生物藥物分析與檢驗(yàn)氨基酸、多肽和蛋白質(zhì)類藥品檢驗(yàn)課件.ppt

第八章氨基酸 多肽因子和蛋白質(zhì)類藥品檢驗(yàn) 基本要求 掌握氨基酸定性鑒別的方法 熟悉氨基酸特殊雜質(zhì)及安全性檢查 掌握氨基酸含量測(cè)定方法 掌握多肽因子類藥物的定性鑒別方法 熟悉多肽因子類藥物的檢查方法 掌握多肽因子類藥物生物效價(jià)的測(cè)定方法 掌握蛋白質(zhì)類藥物的鑒別和檢查方法 掌握蛋白質(zhì)含量測(cè)定和效價(jià)測(cè)定方法 了解幾種氨基酸 多肽因子和蛋白質(zhì)藥物的質(zhì)量分析過程 基本內(nèi)容第一節(jié)氨基酸類藥品檢驗(yàn)第二節(jié)多肽因子類和蛋白質(zhì)類藥品檢驗(yàn)第三節(jié)幾種氨基酸 多肽和蛋白質(zhì)藥物的質(zhì)量分析 第一節(jié)氨基酸類藥品檢驗(yàn) 氨基酸是治療蛋白質(zhì)代謝紊亂 蛋白質(zhì)缺損所引起的一系列疾病的重要生化藥物 也是具有高度營(yíng)養(yǎng)價(jià)值的蛋白質(zhì)補(bǔ)充劑 有著廣泛的生化作用和臨床療效 目前氨基酸及其衍生物臨床應(yīng)用不斷發(fā)展和擴(kuò)大 創(chuàng)制了一些新的生化藥物 如甲基酪氨酸治療嗜鉻細(xì)胞瘤氧苯丙氨酸用于類癌瘤綜合征偶氮絲氨酸治療白血病乙酰羥脯氨酸用于治療類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎 第一節(jié)氨基酸類藥品檢驗(yàn) 氨基酸為白色晶狀體 熔點(diǎn)很高 多在熔融時(shí)分解 都能溶解在強(qiáng)酸強(qiáng)堿中 形成的鹽多能溶于水 氨基酸在等電點(diǎn) pI 時(shí)溶解度最小 最穩(wěn)定 中性pI值在5 6 3左右 酸性pI值在2 8 3 2左右 堿性氨基酸的pI值在7 6 10 8左右 第一節(jié)氨基酸類藥品檢驗(yàn) 一 氨基酸的定性鑒別旋光度 熔點(diǎn) 溶解度 紙層析 氨基酸自動(dòng)化分析 氣相色譜等均可作為氨基酸鑒別的依據(jù) 1 化學(xué)鑒別法氨基酸的鑒別最常用的方法是根據(jù)所有氨基酸均能與茚三酮顯藍(lán)紫色 采用茚三酮顯色法 中國(guó)藥典 2010年 二部對(duì)所收載的氨基酸類藥物大多采用此方法進(jìn)行鑒別 第一節(jié)氨基酸類藥品檢驗(yàn) 茚三酮反應(yīng) 茚三酮在酸性溶液中與 氨基酸共熱 引起氨基酸氧化脫氫 脫羧反應(yīng) 最后生成紫色物質(zhì) 第一節(jié)氨基酸類藥品檢驗(yàn) 2 光譜鑒別法 1 紫外吸收光譜法在20種天然氨基酸中 只有酪氨酸 色氨酸和苯丙氨酸在紫外區(qū)有最大吸收 酪氨酸的 max 275nm苯丙氨酸的 max 257nm色氨酸的 max 280nm 1 酪氨酸2 色氨酸3 苯丙氨酸 第一節(jié)氨基酸類藥品檢驗(yàn) 這三種氨基酸可以通過紫外吸收光譜加以鑒別 精密稱取酪氨酸 色氨酸 苯丙氫酸各適量 用水制成每1mL含20 g 色氨酸 40 g 酪氨酸 200 g 苯丙氨酸 在波長(zhǎng)230 300nm測(cè)定各氨基酸的吸收光譜 如右圖 第一節(jié)氨基酸類藥品檢驗(yàn) 2 紅外吸收光譜圖氨基酸在紅外區(qū)都有特性圖譜 可以通過與標(biāo)準(zhǔn)氨基酸圖譜比較作為氨基酸的鑒別依據(jù) 