高致病禽流感的流行及其預(yù)防控制.doc

高致病性禽流感流行動(dòng)態(tài)及預(yù)防控制禽流感(Avian influenza，AI)為禽流行性感冒也稱禽流感綜合征的簡(jiǎn)稱。每一次暴發(fā)都給養(yǎng)禽業(yè)帶來巨大的損失，是一種毀滅性疾病。由一種叫做A 型禽流行性感冒病毒( Avian influenza virus，AIV)引起的急性、全身性、出血性、敗血性、高度致死性、烈性傳染病。它的臨床癥狀有多種類型: 有的為無明顯癥狀的隱性感染; 有的為病死率較低的呼吸道感染; 有的為病死率較高的急性出血性感染。禽流感這些臨床癥狀的差異, 主要是由禽流感病毒的毒型所決定的。由高致病毒株感染的禽流感稱作高致病性禽流感, 它的潛伏期短, 一般數(shù)小時(shí)到23d, 來勢(shì)兇猛, 死亡率極高, 有時(shí)達(dá)100%劉漢鵬高致病性禽流感防治J,現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科技,2006,（1）：86-87.。該病已被列人國(guó)際生物武器公約動(dòng)物類傳染病名單。AIV依據(jù)其外膜血凝素(Hemagglutinin ,H)和神經(jīng)氨酸酶(Neuraminidase , N)抗原性的不同，目前至少可分為15個(gè)H亞型( H1H15)和9個(gè)N亞型( N1N9)。由H5和H7亞型毒株(以H5N1和H7N7為代表)所引起的禽類疾病稱為高致病性禽流感(Highly pathogenic avian influenza，HPAI)，其發(fā)病率和病死率都很高，危害極大Monto A S. The threat of an avian influenza pandemic J. N Engl J Med, 2005; 352:323-325.,Zeitlin G A, Maslow M J. Avian influenzaJ.Curr Infect Dis Rep,2005;7:193-199。自1997年報(bào)道禽類H5NI亞型流感病毒感染人類以來，相繼有H9N2,H7N7亞型感染人類和H5N1再次感染人類的報(bào)道，引起了世人的廣泛關(guān)注1, AIV威脅著人類和動(dòng)物的健康。1禽流感的流行病學(xué) 禽流感最早報(bào)道于意大利(1878年)，當(dāng)時(shí)稱為雞瘟( Fowl Plague )。隨后，在多個(gè)歐洲國(guó)家、南美、東南亞、美國(guó)和蘇聯(lián)的部分地區(qū)發(fā)生，現(xiàn)已遍布世界各地。20世紀(jì)50年代至90年代，全球共暴發(fā)19次高致病性禽流感。進(jìn)人21世紀(jì)以來，僅6年時(shí)間，全球再次暴發(fā)多起高致病性禽流感（見表1)金寧一.高致病性禽流感的流行及其預(yù)防控制J.中國(guó)免疫學(xué)雜志，2006,22(1)：5-12.。高致病性禽流感常以突然發(fā)病、高死亡率為特征，給養(yǎng)禽業(yè)帶來毀滅性災(zāi)難，同時(shí)也威脅著人類的健康。表1 21世紀(jì)世界高致病性禽流感流行情況表Tab.l Table of Pandemic Status of Highly Pathogenic Avian Influenza in 21thCountry of AreaSubtypeAianYearHong Kong of ChinaH5NI1chicken2001ChileH7N3chicken2001Hong Kong of ChinaH5Nlchicken2002Hong Kong of ChinaH5N1chicken2003HollandH7N7chicken，turkey2003BelgiumH7N7chicken2003GermanyH7N7chicken2003Republic of KoreaH5N1chicken2003Taiwan of ChinaH5Nlduck2003AmericanH7N2chicken2004CanadaH7N2chicken2004Korea RepH5N1，H5N2chicken，duck2004JapanH5N1chicken2004VietnamH5N1chicken2004ThailandH5Nlchicken, duck, quail2004IndonesiaH5Nlchicken2004CambodiaH7N7chicken2004MalaysiaH5N1chicken, quail2004LaosH5N1chicken2004ChinaH5N1chicken, duck, goose2004Taiwan of ChinaH5N2chicken, duck2004PakistanH7N3chicken2004AmericanH7N2,H5N2chicken2004CanadaH7N3chicken2004South AfricanH5N7ostrich2004VietnamH5N1chicken2005ThailandH5N1chicken, chicken2005IndonesiaH5N1、H7N1chicken, quail2005Korea ,DPRH7N7chicken2005CambodiaH5N1chicken2005ChinaH5N1chicken2005RussiaH5chicken2005TurkeyH5chicken2005RumaniaH5chicken2005ColumbiaH9chicken2005GreeceH5chicken2005CroatiaH5chicken2005SwedenH5chicken2005JapanH5chicken, duck2005EnglandH5chicken2005KuwaitH5chicken2005UkraineH5N1chicken, duck, goose20051.1易感人群及易感動(dòng)物1.1.1易感人群 任何年齡均具易感性，但12歲以下兒童發(fā)病率較高，病情較重。