細胞培養(yǎng)的流程.doc

細胞培養(yǎng)的流程，從購買試劑、分裝，到無菌操作、實驗、觀察的過程？對于新手來說，細胞培養(yǎng)真是太難了，很多的細節(jié)你不可能一下子就考慮到、預見到，因此請教細胞培養(yǎng)的高手就顯得非常重要且可貴了。細胞培養(yǎng)包括儀器的清洗、消毒滅菌，試劑的購買、配制、分裝，細胞的分離，無菌操作，培養(yǎng)細胞的觀察，實驗的設計，及結果的分析等等。但這每一個過程的含金量都很高，要求非常嚴格。如果你正在培養(yǎng)細胞，或曾經培養(yǎng)過細胞，你一定有很多的經驗值得大家分享，你一定有你自己的一套培養(yǎng)細胞的流程，從哪開始到哪結束你也一定有太多的想說。因此，你不妨說說你的細胞培養(yǎng)流程，以便我們廣大的細胞培養(yǎng)新借以一鑒。于此，我先代表廣大細胞培養(yǎng)新手謝謝各位園丁里的奉獻者！有空整理一下再寫寫。呵呵謝了先版主建議不錯，我剛開始養(yǎng)細胞時遇到的各種困難可以說是不計其數了，解決困難耗費了大量地時間，可惜呀！養(yǎng)細胞是一項即有難度又很講究技術的過程，作起來不易，要真正詳細的寫出來示人更難！ 書上的規(guī)范和標準很多，但作起來每人都有自己的方法，適宜就好。我看還沒有人跟帖，我就先說一點，從最初階段開始：（自己的做法）（一）儀器的清洗總的分為兩大類：可泡酸的和不可泡酸消毒的。 酸指消毒的清潔液（由濃硫酸、重鉻酸鉀和蒸餾水配置的次強酸液）可泡酸的主要是玻璃儀器培養(yǎng)細胞的板子，離心管等塑料器皿。消毒過程：自來水沖洗3-5遍-超聲波清洗30-烘干-濅入清潔液過夜（不少于6h）-自來水沖洗1520遍-蒸餾水洗3-5遍，烘干備用。不可泡酸的主要是膠塞和蓋子，慮器等，先在清水中濅泡后沖洗烘干-2%NaOH濅泡過夜，自來水沖洗，5%HCl濅泡三min，流水沖洗-蒸餾水漂洗-烘干備用。消毒好的器具一定找個干凈的柜子保存，使用前高壓消毒滅菌，我科室主要使用鋁制飯盒分裝器具，挺方便的，用前高壓。今天暫說一點，以后有機會再續(xù)，望給師弟妹們有所借鑒。斑竹不厚道，現在知道為什么沒有別的戰(zhàn)士跟貼了么？我怎么也耗了幾十分鐘打的字，你就這樣打擊別人的信心，還有可能往后面延續(xù)么！再說，經驗何止這些這點.您的帖子我看見了，您的抱怨我也接受！并且跟您補上一分！每個斑竹給分的標準有一定的差別，但是可以肯定的是：我們有自己的加分原則，大原則是不變的！比如：版內討論得很多的東西，重復發(fā)帖一般不予以加分！您的這個帖子屬于改范疇！感謝您對細胞版的支持！如果有問題可以直接pm我們！再次感謝！再多說點啊！呵呵接著說呀，很好，很有幫助，我是新手，要多向你學習頂一下。我也說說我的一些體會吧。1、首先說清洗：對于玻璃器皿（如移液管、蓋玻片之類）可先用酸液浸泡24h以上，再用清水浸泡24h。之后用清水將移液管沖洗10遍，除去殘留酸液，再用雙蒸水沖洗3-5遍，徹底洗凈后放入不銹鋼筒中，雙層牛皮紙扎口，高壓滅菌20min，烘干待用。我們實驗室的酸液一般是次強酸液（重鉻酸鉀120g 濃硫酸200 mL 蒸餾水1 000 mL）配液時要小心燙傷。裝培養(yǎng)基的瓶子則要在每次用完培養(yǎng)基以后就要立即洗凈，臨用時再次用清水沖洗3-5遍，再用雙蒸水漂洗3次，洗凈后瓶口蓋上錫箔紙，外包雙層牛皮紙扎口后高壓滅菌20min，與其配套的瓶蓋則洗凈后另行包好同時滅菌、烘干。培養(yǎng)基過濾器滅菌同瓶子，也要在用完后及時洗凈、滅菌時保持密封。Tip頭就容易了，插到盒子里，雙層牛皮紙包好后直接高壓滅菌就好了。