分子診斷技術在結核病診治中的應用.ppt

分子診斷技術在結核病診治中的應用 武漢大學人民醫(yī)院檢驗醫(yī)學中心李艷 全球結核病流行狀況 WHOreport 2013 全球結核病流行狀況 全球結核感染人數(shù)2004年后處于下降趨勢HIV患者并發(fā)結核病數(shù)量處于平穩(wěn)階段中國結核感染人數(shù)全球排名第二 WHOreport 2013 全球結核病流行狀況 WHOreport 2013 全球結核病流行狀況 全球結核死亡人數(shù)處于下降趨勢斯威士蘭結核病感染率最高 WHOreport 2013 全球結核病流行狀況 Globally anestimated3 6 ofnewcasesand20 2 ofpreviouslytreatedcaseshaveMDR TBTherewereanestimated450 000newcasesofMDR TBworldwidein2012Onaverage anestimated9 6 ofMDR TBcaseshaveXDR TB WHOreport 2013 全球結核病流行狀況 2012年全球新發(fā)結核病例為860萬人 中國占總數(shù)的12 在860萬新病例中約110萬人 13 為HIV陽性 這些病例的75 在非洲每年約有130萬人死于結核病 我國為25萬結核病每24秒鐘就殺死1人預計未來20年還將有3600萬人死于結核病 全球每年有45萬新發(fā)MDR TB 大約4 3萬為XDR TB 4多 WHOreport 2013 結核病診治中存在的問題 預防問題 診斷問題 治療問題 醫(yī)療問題 檢驗人員最關心的問題 根據(jù)不同分子水平及技術特點來選擇診斷檢測體系 方法選擇 方法選擇的影響因素 Sputum 涂片 MTB培養(yǎng) 孵育4 8周 陽性 藥敏試驗 觀察孵育4周觀察生長情況 涂片 陽性 分子診斷技術 液體培養(yǎng)及藥敏試驗 平均時間2 3個月 平均時間20天 只需2小時 2天 涂陽 60 98 有結核分枝桿菌 因此涂陽后最好用分子生物學方法進行快速鑒定 擴增雜交 LAMP SDA 芯片 RT PCR SAT TMA FISH Probe 分子診斷適宜技術的選擇 T SPOT TB與QFT GI為IGRAs實驗 結核菌素試驗 TST T SPOT TB QuantiFERON TBGoldin tube QFT GI 蛋白質水平 全血IFN 釋放分析技術 IGRA 結核感染者體內(nèi)存在特異的效應T淋巴細胞 效應T淋巴細胞再次受到結核抗原刺激時會分泌多種細胞因子 IFN 因此 檢測效應T淋巴細胞可用于結核病或結核潛伏感染者的診斷 由于效應T細胞存活時間很短 而且具有特異性 因此可以作為機體是否正處于被感染的指標 無論是否有臨床癥狀 基于IGRA原理的產(chǎn)品目前已被美國 加拿大 英國 德國 意大利 瑞士 法國 荷蘭 日本等二十余個國家寫入本國的結核診療指南中 干擾素釋放實驗 酶聯(lián)免疫斑點技術 培養(yǎng)濾液蛋白10 CFP10 早期抗原靶6 ESAT 6 一 T SPOT技術基礎 T SPOT 由結核桿菌基因組RD1區(qū)相同的操縱子編碼的蛋白所有的卡介苗 BCG 均丟失該基因序列絕大多數(shù)的環(huán)境分枝桿菌也不存在RD1區(qū) 結核桿菌特異抗原 ESAT 6與CFP10抗原 PlamaPBMCsGelBarrierErythrocytes 檢測過程 分離PBMCs 加入PBMCs與結核特異抗原37 孵育16 20小時 PBMCs特異抗原 干擾素抗體 加入標記二抗 孵育1小時 加入顯色液 終止反應 觀察結果 1個斑點 1個效應T細胞 結果判斷圖 陰性結果 陽性結果 空白對照抗原AESAT 6抗原BCFP10陽性對照 PHA 潛伏性結核 LTBI 診斷技術比較 IGRAs與TST相比 具有更高的靈敏度和特異性IGRAs與BCG NTM無交叉反應 TST有交叉反應 難以從感染者中鑒別出活動性肺結核患者小于5歲兒童 免疫力低下患者不適合采用IGRAs檢測試劑成本非常高 costs 費用 availabilityforcliniciansandotherhealthworkers 醫(yī)療水平 patientacceptability 患者是否接受 easeofdistributionandstorage 實驗平臺 核酸擴增技術 SAT SimultaneousAmplificationandTesting