與不明原因病死家禽或感染、疑似感染禽流感家禽密切接觸人員為高危人群。在對(duì)家禽飼養(yǎng)、宰殺、處理的工作人員、醫(yī)務(wù)人員、患者的家庭成員的研究中檢測(cè)到了H5的抗體，表明他們感染了H5N1亞型流感病毒，但這些病例都沒有出現(xiàn)嚴(yán)重的臨床癥狀。有研究表明，家禽飼養(yǎng)工人的抗體陽性率為10% ,宰殺、處理家禽的工作人員抗體陽性率為3% 梁之祥人感染高致病性禽流感研究近況J,實(shí)用醫(yī)藥雜志,2006,23（4）：485-487.。1.1. 2易感動(dòng)物 很多禽類都能感染禽流感病毒，火雞最敏感，雞次之，鴨、鵝和鴿多呈隱性感染。國(guó)外報(bào)道已發(fā)現(xiàn)野鳥、水禽、海鳥等均可感染禽流感病毒，帶病毒的鳥類達(dá)88種，我國(guó)在17種野鳥中發(fā)現(xiàn)禽流感病毒。不同日齡、品種和性別的雞群均可感染發(fā)病，但以產(chǎn)蛋雞群多發(fā)。發(fā)病康復(fù)的雞群仍屬易感動(dòng)物，不少雞群發(fā)病恢復(fù)期間或康復(fù)后12個(gè)月又發(fā)病?？祻?fù)雞體內(nèi)的抗體是有一定限度的，康復(fù)后的雞體中的抗體水平隨時(shí)間推移逐漸下降，當(dāng)下降到一定水平時(shí)，就不能保護(hù)雞體免受禽流感強(qiáng)毒的侵襲，此時(shí)若環(huán)境中有禽流感強(qiáng)毒存在，雞群仍有可能再次感染發(fā)病。但同一雞群第二次發(fā)病時(shí)，往往癥狀較輕，死亡率較低。1. 2傳染源 對(duì)于禽類而言，主要為患禽流感或攜帶禽流感病毒的雞、鴨、鵝等家禽，特別是雞。禽的分泌物和排泄物、組織器官、禽蛋中均可帶有病毒，但不排除其他禽類或豬成為傳染源的可能。通常認(rèn)為野生遷徙的水禽，特別是野鴨是禽流感病毒的自然宿主，能將病毒傳播給家養(yǎng)和販賣的禽群2。人禽流感患者是否為傳染源，尚無定論。1.3傳播途徑 對(duì)于禽類而言，AIV主要通過橫向傳播，即通過易感禽類與感染禽類的直接接觸或與病毒污染物的間接接觸，例如被污染的飲水、飛沫、飼料及其他被污染的蛋筐、蛋盤、運(yùn)輸工具、污染的羽毛和糞便等。該病能否垂直傳播，目前尚無足夠的證據(jù)，但從自然感染禽流感病毒的雞蛋蛋黃、蛋清及蛋殼中均能分離到病毒。候鳥和野鳥在傳播禽流感過程中也可能起到重要作用。 對(duì)于人類而言，AN主要經(jīng)呼吸道傳播。禽的分泌物和排泄物、組織器官、禽蛋中均可帶有病毒，糞便中含病毒量最大，是禽流感傳播的主要媒介。通過密切接觸感染的禽類及其分泌物、排泄物、受病毒污染的水以及直接接觸病毒株被感染。雖然不能完全排除禽流感在人之間相互傳播的可能性，但目前尚缺乏人與人之間傳播的確切證據(jù)2。1. 4臨床 禽類的禽流感潛伏期一般較短，通常為45天，體溫急劇上升至43.344.4。根據(jù)禽類的種類(雞、火雞、鴨、鵝及野鳥等)以及病毒亞型的不同，表現(xiàn)各種各樣的變化:有最急性、急性、亞急性及隱性感染等。高致病性禽流感潛伏期短、傳播快、發(fā)病急、發(fā)病率高，死亡率高，但傳播范圍往往不大。禽流感病毒感染雞精神沉郁、拒食，病雞很快陷于昏睡狀態(tài)，眼臉頭部浮腫，肉冠、肉垂出血發(fā)組、壞死，腳鱗出現(xiàn)紫色出血斑，有些頸部出現(xiàn)向后扭轉(zhuǎn)的神經(jīng)癥狀。病雞多呈急性死亡，有的也可能出現(xiàn)呼吸道癥狀，咳嗽、打噴嚏，氣管出現(xiàn)咯音，流淚，側(cè)鼻突腫大等癥狀，羽毛蓬松，產(chǎn)蛋率下降，高致病性禽流感病毒可引起100%的雞群發(fā)病，75%以上的病雞死亡;無致病性禽流感病毒則不引起任何癥狀，僅能從感染雞的血清中檢測(cè)出禽流感病毒抗體;禽群感染溫和型禽流感病毒后，臨診上則以精神沉郁、采食減少、有呼吸道癥狀、稀便呈黃綠色、產(chǎn)蛋下降、零星死亡為特征田純見,林志雄,畢英佐,等禽流感預(yù)防和控制新進(jìn)展J,養(yǎng)禽與禽病防治,2006（3）：6-7.。 主要的病變特征為口腔、腺胃、肌胃角質(zhì)膜下層和十二指腸出血，胸骨內(nèi)面、胸部肌肉、腹部脂肪和心臟均有散在性出血，頭部顏面、肉冠、肉垂浮胖，皮下膠樣浸潤(rùn)、出血、心包積水、心肌軟化，腺胃乳頭出血，脾、肝臟腫大出血，腎腫大，法氏囊水腫呈黃色，生殖系統(tǒng)卵泡畸型、萎縮。低致病性禽流感潛伏期長(zhǎng)，傳播慢，病程長(zhǎng)，發(fā)病率和死亡率低，一旦發(fā)病，如不采取積極措施，病毒很難在疫區(qū)被根除，疫情會(huì)逐漸向周邊地區(qū)擴(kuò)散，使疫區(qū)越來越大，而且病毒還有變強(qiáng)(變成高致病性禽流感病毒)的可能。禽流感因病毒毒株毒力不同，潛伏期和發(fā)病率、死亡率差異很大。有的病毒毒株感染后不表現(xiàn)出臨診癥狀，當(dāng)遇到強(qiáng)應(yīng)激時(shí)才表現(xiàn)明顯的臨診癥狀。以H9N2,H9N3為例，病程可達(dá)2個(gè)月之久，主要引起產(chǎn)蛋雞發(fā)病，雛雞和育成雞多呈隱性感染或不感染，發(fā)病率有的可達(dá)100%，多數(shù)在80%以內(nèi)。若無繼發(fā)感染，死亡率較低，一般在10%以內(nèi)。由于病程長(zhǎng)，發(fā)病雞群發(fā)病及恢復(fù)期間均能源源不斷地隨呼吸道、消化道排泄物及羽毛、皮屑等向外界排毒，使雞舍周圍環(huán)境中病毒密度很高，條件適宜(如刮風(fēng)、運(yùn)輸病雞或其排泄物)時(shí)病毒就會(huì)不斷向周邊擴(kuò)散。