2、再說說除菌：我說的除菌主要是指溶液的除菌。如PBS、HEPES之類的一些緩沖劑和不含葡萄糖的鹽溶液，可以配好以后直接高壓滅菌。而大部分的溶液由于成分限制必須過濾除菌。我們實驗室需要過濾除菌的溶液有：膠原酶、胰酶、各類血清、抗生素、G-418溶液、各類培養(yǎng)基、各類生長因子、丙酮酸鈉、谷氨酰胺等.3、關于各類溶液的配制：我列出我們實驗室常用試劑的配方吧：1XPBS：氯化鈉8克、氯化鉀0.2克、磷酸二氫鈉1.15克、磷酸氫二鉀0.2克，加水至一升，調pH=7.4。這里我認為PBS的pH是最重要的一環(huán)，不可大意。HEPES溶液：8克氯化鈉、0.3克氯化鉀、0.135克磷酸氫二鈉、1克葡萄糖、5克HEPES加水900ml，調pH=7.4抗生素：我們主要用青霉素和鏈霉素，一般用1XPBS稀釋至1X105單位，-20度儲存，用時直接加入培養(yǎng)基，工作濃度一般為1X102單位。G-418：1克包裝的G-418瓶中加入10mlHEPES溶液徹底溶解，過濾除菌后分裝于EP管，-20度保存。谷氨酰胺：L-谷氨酰胺29.2克，加HanksBBS1000ml溶解，配成200mmol/L過濾除菌，4度保存，工作濃度14mmol/L。加有谷氨酰胺的培養(yǎng)液在4冰箱中儲存2周以上時，應重新加入原來的谷氨酰胺。1XEDTA-胰酶：0.25克胰酶加0.1克EDTA完全溶解于500ml 1XPBS中，過濾除菌后分裝于50ml離心管中，一管4度備用，其他-20度保存。我不太主張配成10X的母液，因為胰酶反復凍融后，效果會差很多。（EDTA很難溶，必要時候可放置過夜）MTT：sigma公司出產，用1XPBS配成50mg/ml待用。MTT毒性很大，配置時務必小心。各類培養(yǎng)基：現在我們實驗室都是買GIBICO的粉劑自己配制。包裝盒上會有配制方法，以及加碳酸氫鈉的量。按說明來就是了。需要注意的是在配培養(yǎng)基前，最好先確保碳酸氫鈉充分溶解，避免局部pH偏高或偏低。再一個就是水的使用，一般配鹽溶液，用三蒸水即可，而配制培養(yǎng)基務必用超純水，并在使用前要高壓滅菌。今天太晚了，先說到這，明天繼續(xù)4、關于培養(yǎng)基的選用：我養(yǎng)過的細胞株不多，權當拋磚引玉吧。一般來說大部分細胞系我們都用高糖DMEM+10%FCS培養(yǎng)，我們實驗室用該培養(yǎng)基的有：HepG-2、NIH-3T3、A549、Hela、C2C12、COS-7。特殊的，如P19Cl6用-MEM+10%FCS，SGC-7901用RPMI-1640+10%FCS，293細胞則用MEM+熱滅活的馬血清。對于貼壁不是很緊的細胞，用45%DMEM+45%-MEM+10%FCS有奇效現附上前輩總結的帖子，希望對大家有幫助5、操作中的一些小細節(jié)：實驗進行前，無菌室及無菌操作臺以紫外燈照射30分鐘滅菌，以70 %ethanol 擦拭無菌操作抬面，并開啟無菌操作臺風扇運轉數分鐘后，才開始實驗操作。每次操作只處理一株細胞株，以避免失誤混淆或細胞間污染。實驗完畢后，將實驗物品帶出工作臺，以70 % ethanol 擦拭無菌操作抬面。操作間隔應讓無菌操作臺運轉5分鐘以上后，再進行下一個細胞株之操作。無菌操作工作區(qū)域應保持清潔及寬敞，必要物品，例如試管架、吸管吸取器或吸管盒等可以暫時放置，其它實驗用品用完即應移出，以利于氣流之流通。實驗用品以70 % ethanol 擦拭后才帶入無菌操作臺內。實驗操作應在抬面之中央無菌區(qū)域，勿在邊緣之非無菌區(qū)域操作。小心取用無菌之實驗物品，避免造成污染。