所得的吸收?qǐng)D譜各主要吸收峰波長(zhǎng)和各吸收峰間的相互強(qiáng)度關(guān)系均應(yīng)與對(duì)照的圖譜一致 第一節(jié)氨基酸類藥品檢驗(yàn) 3 薄層色譜鑒別法在薄層板上點(diǎn)樣 通過與標(biāo)準(zhǔn)氨基酸對(duì)照而鑒別氨基酸 1 薄層板的制備 第一節(jié)氨基酸類藥品檢驗(yàn) 2 十一種氨基酸混合液 色 蛋 亮 異亮 甘 賴 蘇 纈 苯丙 組 精 與對(duì)照液的制備 第一節(jié)氨基酸類藥品檢驗(yàn) 3 點(diǎn)樣 展開和顯色吸取混合液和對(duì)照液各3 L 分別點(diǎn)于同一薄層板上 以正丁醇 水 異丁酸 醋酸 50 50 5 7 之上層作展開劑 進(jìn)行單向三次展開 展開約15cm 每次必須待溶劑揮發(fā)盡后 再進(jìn)行下一次展開 噴以顯色劑 吲哚醌1g 溶于100mL無水乙醇和10mL冰醋酸中 置100 干燥5 10min至顯色完全為止 第一節(jié)氨基酸類藥品檢驗(yàn) 本層析系統(tǒng)中 由于分離的程度與各種氨基酸顯出不同的顏色 可以區(qū)別十一種氨基酸 用茚三酮 硝酸鈉試劑亦能顯出不同顏色的色斑 且靈敏度較高 第一節(jié)氨基酸類藥品檢驗(yàn) 4 旋光性除甘氨酸外 所有的天然氨基酸都有旋光性 且每種氨基酸的比旋度不同 因此 可以用比旋度作為氨基酸藥物的鑒別指標(biāo) 第一節(jié)氨基酸類藥品檢驗(yàn) 二 氨基酸特殊雜質(zhì)及安全性檢查1 特殊雜質(zhì)檢查氨基酸原料藥所含有的特殊雜質(zhì)一般為一些其他種類的氨基酸 用薄層色譜法進(jìn)行限量檢查 將樣品配成一定濃度的供試品液 取一定量供試品液稀釋后作為對(duì)照液 在同一硅膠G薄板上 一般用正丁醇 水 冰醋酸 3 1 1 展開晾干后 噴茚三酮的丙酮溶液顯色 規(guī)定供試品所顯雜質(zhì)斑點(diǎn)的顏色不得深于對(duì)照液主斑點(diǎn) 以此限制其他氨基酸的含量 第一節(jié)氨基酸類藥品檢驗(yàn) 2 安全性檢查影響氨基酸安全用藥的因素除其中的一般雜質(zhì) 主要為熱原的含量 中國(guó)藥典所收載的氨基酸基本上都規(guī)定了熱原檢查 采用家兔法 將一定劑量的供試品 靜脈注入家兔體內(nèi) 在規(guī)定時(shí)間內(nèi)觀察家兔體溫升高的情況 以判定供試品中所含熱原的限度是否符合規(guī)定 第一節(jié)氨基酸類藥品檢驗(yàn) 三 氨基酸含量測(cè)定1 茚三酮法茚三酮法是氨基酸定量測(cè)定應(yīng)用最廣泛的方法之一 當(dāng)茚三酮在酸性條件下和氨基酸反應(yīng)時(shí) 氨基酸被氧化分解生成醛 放出氨和二氧化碳 水合茚三酮?jiǎng)t成還原型水合茚三酮 然后還原型茚三酮與氨 另一分子茚三酮進(jìn)一步縮合生成藍(lán)紫色物 最大吸收值的波長(zhǎng)為570nm 茚三酮反應(yīng)為一切 氨基酸所共有 反應(yīng)靈敏 根據(jù)反應(yīng)所生成的藍(lán)紫色深淺 可以測(cè)定氨基酸含量 本法可允許的測(cè)定范圍是0 5 50 g氨基酸 第一節(jié)氨基酸類藥品檢驗(yàn) 2 酸堿滴定法谷氨酸 天冬氨酸和賴氨酸賴氨酸 lysine 片中賴氨酸的測(cè)定取本品20片 精密稱定 研細(xì) 精密稱取適量 約相當(dāng)于賴氨酸0 15g 置燒杯中 加水25mL 滴加氫氧化鈉滴定液 0 1mol L 