傳播速度因條件及病毒毒株毒力不同而不同。禽流感的臨床癥狀與病理變化易與新城疫、急性禽霍亂、傳染性支氣管炎、衣原體、產(chǎn)蛋下降綜合征等混淆，且常繼發(fā)或并發(fā)感染，使疾病更加復(fù)雜。人類感染禽流感后，潛伏期一般為13天，通常在7天以內(nèi)。急性起病，早期表現(xiàn)類似普通型流感。主要表現(xiàn)為發(fā)熱，體溫大多持續(xù)在38. 5以上，熱程17天，多為34天，可伴有流涕、鼻塞、咽痛、咳嗽、頭痛和全身不適，常在發(fā)病15天后出現(xiàn)呼吸急促以及明顯的肺炎表現(xiàn)。部分患者可有惡心、腹痛、腹瀉、稀水樣便等消化道癥狀1,2。重型患者病情發(fā)展迅速，發(fā)病1周內(nèi)很快進(jìn)展為呼吸窘迫，肺部有實(shí)變體征，隨即發(fā)展為呼吸衰竭，即使接受了輔助通氣治療，大多數(shù)患者仍然死亡。亦有以嚴(yán)重腹瀉為主要表現(xiàn)，隨后出現(xiàn)抽搐、昏迷的個(gè)案報(bào)道Ungchusak K, Auewatakul P, Dowell S F et al. Probable person-to-person transmission of avian influenza A(H5N1)J . N Engl J Med,2005 ;352 : 333-340,Tran T H, Ngnyen T L, Nguyen T D et al. Avian influema A( H5N1)in 10 patients in VietnamJ . N Engl J Med , 2004 ; 350 : 1179-1188.。大多數(shù)H7N7毒株感染者以結(jié)膜炎為主要表現(xiàn)。人禽流感進(jìn)展快、預(yù)后差，可出現(xiàn)急性呼吸窘迫綜合征、肺出血、胸腔積液、全血細(xì)胞減少、腎功能衰竭、敗血癥、休克及Reye綜合征等多種并發(fā)癥。常死于嚴(yán)重呼吸衰竭。1. 5影響發(fā)病率和死亡率的因素 禽流感的發(fā)病率和死亡率與病毒毒株的毒力及感染禽的種類、齡期、性別、環(huán)境因素、飼養(yǎng)狀況、有無并發(fā)、繼發(fā)疾病等因素有關(guān)。其中病毒毒株毒力影響最大，高致病力的毒株可引起100%的發(fā)病和死亡，有的毒株不引起任何臨診癥狀和死亡。飼養(yǎng)管理不當(dāng)、營(yíng)養(yǎng)不良、環(huán)境條件太差及強(qiáng)應(yīng)激都會(huì)使發(fā)病率和死亡率明顯增高，有并發(fā)感染時(shí)，死亡率明顯增高。1. 6禽流感多并發(fā)或繼發(fā)其他傳染病禽流感本身也是一種免疫抑制性疫病，發(fā)病雞群抗病能力極差，往往并發(fā)或繼發(fā)其他傳染病，常見的并發(fā)和繼發(fā)病有大腸桿菌病、新城疫、傳染性支氣管炎、霉?jié){體病等。1. 7發(fā)病季節(jié) 禽流感大流行不同于季節(jié)性暴發(fā)。季節(jié)性暴發(fā)主要由已存在于雞群的流感亞型引起，而禽流感大流行則由流感病毒新亞型或長(zhǎng)期未出現(xiàn)的亞型引起。季節(jié)性暴發(fā)一年四季均可發(fā)生，但多暴發(fā)于冬、春季節(jié)，尤其是秋冬、冬春之交氣候變化大的時(shí)期。一般情況下夏季發(fā)病較少，多呈零星發(fā)生，發(fā)病雞群的癥狀也較輕。 AIV被認(rèn)為是人類流感病毒的祖先，是幾乎所有A型流感病毒的基因庫。AI的暴發(fā)和流行，將增加AIV與人流感病毒發(fā)生基因重排的機(jī)會(huì)，增加新流感病毒產(chǎn)生的幾率，對(duì)人類的健康構(gòu)成了潛在的威脅。2AIV的分子生物學(xué)特征 流感病毒為正黏病毒(Orthomyxo Virus)，根據(jù)該病毒的核蛋白(NP)與基質(zhì)蛋白(MS)抗原性不同分為A,B,C三型。A型感染溫血?jiǎng)游?禽類和人、豬、馬、海洋哺乳動(dòng)物等),B和C型主要感染人，C型也可感染豬。造成危害的禽流感病毒主要是A型。 AIV是流感病毒屬的一個(gè)成員，為8節(jié)段的負(fù)鏈單股RNA病毒。這8個(gè)節(jié)段RNA分別編碼10個(gè)與病毒結(jié)構(gòu)和功能有關(guān)的蛋白質(zhì)，節(jié)段1和2分別編碼多聚酶蛋白PB1和PB2;節(jié)段3編碼PA蛋白，也與聚合酶活性有關(guān);節(jié)段4碼血凝素蛋白(HA);節(jié)段5編碼核衣殼蛋白NP;節(jié)段6編碼神經(jīng)氨酸酶(NA);節(jié)段7編碼基質(zhì)蛋白M1和M2，可作為支架蛋白，與病毒的形態(tài)有關(guān);節(jié)段8編碼非結(jié)構(gòu)蛋白NS1和NS2，有可能參與病毒基因組的轉(zhuǎn)錄。根據(jù)病毒表面的2種糖蛋白HA和NA可將AIV分成若干亞型，目前已從禽類分離到的AIV至少有16種HA和9種NA，這些抗原又以不同的組合，產(chǎn)生極其多樣的毒株。不同的H抗原或N抗原之間無交叉反應(yīng)，且不同亞型的毒株對(duì)禽類的致病性是不同的。 歷史上高致病性的禽流感都是由H5和H7引起的，但并非所有的H5和H7都是強(qiáng)毒。AIV的抗原性不斷發(fā)生變異(抗原性轉(zhuǎn)移和抗原性漂異)，這些變異是由HA,NA及PB2引起的，尤其是HA的變異最為常見。 AIV有8個(gè)基因組片段，當(dāng)2個(gè)或2個(gè)以上的不同病毒粒子同時(shí)感染一個(gè)宿主細(xì)胞時(shí)，在病毒的增殖過程中，不同病毒粒子的8個(gè)基因組片段可以隨機(jī)互相交換，從而發(fā)生核酸片段水平上的重新組合，這種現(xiàn)象稱為基因重排。