勿碰觸吸管尖頭部或是容器瓶口，亦不要在打開之容器正上方操作實驗。容器打開后，以手夾住瓶蓋并握住瓶身，傾斜約45 角取用，盡量勿將瓶蓋蓋口朝上放置桌面。定期檢測下列項目： CO2 鋼瓶之CO2 壓力 、CO2 培養(yǎng)箱之CO2 濃度、溫度、及水盤是否有污染(水盤的水用無菌水，每周更換)、無菌操作臺內之airflow 壓力，定期更換紫外線燈管及HEPA 過濾膜，預濾網(300小時/預濾網，3000 小時/HEPA)、液氮罐中的液氮高度。 水槽可添加飽和硫酸銅溶液，并定期換水。6、血清的相關問題：血清必須貯存于20，若存放于4，不要超過一個月。如果一次無法用完一 瓶，可將4045 ml 分裝于無菌50 ml 離心管中，預留此膨脹體積之空間，以免容器凍裂。一般廠商提供之血清為無菌，不需再無菌過濾。若發(fā)現血清有許多懸浮物，則可將血清加入培養(yǎng)基內一起過濾，勿直接過濾血清。瓶裝(500ml) 血清一定要逐步解凍: 4冰箱溶解一天，至室溫下全溶后再分裝，在溶解過程中須規(guī)則搖晃均勻(小心勿造成氣泡)，使溫度與成分均一，減少沉淀的發(fā)生。勿直接由20直接至37解凍，因溫度改變太大，容易造成蛋白質凝結而發(fā)生沉淀。熱滅活是指56, 30 分鐘加熱已完全解凍之血清。加熱過程中須規(guī)則搖晃均勻。此熱處理之目的是使血清中之補體成份 去活化。除非必須，一般不要作此熱處理，因為會造成沉淀物之顯著增多，且會影響血清之品質。以我們實驗室做的對照試驗看，未滅活血清效果的確要好些。細胞培養(yǎng)基的基本知識.doc (36.5k)good, 很有幫助，謝謝7、貼壁細胞傳代培養(yǎng)：一般步驟為：真空泵吸走培養(yǎng)基，1XPBS漂洗兩次，加入1mlEDTA-Tripsin（100mm皿為例），37度放置數分鐘，輕拍培養(yǎng)瓶使細胞自瓶壁脫落，加入適量血清，以吸管上下吸放數次以打散細胞團塊，離心后加入新鮮培養(yǎng)基，按比例轉移至新皿。細胞的傳代最重要的是胰酶處理時間，若胰酶處理太久，容易造成細胞貼壁不緊，顯微鏡下觀察立體感不強，嚴重的時候甚至會造成細胞死亡。我談談個人經驗：HepG-2、A549、Hela、SGC-7901幾種癌細胞處理時間可適當放長，一般處理5-6min，C2C12、COS-7、NIH-3T3比較容易脫落，2min足矣，P19Cl6和293細胞貼壁不緊，可在PBS漂洗后，直接換新鮮培養(yǎng)基打散。8、細胞凍存及復蘇：首先說凍存液配方，常用的配方一般是兩種90%FCS+10%DMSO或70%培養(yǎng)基+20%FCS+10%DMSO。前一種較貴，而且后一種凍存效果也不錯，因此本人一般選用第二種配方。對于比較脆弱的細胞則選用前一種凍存液。凍存步驟比較簡單，前期處理同細胞傳代，只是在離心后是直接吸取上清，用手拍打離心管底部，加入適量凍存液使細胞完全懸浮后分裝于凍存管。制后先將凍存管放入4冰箱，約40min。 接著置于-20冰箱，約60min。置于-80超低溫冰箱中放置過夜。 最后置于液氮罐中長期保存。 同時做好凍存記錄，在自己的筆記本和凍存記錄本上均要記錄。注意事項：1使用DMSO前，不需要進行高壓滅菌，它本身就有滅菌的作用。高壓滅菌反而會破壞它的分子結構，以至于降低冷凍保護效果。2凍存時要選處于對數生長期的細胞，這樣效果要好很多3不宜將凍存細胞放置在0-60這一溫度范圍內過久，低溫損傷主要發(fā)生在這一溫度區(qū)內，是“危險溫區(qū)”。 4注意定期檢查液氮罐內液氮量，及時添加。