用酸度計(jì)調(diào)節(jié)至pH值為7 0 加入預(yù)先調(diào)節(jié)至pH值9 0的甲醛溶液15mL 攪勻 再用氫氧化鈉滴定液 0 1mol L 滴定至pH值為9 0 并持續(xù)30s 按加入甲醛液后所耗用氫氧化鈉滴定液 0 1mol L 體積計(jì)算 每毫升氫氧化鈉滴定液 0 1mol L 相當(dāng)于9 132mg的C6H14N2O2 HCl 第一節(jié)氨基酸類藥品檢驗(yàn) 3 非水溶液滴定法中國(guó)藥典 美國(guó)藥典和英國(guó)藥典對(duì)所收載氨基酸類藥物 除谷氨酸用氫氧化鈉為標(biāo)準(zhǔn)溶液的酸堿滴定法 其余均根據(jù)其結(jié)構(gòu)特性 采用了非水酸堿滴定法 用冰醋酸作溶劑 高氯酸作標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定 電位法或指示劑法確定終點(diǎn) 適用于常量氨基酸的含量測(cè)定 第一節(jié)氨基酸類藥品檢驗(yàn) 4 定氮法精氨酸和天冬酰胺的原料及其制劑可以采用定氮法測(cè)定含量 將被測(cè)藥物置于凱式燒瓶中 加濃硫酸 硫酸鹽及適量的催化劑 加熱進(jìn)行有機(jī)物的破壞 其中所含的氮完全轉(zhuǎn)化為氨 再與硫酸結(jié)合成硫酸銨 硫酸銨與強(qiáng)堿反應(yīng) 放出氨 將其蒸出 吸收于定量酸溶液 酸堿滴定法滴定 從而計(jì)算出氮的含量并換算成被測(cè)藥物的含量 第一節(jié)氨基酸類藥品檢驗(yàn) 5 HPLC對(duì)于各種復(fù)方氨基酸制劑中氨基酸的含量測(cè)定 目前較多地采用了高效液相色譜法 HPLC 因大多數(shù)氨基酸沒有紫外吸收 不能用紫外檢測(cè)器測(cè)定 為改善被測(cè)物的檢測(cè)特性 提高檢測(cè)靈敏度 需進(jìn)行化學(xué)衍生化 衍生方式包括柱后衍生法和柱前衍生法 柱后衍生法是將樣品經(jīng)離子交換柱分離后進(jìn)行衍生 柱前衍生法是將樣品制成適當(dāng)?shù)难苌镌龠M(jìn)行HPLC分離 2020 1 29 23 可編輯 第二節(jié)多肽因子類和蛋白質(zhì)類藥品檢驗(yàn) 蛋白質(zhì)和多肽因子是生物體內(nèi)廣泛存在的生化物質(zhì) 具多種生理功能 是一大類非常重要的生化藥物 多肽因子類藥物指分子量不算太大的 在體內(nèi)含量極微 但卻發(fā)揮極大生理作用的一類生物活性物質(zhì) 其中包括天然動(dòng)物體內(nèi)提取的藥物如干擾素 白細(xì)胞介素 胸腺肽 轉(zhuǎn)移因子等和通過現(xiàn)代基因工程技術(shù)生產(chǎn)的藥品如重組人干擾素 重組白細(xì)胞介素 重組乙肝疫苗等 第二節(jié)多肽因子類和蛋白質(zhì)類藥品檢驗(yàn) 一 多肽因子類藥物的定性鑒別基因重組多肽因子類藥物的鑒別主要采用SDS PAGE法和免疫印跡法 1 SDS PAGE法用SDS PAGE鑒別生物樣品必須是該品有極純的標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照品 通過電泳結(jié)果的對(duì)比 確定所測(cè)樣品是否與標(biāo)準(zhǔn)品有相同的遷移率 從而鑒別該品 缺點(diǎn) 必須有標(biāo)準(zhǔn)品 凝膠中多肽需保留生物活性 或能夠復(fù)性 