如果HA和NA基因能夠隨意重排，16種HA和10種NA則可產(chǎn)生160種不同亞型的AIV，當(dāng)細(xì)胞感染2種不同的AIY后，通過基因片段的重排有可能產(chǎn)生256種遺傳學(xué)不同的子代病毒或毒株。在自然界，這種混合感染的現(xiàn)象很常見，通過基因重排有可能產(chǎn)生高致病力的毒株。近年來，人們對(duì)高致病力AIV H9的分子遺傳學(xué)關(guān)系的研究也比較深人。 對(duì)A/Goose/Guangdong/1/96(H5N1)(GDl/96)HA及A/Goose/Guangdong/3/96(H5N1)HA基因進(jìn)行了克隆和序列分析陳化蘭,于康震,步志高.一株鵝源高致病力禽流感病毒分離株血凝素基因的分析J.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué),1999;(32);287-292.,賈永清,陳化蘭,鄧國(guó)華,等.禽流感病毒分離株A/Goose/Guangdong/3/96( H5N1) HA基因序列分析J.中國(guó)預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2000;22(1);25-30.，結(jié)果表明，這2個(gè)毒株高度同源，并且與引起世人震驚的香港禽流感事件中人體分離株A/HongKong/156/97(H5N1) (HK156)起源關(guān)系非常密切，具有相似的生物學(xué)特性。為進(jìn)一步闡明早于香港禽流感事件，在我國(guó)華南地區(qū)與香港毗鄰的廣東發(fā)病鵝體中分離到的高致病力AIV GD1/96與香港禽流感事件分離株HK156及香港地區(qū)流行株的關(guān)系，對(duì)GDl/96分離株進(jìn)行全基因序列分析，并進(jìn)行了數(shù)據(jù)分析和比較性研究張建林,于康震,陳化蘭,等.禽流感病毒分離株A/Goose/Guangdong/3/96(H5N1)全基因序列分析J.中國(guó)預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2000;22(3):232-235.，結(jié)果表明，鵝體AIV分離株GD1/96為典型的高致病力AIV，與1997年在香港致人感染發(fā)病甚至死亡的HK156株的HA基因組結(jié)構(gòu)高度同源(高于98% )，兩者在HA切割位點(diǎn)處的6個(gè)連續(xù)堿性氨基酸殘基的插人序列完全一致，均為一PQR-ERRRKKR-，且在受體結(jié)合位點(diǎn)的氨基酸序列也相同，說明它們擁有共同的祖先，都起源于歐亞群系，與其他4株具有代表性的香港流感病毒分離株(人、雞、鴨和鵝各1株)比較，也發(fā)現(xiàn)了類似的規(guī)律。 GD1/96分離株的NA基因片段與4株香港AIV相比，無19個(gè)氨基酸殘基(57個(gè)核苷酸殘基)缺失，即使不包括這些缺失的核昔酸，它們的同源率也較低(核營(yíng)酸序列、氨基酸序列的同源率分別在88. 5%89. 4%和91. 7% 92. 9%)，而4株香港AIV毒株之間的同源率較高(99. 4%以上)。GD1/96分離株與4株香港AIV的NA基因片段同源率差異更加顯著，核苷酸序列、氨基酸序列的同源率分別在71. 4%71. 9%和63. 9%66. 9%之間，說明它們分屬于不同的NA基因群系。 除NA以外的內(nèi)部基因NP,M( M1和M2 ) ,PA,PB1,PB2的核苷酸、氨基酸序列的同源性，GD1/96分離株和4株香港AIV的差異都比較大。 由此表明，1996年內(nèi)地H5N1病毒分離株GDl/96與1997年香港禽流感事件的發(fā)生明顯缺乏直接的聯(lián)系，GD1/%傳播到香港引起人、禽的發(fā)病是不可能的。不僅如此，對(duì)GD1/%分離株的遺傳演化分析結(jié)果也表明，GD1/%分離株的內(nèi)部基因起源與香港H5Nl亞型流感病毒不同。目前，在香港地區(qū)H9N2亞型AIV遺傳演化上存在有2個(gè)相對(duì)獨(dú)立分支的亞群G1群以A/Quail/HongKong/G1/97 (H8N2) (QHKGl)為代表的和G9群以A/Chicken/HongKong/G9/97 ( H9N2) ( CHKG9)為代表的，其中的G1群與香港H5亞型流感處在一個(gè)進(jìn)化分支，尤其是分離株QHKG1與1997年香港禽流感事件中分離到的H5亞型AIV直接相連，為H5亞型流感病毒基因重排提供了內(nèi)部基因，香港H5亞型AIV與分離株QHKG1的內(nèi)部基因的同源率超過94%，而與CHKG9和DHKY280內(nèi)部基因核苷酸的同源率僅為88%Guan Y, Shortxidge K F, Krauss S et al. Molecular characterization of H9N2 influenza viruses: Were they the donors of the internal genes of H5N1viruses in HongKong 7. Proc Natl Acad Sci USA ,1999;96:9363-9367.。經(jīng)分析表明，GD 1 /96分離株與QHKGI , CHKG9和DHKY280之間的內(nèi)部基因M,NP、PA,PB1核苷酸序列的同源性介于兩者之間，并沒有明顯差別，NA基因也分屬于2個(gè)NA基因群。據(jù)此可以推斷，GD1/96分離株的內(nèi)部基因起源于香港G1亞群和G9亞群的可能性不大。