測光密度。 測繪標準曲線。 將標準曲線測定時的數(shù)值填入表58中。表58 標準曲線OD實測值TTC（g）OD值123420406080100120140備注：根據(jù)上表數(shù)據(jù)以TTC為橫座標，OD值為縱座標繪制標準曲線。（2）活性污泥脫氫酶活性的測定 活性污泥懸浮液的制備： 取活性污泥混合液50毫升玻璃珠振蕩破碎后，在在4000轉/分下，離心5分鐘棄去上清液，蒸餾水補足，充分攪拌洗滌后，再次離心棄去上清液；如此反復洗滌三次后再以蒸餾水稀釋至原來體積備用。 在三組（每組三支）帶有塞的離心管內(nèi)分別加入以下材料與試劑（如表57所示）。 樣品試管搖勻后，立即放入37恒溫水浴振蕩儀內(nèi)，培養(yǎng)2h。 取出加入0.5mL甲醛終止反應。 在對照管與樣品管中各加入丙酮5毫升，充分搖勻，放入37恒溫振蕩萃取10min。 在4000轉/分下，離心10分鐘。 取上清夜在485納米波長下比色，光密度OD讀數(shù)應在0.8以下，如色度過濃應以丙酮稀釋后再比色。 標準曲線上查TF的產(chǎn)生值，并算得脫氫酶的活性。表57 脫氫酶活性測定中各組試劑加量組別活性污泥懸浮液（毫升）Tris-HCl緩沖液（毫升）Na2SO3液（毫升）0.1葡萄糖（毫升）0.4%TTC液（毫升）蒸餾水（毫升）21.50.50.50.521.50.50.50.521.50.51.04 結果與分析（1）活性污泥脫氫酶活性的測定 將樣品組的OD值（平均值）減去對照組OD值后，在標準曲線上查TF的產(chǎn)生值。 算得樣品組（加基質與不加基