或電泳前可將檢測(cè)配基與待測(cè)多肽共價(jià)交聯(lián) 第二節(jié)多肽因子類和蛋白質(zhì)類藥品檢驗(yàn) 2 蛋白質(zhì)免疫印跡電泳法 轉(zhuǎn)移電泳 westernblot 原理 借助聚丙烯酰胺凝膠技術(shù) 將生物活性物質(zhì)高效分離 分離后的樣品可以原位 定量驅(qū)動(dòng)或吸印在另一種固相載體 通常用醋酸纖維素薄膜 簡(jiǎn)稱NC膜 上 能保持原有的生物活性 可以進(jìn)行各種生物檢測(cè) 免疫識(shí)別 掃描 積分和保存 第二節(jié)多肽因子類和蛋白質(zhì)類藥品檢驗(yàn) 1 基本操作分3個(gè)部分 聚丙烯酰胺凝膠電泳 轉(zhuǎn)移電泳 即將凝膠中的多肽條帶轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素紙上 檢測(cè)或鑒定薄膜上的多肽條帶 聚丙烯酰胺凝膠電泳先將待分離樣品進(jìn)行凝膠電泳分離 凝膠可用瓊脂糖凝膠 也可用聚丙烯酰胺凝膠 可以是均一的 也可用梯度凝膠 凝膠緩沖體系中可含有各種變性劑 如SDS LDS 尿素等 可進(jìn)行單向或雙向電泳 也可用等電聚焦電泳 第二節(jié)多肽因子類和蛋白質(zhì)類藥品檢驗(yàn) 轉(zhuǎn)移電泳將濕醋酸纖維素 NC 薄膜緊貼凝膠 凝膠與薄膜之間不能有氣泡 否則在氣泡所在部位的條帶將不能轉(zhuǎn)移 在NC膜和凝膠的另一側(cè)放上兩層濕濾紙 也不能有氣泡 再在兩邊貼上海綿 最后用塑料網(wǎng)框架夾緊 插入電泳槽 根據(jù)凝膠中樣品所帶電荷的性質(zhì) 決定有NC膜的一邊是靠近正極還是靠近負(fù)極一側(cè) 電泳條件取決于凝膠類型 轉(zhuǎn)移裝置和蛋白質(zhì)本身性質(zhì)等 一般采用低電壓和低電流 2mA cm2以內(nèi) 緩沖液中一般含有20 的甲醇或乙醇 其作用主要是保持凝膠的幾何形狀 第二節(jié)多肽因子類和蛋白質(zhì)類藥品檢驗(yàn) 檢測(cè)或鑒定NC膜借助非共價(jià)鍵吸附蛋白質(zhì) 經(jīng)轉(zhuǎn)移后蛋白質(zhì)條帶就固定在NC膜上 完全保留凝膠中的蛋白譜 可直接用考馬斯亮藍(lán) 氨基黑10B等染色 如果利用蛋白質(zhì)生物活性 或用蛋白質(zhì)生物探針來檢測(cè) 就要先用1 3 的牛血清蛋白或血紅蛋白 或非離子去垢劑 0 3 吐溫 20 等處理NC紙 以封閉NC紙上未吸附蛋白質(zhì)區(qū)域 使其不再能吸附蛋白質(zhì) 使用非離子去垢劑比較經(jīng)濟(jì) 但有可能把NC紙上的某些蛋白質(zhì)洗掉 同時(shí)還要將NC紙反復(fù)洗滌以去除變性劑 第二節(jié)多肽因子類和蛋白質(zhì)類藥品檢驗(yàn) 二 多肽因子類藥物的檢查1 分子量檢查常用還原型SDS PAGE法檢查分子量 用量約1 g 也可采用凝膠過濾法 例如Sephadecx系列 G 75 100 waters1 60 125 250 BackmanTSK2000SW 3000SW 4000SW 凝膠過濾是測(cè)定完整蛋白質(zhì)分子的分子量 而SDS PAGE是測(cè)定蛋白質(zhì)亞基的分子量 同時(shí)用這二種方法測(cè)定同一蛋白質(zhì)的分子量 可以方便地判斷樣品蛋白質(zhì)是否是寡聚蛋白質(zhì) 第二節(jié)多肽因子類和蛋白質(zhì)類藥品檢驗(yàn) 2 