Liu等對(duì)近年來分離自我國(guó)大陸12個(gè)省的23株AIVH9的HA基因進(jìn)行了克隆及序列分析，并與Gen-Bank上的31株AIV H9進(jìn)行了核昔酸序列和推導(dǎo)的氨基酸序列比較，結(jié)果表明，我國(guó)分離的23株AIV H9 HA的核苷酸序列(94.1%100%)和推導(dǎo)的氨基酸序列(94. 5%100 %)同源性很高，而與其他分離株差異顯著，說明我國(guó)大陸的23株分離株可能有共同的起源。3AIV致病性的分子生物學(xué)基礎(chǔ) 歷史上，高致病性的禽流感均由HS , H7亞型AIV所致。Senn等用RT-PCR和循環(huán)測(cè)序技術(shù)，對(duì)76個(gè)HS和H7亞型AIV血凝素(HA)切割位點(diǎn)氨基酸序列進(jìn)行了測(cè)定。結(jié)果表明，所有高致病性的HS,H7亞型AIV都有多個(gè)堿性氨基酸與HA切割位點(diǎn)相毗連，B-X-B-R ( B-堿性精氨酸或賴氨酸，X-非堿性氨基酸，R一精氨酸)是高致病力病毒HA切割位點(diǎn)的最小基序。盡管致病力是AIV的一個(gè)多基因特性，但也與其HA糖蛋白切割位點(diǎn)有多個(gè)堿性氨基酸相關(guān)。存在于大多數(shù)真核細(xì)胞中的細(xì)胞內(nèi)枯草溶菌素樣內(nèi)切蛋白酶，可促進(jìn)HA的切割活化作用，而特異性細(xì)胞蛋白酶識(shí)別并切割不同病原型HA糖蛋白的能力決定病毒在宿主中的傳播。由于宿主的大多數(shù)細(xì)胞均有內(nèi)切蛋白酶，因此，HA切割作用范圍廣，進(jìn)而導(dǎo)致嚴(yán)重病變和高死亡率。而非高致病力病毒HA切割位點(diǎn)只有一個(gè)堿性氨基酸(精氨酸)，但也有例外，如1株非高致病力的H7( A/Pekin robin/CA/30412-5/94)病毒的HA切割位點(diǎn)有4個(gè)堿性氨基酸，符合高致病力AIV HA切割位點(diǎn)的分子特征，被認(rèn)為是潛在的高致病毒株。 由此可見，HA切割位點(diǎn)堿性氨基酸序列能作為鑒定高致病力和潛在高致病力分離株的遺傳標(biāo)記。Subbar等對(duì)人體中分離的香港H5N1( A/HK/157/97)分離株的HA切割位點(diǎn)氨基酸序列進(jìn)行了測(cè)定，表明其符合高致力病毒的分子特征;通過與禽源H5N1分離株HA基因進(jìn)行比較發(fā)現(xiàn)，兩者同源性極高，所不同的是A/HK/157/97缺少1個(gè)糖基化位點(diǎn)并推測(cè)這可能是AIV得以感染人的可能原因。 Seo等最新的研究認(rèn)為. Seo S H, Hoffmann E, Wester R G. Lethal H5N1 influenza viruses escape host anti-viral cytokine responsesJ . Nat Med, 2002;8 (9):950-954，細(xì)胞遭到流感病毒襲擊后，通常會(huì)釋放出被稱為“細(xì)胞因子”的免疫分子，激發(fā)免疫系統(tǒng)攻擊病毒、保護(hù)未受感染的細(xì)胞。但是，細(xì)胞因子(干擾素、腫瘤壞死因子)對(duì)引起禽流感的“H5N1”病毒完全視而不見。并認(rèn)為1997年肆虐我國(guó)香港的H5N1 AIV，能夠靠1個(gè)變異基因掩藏自己，躲避人體免疫系統(tǒng)的攻擊。有人發(fā)現(xiàn)了H5N1中這個(gè)特殊的基因即非結(jié)構(gòu)基因(Non-structural gene , NS )，其NS1分子的第92位為谷氨酸，認(rèn)為是它使該病毒具有躲避免疫系統(tǒng)攻擊的能力。有人將NS基因移植人另一種AIV ( Hl N1 )，用來感染實(shí)驗(yàn)豬，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，被改造后的病毒感染的豬發(fā)病癥狀比受未改造的病毒感染的豬要嚴(yán)重得多，病情也持續(xù)得更長(zhǎng)?？茖W(xué)家的這項(xiàng)發(fā)現(xiàn)，將有助于了解對(duì)人敏感的H5N1 AIV。 1997年之前，H5N1亞型禽流感即在亞洲的某些地方存在。一開始它的致病力并不強(qiáng)，僅引起輕微癥狀。但在雞群中經(jīng)過數(shù)月循環(huán)后，其致病性明顯增強(qiáng)，可在48小時(shí)內(nèi)致死感染雞只，死亡率達(dá)100%(W HO , 2005)。4AIV的診斷 對(duì)禽流感的診斷，以病原分離和血清學(xué)檢查為依據(jù)。病原的分離和鑒定可以從活體或尸體分離病毒。用棉拭子法常可從活體的氣管和泄殖腔中分離到病毒。血清學(xué)檢查的常用手段有瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)、血凝抑制試驗(yàn)和神經(jīng)氨酸酶抑制試驗(yàn)等。4. 1 AIV的分子診斷技術(shù) 目前，通過設(shè)計(jì)合成AIV的核蛋白(NP)和基質(zhì)蛋白(MP)基因特異引物，建立了可以直接從臨床病料的感染組織中檢測(cè)所有亞型AIV的RT-PCR診斷技術(shù). 劉明,于康震,崔尚金,等. RT-PCR快速診斷禽流感的研究J.中國(guó)預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報(bào),2000;22(3):182-185.,. Starick E, Romer-Oberdorfer A, Wemer O. Type- and subtype-specific RT-PCR assays for avian influenza A viruses (AIV)J, J Vet Med B Infect Dis Vet Public Health, 2000;47(4) :295-301.。