5凍存液中的培養(yǎng)基要與培養(yǎng)時相同，避免細胞由于環(huán)境突然改變而死亡，在凍存管上也要標明培養(yǎng)基種類。6凍存液不要預熱。7程序凍存盒非常好用，省事省時效果還好，強烈推薦凍存使用凍存盒。細胞復蘇的原則是快速融化：必須將凍存在-196液氮中的細胞快速融化至37，使細胞外凍存時的冰晶迅速融化，避免冰晶緩慢融化時進入細胞形成再結晶，對細胞造成損害。具體步驟：1.將水浴鍋預熱至402.用75酒精擦拭紫外線照射30min的超凈工作臺臺面。3.在超凈工作臺中按次序擺放好消過毒的離心管、吸管、培養(yǎng)瓶等等。4.根據細胞凍存記錄按標簽找到所需細胞的編號。5.從液氮罐中取出細胞盒，取出所需的細胞，同時核對管外的編號。6.迅速將凍存管投入到已經預熱的水浴鍋中迅速解凍，并要不斷的搖動，使管中的液體迅速融化。7.約1-2min后凍存管內液體完全溶解，取出用酒精棉球擦拭凍存管的外壁，8.平衡后，放入離心機中3000r/min 離心3min9.吸棄上清液。10.向凍存管內加入1ml培養(yǎng)液，吹打制成細胞懸液。最后將細胞懸液分裝入培養(yǎng)瓶內，將培養(yǎng)瓶放入37和5CO2的培養(yǎng)箱內12-24小時后換液繼續(xù)培養(yǎng)培養(yǎng)，換液的時間由細胞情況而定。注意事項：1復蘇時選用的培養(yǎng)基要符合凍存管上標明的培養(yǎng)基。2操作人員應戴防護面罩及手套，防止冷凍管可能爆裂之傷害。3自液氮或干冰容器中取出冷凍管，檢查蓋子是否旋緊，由于熱脹冷縮過程，此時蓋子易松掉不好意思,寫錯了好東西，謝謝你的辛勤勞動。真空泵中間接一個10000ml的大燒瓶啊吸液的管子直接往燒瓶里漏，吸氣的一頭保證在液面以上就可以了那要看你用什么真空泵了.我們實驗室用的水泵,不會大量產熱,即使是空轉也沒有關系.單純用電機抽真空肯定是不行的.細胞傳代培養(yǎng)（消化法）具體操作：一. 傳代前準備：1.預熱培養(yǎng)用液：把已經配制好的裝有培養(yǎng)液、PBS液和胰蛋白酶的瓶子放入37水浴鍋內預熱。2.用75酒精擦拭經過紫外線照射的超凈工作臺和雙手。3.正確擺放使用的器械：保證足夠的操作空間，不僅便于操作而且可減少污染。4.點燃酒精燈：注意火焰不能太小。5.準備好將要使用的消毒后的空培養(yǎng)瓶，放入微波爐內高火，8分鐘再次消毒。6.取出預熱好的培養(yǎng)用液：取出已經預熱好的培養(yǎng)用液，用酒精棉球擦拭好后方能放入超凈臺內。7.從培養(yǎng)箱內取出細胞：注意取出細胞時要旋緊瓶蓋，用酒精棉球擦拭顯微鏡的臺面，再在鏡下觀察細胞。8.打開瓶口：將各瓶口一一打開，同時要在酒精燈上燒口消毒。二.胰蛋白酶消化；1.加入消化液：小心吸出舊培養(yǎng)液，用PBS清洗（沖洗），加入適量消化液（胰蛋白酶液），注意消化液的量以蓋住細胞最好，最佳消化溫度是37。2. 顯微鏡下觀察細胞：倒置顯微鏡下觀察消化細胞，若胞質回縮，細胞之間不再連接成片，表明此時細胞消化適度。3.吸棄消化液加入培養(yǎng)液：棄去胰蛋白酶液，注意更換吸管，加入新鮮的培養(yǎng)液。三.吹打分散細胞：1.吹打制懸：用滴管將已經消化細胞吹打成細胞懸液。2.吸細胞懸液入離心管：將細胞懸液吸入10ml離心管中。3.平衡離心：平衡后將離心管放入臺式離心機中，以1000轉/分鐘離心6-8分鐘。4.棄上清液，加入新培養(yǎng)液：棄去上清液，加入2ml培養(yǎng)液，用滴管輕輕吹打細胞制成細胞懸液。四.分裝稀釋細胞：1.分裝：將細胞懸液吸出分裝至2-3個培養(yǎng)瓶中，加入適量培養(yǎng)基旋緊瓶蓋。2.