等電點(diǎn)測(cè)定等電點(diǎn)是蛋白質(zhì)的物理化學(xué)常數(shù) 它表示蛋白質(zhì)的帶電性質(zhì) 一般采用凝膠等電聚焦電泳技術(shù)測(cè)定等電點(diǎn) 3 紫外吸收不同的蛋白質(zhì)分子都有其特定的紫外吸收 對(duì)于某種蛋白質(zhì)或多肽來說 它的最大吸收波長(zhǎng)是固定的 紫外吸收光譜是檢查蛋白質(zhì)的一個(gè)重要指標(biāo) 第二節(jié)多肽因子類和蛋白質(zhì)類藥品檢驗(yàn) 4 純度基因工程產(chǎn)品蛋白質(zhì)純度是一項(xiàng)重要指標(biāo) 但它也是一項(xiàng)相對(duì)的指標(biāo) 需根據(jù)實(shí)際要求而定 蛋白質(zhì)純度一般是指是否含有其他雜蛋白 而不包括鹽 緩沖液離子 SDS等小分子在內(nèi) 目前較常用的是HPLC法 包括凝膠過濾 各種反相HPLC 離子色譜 疏水色譜等 非還原SDS PAGE凝膠電泳法 毛細(xì)管電泳法 CE 等電聚焦電泳 此外也應(yīng)用一些化學(xué)方法 觀察末端是否均一 第二節(jié)多肽因子類和蛋白質(zhì)類藥品檢驗(yàn) 至少應(yīng)用兩種以上的方法 而且是兩種不同分離機(jī)理的方法來判定蛋白質(zhì)的純度才比較可靠 常發(fā)現(xiàn)某一樣品在凝膠過濾中是純的 而在離子色譜中卻分辨為二個(gè)組分 反之亦然 又如一種樣品用凝膠過濾法和SDS PAGE電泳證明是純的 但這仍不充分 因?yàn)檫@兩者機(jī)理相同 第二節(jié)多肽因子類和蛋白質(zhì)類藥品檢驗(yàn) 三 蛋白質(zhì)類藥物的鑒別和檢查1 蛋白質(zhì)類藥物的鑒別蛋白質(zhì)類藥物可根據(jù)其各自的物理 化學(xué)性質(zhì) 生理作用等采用不同的方法進(jìn)行鑒別 1 茚三酮反應(yīng)組成蛋白質(zhì)的氨基酸都能與茚三酮反應(yīng)生成紫色化合物 因此蛋白質(zhì)也有此反應(yīng) 這是蛋白質(zhì)鑒別的最常用方法 2 福林酚反應(yīng)或雙縮脲反應(yīng)這兩種常用來測(cè)定蛋白質(zhì)的含量 但有時(shí)也用于蛋白質(zhì)的鑒別 3 紫外吸收由于組成蛋白質(zhì)的氨基酸中 酪氨酸 色氨酸 苯丙氨酸在紫外區(qū)的光吸收特性 因此可利用此種特性鑒別蛋白質(zhì) 第二節(jié)多肽因子類和蛋白質(zhì)類藥品檢驗(yàn) 五 蛋白質(zhì)含量測(cè)定和效價(jià)測(cè)定1 蛋白質(zhì)含量測(cè)定蛋白質(zhì)的定量可用化學(xué)方法如凱氏定氮法 雙縮脲法 福林酚法 紫外光吸收法來測(cè)定 也可用染色法 如氨基黑 考馬斯亮藍(lán)測(cè)定 此外還可用熒光激發(fā) 氯胺T 放射性核素計(jì)數(shù)等靈敏度較高方法 上述方法中凱氏定氮法 福林酚法 紫外光吸收法最為常用 它們操作簡(jiǎn)單 設(shè)備便宜 第二節(jié)多肽因子類和蛋白質(zhì)類藥品檢驗(yàn) 1 凱氏定氮法凱氏定氮法常用來測(cè)定有機(jī)物的含氮量 原理 A 含氮有機(jī)物的消化當(dāng)含氮有機(jī)物與硫酸共熱時(shí) 分解出氮 二氧化碳 水 氮轉(zhuǎn)變出的氨與硫酸化合生成硫酸銨 分解反應(yīng)進(jìn)行得很慢 可加入硫酸銅及硫酸鉀或硫酸鈉促進(jìn)反應(yīng) 其中硫酸銅為催化劑 