試驗(yàn)表明，它可應(yīng)用于所有亞型禽流感感染的早期快速診斷，具有敏感、特異、快速的特點(diǎn)。另外，為特異、快速地檢出可引起高致病力禽流感大暴發(fā)的H5或H7亞型AIV的感染，還建立了對(duì)臨床病料或雞胚接種物中HS和H7亞型r1IV快速分型檢測(cè)的RT-PCR診斷技術(shù). 崔尚金,陳化蘭,唐秀英,等.禽流感RT-PCR診斷法的建立J.中國(guó)畜禽傳染病,1998;20(20):105-107，H5和H7亞型AIV分型診斷技術(shù)在特異地檢出H5或H7亞型AIV感染的同時(shí)，還可根據(jù)應(yīng)用特定引物經(jīng)RT-PCR擴(kuò)增出的H5和H7包括裂解位點(diǎn)在內(nèi)的HA基因片段、經(jīng)測(cè)序推導(dǎo)出的氨基酸序列，判斷HS或H7亞型AIV的致病性高低，為禽流感尤其是高致病力禽流感的防制提供先進(jìn)、有效的早期快速診斷技術(shù)和監(jiān)測(cè)手段，同時(shí)也為高致病力禽流感的防制爭(zhēng)取到極為寶貴的快速反應(yīng)時(shí)間。 另外，Wang等. Wang X, Castro A E, Castro M D et al. Production and evaluation criteria of specific monoclonal antibodies to the hemagglutinin of the H7N2 subtype of avian influenza virus J. J Vet Diagn Invest, 2000;12(6);503-509.通過對(duì)野外分離株H7N2 HA的分離純化，SP2/0-AgI4骨髓瘤細(xì)胞與免疫鼠脾細(xì)胞融合建立雜交瘤細(xì)胞，獲得了6株能穩(wěn)定分泌抗AIV HA的單克隆抗體，研究為建立更加敏感、特異、快速檢測(cè) AIV的分子免疫學(xué)方法奠定了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。秦愛建等. 秦愛建，邵紅霞，錢琨,等.抗禽流感病毒H5和H9亞型血凝素特異單克隆抗體的研制及應(yīng)用J.中國(guó)預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報(bào),2003;25 ( 3) :161-163以H5和H9亞型AIV分別免疫BALB/。小鼠，取其脾臟細(xì)胞與SP2/0骨髓瘤細(xì)胞融合，用血凝抑制試驗(yàn)(HI)檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)上清，結(jié)果獲得6株特異性單克隆抗體。研究結(jié)果表明，所有這些單克隆抗體僅與試驗(yàn)的相應(yīng)H5,H9亞型病毒株發(fā)生特異性反應(yīng)，而不能與別的病毒或其他亞型AIV起反應(yīng);應(yīng)用單克隆抗體能在24小時(shí)內(nèi)迅速檢測(cè)出相應(yīng)的AIV 。4. 2 AIV的鑒別診斷 由于禽流感的流行特點(diǎn)、癥狀及病理變化與某些禽的傳染病相似，必須及時(shí)做出鑒別診斷。如雞新城疫、傳染性氣管炎、傳染性喉氣管炎、傳染性鼻炎、支原體病、衣原體病、產(chǎn)蛋下降綜合征等;特別是某些疾病的混合感染或繼發(fā)感染，使病情更為復(fù)雜，給診斷帶來困難或容易發(fā)生誤診。因此，類癥鑒別診斷十分重要。 首先是與新城疫(ND)的區(qū)別診斷。禽流感與雞新城疫的流行特點(diǎn)、癥狀、病變很相似，可從如下幾個(gè)方面來鑒別:一般來說高致病性禽流感的潛伏期和病程比國(guó)內(nèi)目前發(fā)生的新城疫為短，新城疫病雞呼吸困難，嗦嚷和口中積液，呼吸困難時(shí)的咕咕叫聲，典型的神經(jīng)癥狀等各種表現(xiàn)、常規(guī)的典型病變都較禽流感明顯和具有特征性，現(xiàn)場(chǎng)新城疫的緊急免疫效果等，都與禽流感不同。但有的也無明顯的不同，兩病的準(zhǔn)確區(qū)別診斷，只能依靠實(shí)驗(yàn)室的診斷，最簡(jiǎn)便、實(shí)用的方法是病毒分離和血凝抑制試驗(yàn)( HI) , ND抗血清抑制不了AIV的血凝作用。 禽流感與其他幾種疾病的鑒別，根據(jù)其流行特點(diǎn)、癥狀、病理剖檢和實(shí)驗(yàn)室檢查(病原學(xué)、血清學(xué))等綜合分析，是可以區(qū)別開的。同樣，繼發(fā)或并發(fā)細(xì)菌病或病毒病時(shí)，通過病原分離和某些實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)方法便可確定。4. 3高致病性AIV鑒定標(biāo)準(zhǔn)OIE(國(guó)際獸疫局)新標(biāo)準(zhǔn)分離的A型流感病毒，用0.2m11:10稀釋的無菌尿囊液靜脈或肌肉注射8只48周齡易感雞，10天內(nèi)的死亡率不低于75 % 。對(duì)所有低致病的H5,H7毒株，血凝素切割位點(diǎn)氨基酸序列與高致病性禽流感病毒一致。 H5, H7以外的A型流感病毒，可致死15只雞，在缺乏胰蛋白酶的情況下，能在CEF細(xì)胞上生長(zhǎng)形成蝕斑。 根據(jù)AIV毒株致病性的強(qiáng)弱不同，將AIV分為非致病性毒株(Non pathogenic avian influenza virus,NPAIV)、低致病性毒株(Lowly pathogenic avian influenza vinis,LPAIV)和高致病性毒株(High patho-genic avian influenza virus , HPAIV )。