顯微鏡下觀察細胞：倒置顯微鏡下觀察細胞量，必要是計數。注意密度過小會影響傳代細胞的生長，傳代細胞的密度應該不低于5105/ml。最后要做好標記。今天做亞細胞定位，突然想起一個細節(jié)問題：不知其他戰(zhàn)友發(fā)現沒有，有時候做定位時會發(fā)現有些細胞是在玻璃片的另一面。這是因為細胞傳代時，玻璃片沒貼在底部，細胞就落在了培養(yǎng)皿底和玻璃片中間。這樣一來就會影響到觀察和拍照。我現在做亞細胞定位傳代時，都會先在皿里滴兩滴培養(yǎng)基，讓玻璃片貼在底部后再將細胞懸液加進去，這就避免了以上現象。養(yǎng)細胞的準備工作耗費了我好長時間。1 、查資料總結需要的儀器設備（要找到型號、價格、購買途徑）、試劑（廠商、型號、規(guī)格、價格、購買途徑）、雜碎用品（價格、購買途徑）2、聯系廠商購貨，大型儀器還要填報建設項目申請表，等待學校招標。3、著手建立實驗室。缺少的東西還要和其他院系交流，爭取合作。4、因本人是實驗室第一個做細胞的，還要找到其他老師，幫他們做試驗，同時學細胞培養(yǎng)的知識。MTT又是個細節(jié)問題極多的操作，做起來是需要一段時間摸索的。整個流程下來好累??！其實,最好的方法就是借一本好的細胞培養(yǎng)書:薛慶善和司徒鎮(zhèn)強編的都很好.只有書上說的才是最詳細的,很多東西可以知其然,并且知其所以然.固然,從其他人那里可以得到一些知識,但是為什么如此,不如此會有什么結果,比如:刷瓶子有什么用?泡酸有什么用?很多人只能夠籠統(tǒng)的說滅菌,其實不盡然.當然,我的意思并不是說,知道這些很重要,而是強調,從書上我們能夠獲得最詳盡最直接的知識.當書上說得不具體時,則可以來這里問問各位戰(zhàn)友,有的放矢,方為上策感謝上面的幾位朋友的大力幫助,我也再次溫習了一次很有幫助.謝謝非常不錯,讓我這個初學者受益匪淺!千言萬語匯成一句話：太謝謝了。非常感謝你的辛勤勞動,受益匪淺我是個新手，現在正準備做試驗。這些東西對我非常有用，謝謝大家！確實很不錯哦，非常具體，受益匪淺，謝謝非常感謝,馬上就開始做試驗,真是受益匪淺多謝各位前輩的總結，獲益匪淺！大家都寫的很多了，再補充一些關于試劑購買：一定要按ATCC或者細胞系構建者的建議使用相應的培養(yǎng)基，我試過用不同的，感覺培養(yǎng)出來的細胞形態(tài)有所不同，沒有進一步檢測其他指標。FBS最好能用進口的，hyclone或者gibco的都很好用。培養(yǎng)基使用一段時間后要注意酸堿度，我的經驗用過一段時間后很容易偏堿，對細胞的生長還是有一些影響的。關于培養(yǎng)箱中的水盤，忘了跟誰學的，在水盤里加入過飽和的CuSO4可以抑制霉菌的生長，我們一直在用，效果不錯。另外有個問題想問一下，大家擦培養(yǎng)箱的時候用什么擦？我們以前一直用復合醛再用酒精，可是最近看一個實驗室根本不怎么擦，頂多半年用酒精擦一次好像也沒有什么問題？多謝各位前輩的總結，獲益匪淺！培養(yǎng)箱每周一次0.1%新潔爾滅或75%酒精擦洗,但是我們實驗室之前也很少這么做也不見有問題!我覺得還是擦洗一下別抱僥幸心理好.太好了，多謝啊不錯 不錯 謝謝啊看了收益非淺，我要開始做后，也會把心得記錄下來，和戰(zhàn)友們進行交流。不過，目前我還是新手，希望大多指導哦！關注之中-受益匪淺啊謝謝啦沒想到 今天進這個板塊 受益這么多 多謝諸位請教各位老師了:我這兩天配培養(yǎng)液,是GIBC0的DMEM/F12,根據以往的經驗,將一袋DMEM/F12溶于1000毫升水,約加入2至3克NAHCO3,調PH值7.28左右就可以了,可是