硫酸鉀或硫酸鈉可提高沸點(diǎn) 過氧化氫也能加速反應(yīng) 第二節(jié)多肽因子類和蛋白質(zhì)類藥品檢驗(yàn) B 銨離子的生成消化完了以后 在凱氏定氮瓶中加入強(qiáng)堿 氫氧化鈉溶液 消化液 使硫酸銨分解 放出氨 用水蒸汽蒸餾法 將氨蒸入過量的硼酸溶液中 氨與溶液中的氫離子結(jié)合 生成銨離子 使溶液中氫離子濃度降低 C 測(cè)定用強(qiáng)酸滴定 直至恢復(fù)溶液中原來的氫離子濃度為止 所用強(qiáng)酸的摩爾數(shù)即相當(dāng)于被測(cè)樣品中氨的摩爾數(shù) 第二節(jié)多肽因子類和蛋白質(zhì)類藥品檢驗(yàn) 2 紫外吸收法 280nm光吸收法由于蛋白質(zhì)中酪氨酸和色氨酸殘基的苯環(huán)含有共軛雙鍵 因此蛋白質(zhì)在275 280nm波長(zhǎng)處有一個(gè)紫外吸收高峰 在一定范圍內(nèi) 蛋白質(zhì)溶液在280nm波長(zhǎng)處的光吸收度值 A280 與其濃度成正比 因此可作定量測(cè)定 該法測(cè)定范圍為0 01 0 1mg mL 該法簡(jiǎn)單 靈敏 快速 不消耗樣品 低濃度的鹽類不干擾測(cè)定 因此在蛋白質(zhì)和酶的生化制備中廣泛應(yīng)用 第二節(jié)多肽因子類和蛋白質(zhì)類藥品檢驗(yàn) 280nm和260nm光吸收差法若樣品中含有嘌呤 嘧啶等核酸類吸收紫外光的物質(zhì) 在用來測(cè)定蛋白質(zhì)濃度時(shí) 會(huì)有較大的干擾 由于核酸在260nm波長(zhǎng)處的光吸收比280nm波長(zhǎng)處更強(qiáng) 因此可利用280nm和260nm的吸收差來計(jì)算蛋白質(zhì)濃度 常用下列經(jīng)驗(yàn)公式估算 蛋白質(zhì)濃度 mg mL 1 45A280 0 74A260 假設(shè)1mg mL蛋白質(zhì)溶液的A280為1 0 第二節(jié)多肽因子類和蛋白質(zhì)類藥品檢驗(yàn) 3 考馬斯亮藍(lán)G 250染色法考馬斯亮藍(lán)G 250在酸性溶液中為棕紅色 當(dāng)它與蛋白質(zhì)通過疏水作用結(jié)合后變?yōu)樗{(lán)色 可在595nm波長(zhǎng)處進(jìn)行比色測(cè)定 該法反應(yīng)快 操作簡(jiǎn)便 消耗樣品少 但不同蛋白質(zhì)之間差異較大 且標(biāo)準(zhǔn)曲線線性較差 測(cè)定范圍為0 01 1 0mg mL蛋白質(zhì) 高濃度的Tris EDTA 尿素 甘油 蔗糖 丙酮 硫酸銨 去垢劑對(duì)測(cè)定有干擾 緩沖液濃度過高或改變測(cè)定液的pH也會(huì)影響顯色 第二節(jié)多肽因子類和蛋白質(zhì)類藥品檢驗(yàn) A 溶液的配制標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液0 1或1 0mg mL牛血清白蛋白 染色液稱取100mg考馬斯亮藍(lán)G 250溶解于50mL95 乙醇中 加100mL85 的磷酸 加水稀釋到1000mL 該染色液可保存數(shù)月 若不加水可長(zhǎng)期保存 臨用前再稀釋 B 標(biāo)準(zhǔn)曲線在試管中分別加標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液0 6 12 24 36 48 60 L 用水補(bǔ)足至60