有關(guān)HPAIV鑒定的標(biāo)準(zhǔn)，目前仍主要依據(jù)美國(guó)動(dòng)物衛(wèi)生協(xié)會(huì)家禽和其它禽類可傳染性疾病委員會(huì)制定的標(biāo)準(zhǔn)來進(jìn)行。其鑒定標(biāo)準(zhǔn)是:無菌的感染性雞胚尿囊液作1: 10稀釋后靜脈接種8只4-8周齡易感雞，0. 2mV只，接種后10天內(nèi)6/8;毒株為HS或H7亞型AIV，雖然不能致死6/8或以上的雞，但HA切割位點(diǎn)氨基酸序列與HPAIV相一致;病毒即使是非H5或H7亞型AIV，若能造成1/8-5/8的雞死亡，而且能在無胰蛋白酶的細(xì)胞培養(yǎng)物中生長(zhǎng)繁殖，產(chǎn)生細(xì)胞病變或蝕斑。符合以上三個(gè)條件中任何一條，均可判定為HPAIV 。5禽流感的預(yù)防和控制種種跡象表明，由禽流感引起下一次人類流感世界大流行似乎不可避免。因此，如何做好禽流感的預(yù)防控制是當(dāng)前的燃眉之急。AIV疫苗的研究對(duì)AI的防制具有非常重要的意義。由于病毒抗原的多變性，目前應(yīng)用的常規(guī)滅活疫苗免疫效果尚存在一些問題，有待開發(fā)安全、有效的基因工程疫苗。國(guó)內(nèi)外有關(guān)AIV亞單位疫苗、重組活載體疫苗及DNA疫苗研制成功的報(bào)道不少。我國(guó)采用HS亞型HA和NA基因，經(jīng)桿狀病毒表達(dá)，構(gòu)建了HS亞型基因重組桿狀病毒昆蟲表達(dá)亞單位疫苗和成功研制了表達(dá)禽流感病毒A/Goose/Guangdong/3/96(H5N1) HA和NA基因的重組痘病毒rFPV-HA-NA活載體疫苗，初步動(dòng)物試驗(yàn)結(jié)果已顯示出良好的免疫保護(hù)原性，免疫后對(duì)高致病力H5N1,H7N1的攻擊產(chǎn)生100%的保護(hù). 喬傳玲,姜永萍,李呈軍,等禽流感重組禽痘病毒rFPV-HA-NA活載體疫苗的研究J.免疫學(xué)雜志,2003;19(1):46-49.,. 喬傳玲,于康震,鄧國(guó)華,等禽流感病毒A/Gaose/Guandong/3/96( H5N1) NA基因的克隆及其重組禽痘病毒轉(zhuǎn)移載體的構(gòu)建J.中國(guó)獸醫(yī)學(xué)報(bào),2003;23(2):111-114.。開展了禽流感HA基因疫苗脂質(zhì)體的研究，以脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染技術(shù)構(gòu)建了H7亞型AIV HA基因重組雞痘病毒，并對(duì)其進(jìn)行了免疫保護(hù)性研究，結(jié)果表明，H7亞型AIV HA基因的重組禽痘病毒可誘導(dǎo)雞產(chǎn)生有效的免疫保護(hù)反應(yīng)，腸道排毒顯著減少. 陳吉祥,李廣林,陳化蘭,等.禽流感HA基因疫苗脂質(zhì)體的制備及理化性質(zhì)J.中國(guó)獸醫(yī)學(xué)報(bào),1999;19(3);230-232.。在H5 , H7亞型AIV HA基因重組禽痘病毒研究的基礎(chǔ)上，H5,H7亞型NA基因重組禽痘病毒載體疫苗和H9亞型AIV HA基因重組禽痘病毒研究也獲得成功. 馬文軍,張建林,陳化蘭,等.禽流感血凝素基因重組雞痘病毒的構(gòu)建及其免疫保護(hù)性研究J.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué),2000;33(5):75-77.。 我國(guó)研制的H7亞型血凝素基因DNA疫苗，在極小的使用劑量下即可成功誘導(dǎo)免疫保護(hù)反應(yīng)，并有效阻斷同源低致病力AIV在機(jī)體內(nèi)的感染和排毒. 陳化蘭,于康震,田國(guó)斌,等。DNA免疫誘導(dǎo)雞對(duì)禽流感病毒的免疫保護(hù)反應(yīng)J.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué),1998 ;31(5 ) :63-68.,. 陳化蘭,于康震,田國(guó)斌,等.禽流感病毒血凝素基因的克隆及其DNA人疫苗的免疫原性J.中國(guó)獸醫(yī)學(xué)報(bào),1997;17(6);555-558.；研制的H5亞型HA基因DNA疫苗，具有良好的免疫原性，肌肉注射途徑即可達(dá)到對(duì)同源強(qiáng)毒攻擊的免疫保護(hù)，并能有效阻斷免疫保護(hù)存活雞機(jī)體的排毒。另外，抗病毒藥物對(duì)預(yù)防AIV也具有非常重要的意義。據(jù)報(bào)道，美國(guó)已研制出一種新型抗病毒藥物RWJ-270201，它對(duì)人流感病毒和香港感染人的AIV均有效. Http; /China. alibaba. com。目前為止的防治經(jīng)驗(yàn)表明，全球各國(guó)對(duì)禽流感作為人和動(dòng)物共患病采取嚴(yán)格的防治對(duì)策，得到了有效控制。在懷疑有禽流感發(fā)生時(shí)，均采取快速診斷、嚴(yán)格隔離封鎖和同群撲殺等綜合措施。 禽流感病毒對(duì)熱的抵抗力較低，56 30分鐘，60 10分鐘，70 2分鐘即可滅活，普通消毒劑均有很快殺死病毒的作用。低溫凍干或甘油保存可使病毒存活多年。5.1控制傳染源加強(qiáng)禽類疾病的監(jiān)測(cè)，一旦發(fā)現(xiàn)禽流感疫情，動(dòng)物防疫部門立即按有關(guān)規(guī)定進(jìn)行處理，并封鎖疫區(qū)。高致病性禽流感疫點(diǎn)周圍半徑3公里范圍劃為疫區(qū)，將疫點(diǎn)及其周圍3公里的家禽全部撲殺;對(duì)疫區(qū)周圍5公里范圍內(nèi)的所有易感禽類實(shí)施疫苗緊急免疫接種，是目前最有效的控制措施。加強(qiáng)對(duì)密切接觸禽類人員的監(jiān)測(cè)，當(dāng)這些人員中出現(xiàn)流感樣癥狀時(shí)，應(yīng)立即進(jìn)行流行病學(xué)調(diào)查，采集病人標(biāo)本并送至指定實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)，以進(jìn)一步明確病原，同時(shí)應(yīng)采取相應(yīng)的防治措施. 高致病性禽流感防治技術(shù)規(guī)范J,河南畜牧獸醫(yī),2006,27（2）：42-45.。5. 2切斷傳播途徑接觸人禽流感患者應(yīng)戴口罩、戴手套、穿隔離衣，接觸后應(yīng)洗手。要加強(qiáng)檢測(cè)標(biāo)本和實(shí)驗(yàn)室禽流感病毒株的管理，嚴(yán)格執(zhí)行操作規(guī)范，防止醫(yī)院感染和實(shí)驗(yàn)室的感染及傳播。注意飲食衛(wèi)生，不喝生水，不吃未熟的肉類及蛋類等食品;勤洗手，養(yǎng)成良好的個(gè)人衛(wèi)生習(xí)慣。5. 3保護(hù)易感人群因禽流感病毒高度易變，目前尚無上市的H5N1疫苗。對(duì)密切接觸者必要時(shí)可試用抗流感病毒藥物或按中醫(yī)藥辨證施防。在禽流感流行區(qū)，與雞、鴨或其他動(dòng)物接觸時(shí)建議:避免與任何有生病、被宰殺或可能感染禽流感動(dòng)物的雞場(chǎng)、鴨場(chǎng)或其他動(dòng)物養(yǎng)殖場(chǎng)接觸;如果無意中接觸了病雞或死雞的環(huán)境，應(yīng)徹底洗手，并連續(xù)7天監(jiān)測(cè)自己的體溫，如果發(fā)熱(體溫38)，應(yīng)咨詢是否需要接受抗病毒治療;如果接觸了死于禽流感的死雞或其糞便，應(yīng)連續(xù)7天監(jiān)測(cè)自己的健康狀況并向醫(yī)生尋求幫助. 馬震,杜玉梅淺談禽流感的預(yù)防和控制J,養(yǎng)殖與飼料,2006（1）：39-42.。5.4提高疫苗研制水平，爭(zhēng)取在流感大爆發(fā)期間以最短時(shí)間研制出有效疫苗禽流感引發(fā)下一次流感大流行似乎勢(shì)不可擋，那么一旦爆發(fā)禽流感病毒在人類的流行，病毒疫苗接種仍然是公認(rèn)的最有效方法。流感病毒疫苗的接種可以有效降低病人的發(fā)病率和死亡率. WHO Guidelines on the Use of Vaccines and Antivirals during Influenza Pandemics. WHO/CDS/CSR/RMD/2004. 8。但由于流感病毒基因突變和基因重配所造成的抗原漂移和抗原轉(zhuǎn)換，大流感之前所制造的流感疫苗所起的作用微之又微。最有效的疫苗應(yīng)該是流感爆發(fā)后用流行株所制備的特異性疫苗。 流感疫苗的使用已有60年，在使用過程中逐漸完善了其良好的安全性和有效性。在美國(guó)，只有兩種人用流感病毒疫苗獲得許可，即滅活疫苗和減毒活疫苗。傳統(tǒng)的疫苗制造過程一般進(jìn)行“2 +6”模式的病毒重配(即流行野生株的HA和NA基因加上A/PR/8/34病毒株的六個(gè)內(nèi)部基因)，然后將重配病毒接種雞胚使其傳代擴(kuò)增，最后提純和濃縮等步驟，過程耗時(shí)且繁瑣。新近發(fā)展起來的反向遺傳技術(shù)(reverse genetic system)應(yīng)用于人用及禽用疫苗制造相對(duì)于傳統(tǒng)疫苗研制方法顯示出多項(xiàng)優(yōu)勢(shì):該技術(shù)只需設(shè)計(jì)構(gòu)建相關(guān)質(zhì)粒，然后轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞或Vero細(xì)胞、接種雞胚擴(kuò)增病毒即可，步驟簡(jiǎn)便，疫苗制造周期短，可以在大流感流行期間快速制造出特異性疫苗;該技術(shù)可以使疫苗含有標(biāo)準(zhǔn)化的抗原含量(standardized antigen content);該技術(shù)不需要傳統(tǒng)技術(shù)所必須的濃縮、純化病毒步驟，不會(huì)致死雞胚，從而大大節(jié)約成本。通過剔除H5亞型禽流感病毒HA分子的多重堿性氨基酸序列，可以使該技術(shù)制造的疫苗具有良好的安全性. Webeter R G. Microbial adaptation and change; avian influenza J.Rev aci tech Off Int Epiz, 2004; 23:453-465.。綜上所述，可以預(yù)見，一旦大流感爆發(fā)，反向遺傳技術(shù)必將在疫苗制備中發(fā)揮重要作用。2005年2006年WHO推薦在北半球使用的裂解疫苗標(biāo)準(zhǔn)病毒株包括A/New Caledonia/20/99(H1N1),A/California/7/2004/ (H3N2)以及B/Shanghai/361/2002，這3種疫苗組合可以使被接種者獲得對(duì)H3N2,HIN1甲型流感及B型流感的免疫力，但這些推薦使用的疫苗對(duì)禽流感H5N1并無防護(hù)作用. 韋天彬,黃裔騰,李康生.禽流感病毒的變異進(jìn)化及其預(yù)防控制J.中國(guó)免疫學(xué)雜志,2006,22(1)：16-19.。5.5加大對(duì)抗流感病毒藥物的儲(chǔ)備，重點(diǎn)保障高危人群用