RNA仁度 CPA CrossPrimingAmplification DNA RNA 優(yōu)思達 LAMP Loop MediatedIsothermalAmplification DNA Japan TMA TranscriptionMediatedAmplification RNA Gen Probe GenoType MTBDRplus HainLifescience NASBA NucleicAcidSequence BasedAmplification RNA OT RCA RollingCircleAmplification DNA MolecularStaging HDA Helicase DependantAmplification DNA Biohelix NEB RNA拷貝數(shù) DNA拷貝數(shù) 生命力旺盛的病原體RNA轉錄活躍 較好的愈后指標 交叉污染少 TMA SAT優(yōu)點 RNA作為臨床分子診斷靶標 二 SAT技術 同一溫度下 42 以RNA為起始模板 通過M MLV反轉錄酶產(chǎn)生一個雙鏈DNA拷貝 然后利用T7RNA多聚酶從DNA拷貝上產(chǎn)生多個 100 1000個 RNA拷貝 每一個RNA拷貝再從反轉錄開始進入下一個擴增循環(huán) 同時 帶有熒光標記的探針和這些RNA拷貝特異結合 產(chǎn)生熒光 該熒光信號可由熒光檢測儀器實時捕獲 直觀反映擴增循環(huán)情況 TB SAT操作步驟 陽性結果 陰性結果 恒溫擴增 42 CRNA檢測 起始靶標與擴增產(chǎn)物都是RNA擴增產(chǎn)物的污染更少 RNA環(huán)境中易降解更高的擴增效率 30分鐘內(nèi)擴增10億倍反應穩(wěn)定 抑制物少 高靈敏度 特異性活菌檢測操作簡單 快速 MTBDRsl 鑒定XDR MTBDRplus 鑒定MDR MTBC 鑒定MTB復合群 MTBCM 鑒定MTB和NTM 分類 Gene Probe TMA Hain 技術 三 MTBC 鑒定MTB復合群 TMA技術 方法名稱 HPV HybridizationProtectionAssay 雜交保護分析法為Gen probe公司專利原理 以rRNA為靶標 采用線性探針技術檢測結核分枝桿菌復合群檢測設備 LEADER50iHPA MTD MycobacteriumTuberculosisDirect 2 5h報告 直接從標本中檢測結核菌HPA Accuprobe 1h報告 用菌落或自動培養(yǎng)系統(tǒng)的菌 樣本 細胞溶解 目標r RNA釋放 MTD技術路線 雜交體 rRNA 60 C15分鐘 加入探針 探針 雜交 選擇性試劑 60 C 化學發(fā)光讀數(shù)儀 熒光檢測 MTD技術特點 MTD結核分枝桿菌檢測技術特點 采用分子技術快速鑒定 2 5小時 結核分枝桿菌復合群標本可以是涂片陰性或者陽性的痰標本 也可以是培養(yǎng)物唯一獲得FDA推薦的凃陰樣本快速檢測技術檢測RNA RNA只能來源于活的細菌 可鑒定活動性結核病人 采用TMA恒溫擴增 不使用PCR儀器 無需專業(yè)的PCR實驗室認證HPA雜交保護分析技術 靈敏 特異嚴格的實驗室防污染技術 整個實驗過程所有試劑和樣本全部在同一個反應管內(nèi)進行 杜絕交叉污染 MTD結核分枝桿菌的直接檢測意義 TB與其他分枝桿菌區(qū)分AIDS患者鳥分枝桿菌小腸黏膜感染龜分枝桿菌引起嚴重院內(nèi)感染 南方某醫(yī)院 提高TB檢出率CSF 胸腹水等疑似患者長期低熱 ESR持續(xù)增快 排除腫瘤和免疫性疾病患者 做血 痰TB菌MTD檢測 DNA作為臨床分子診斷靶標 四 MTBDRplus 鑒定MDR 方法名稱 耐多藥結核病 MDR TB 快速診斷為HainLifescience公司專利原理 采用線性探針技術 Line Probe或稱DNA Strip 檢測結核分枝桿菌復合群利福平 rpoB 和異煙肼 katG和inhA 等結核治療藥物的耐藥基因來判斷TB體內(nèi)耐藥性MTBDRplus 6h報告結核分枝桿菌復合群鑒定與耐藥結果 結核耐藥的分子機制 MTBDRplus技術路線 結果解釋 野生型 有雜交帶顯色為 表示未發(fā)生突變耐藥突變位點 有雜交帶顯色為 表示發(fā)生突變敏感 所有野生型探針 和所有耐藥位點探針 耐藥 對應藥物有1條野生型探針 或有1條耐藥位點 技術特點 MTBDRplus技術 MTBDRplus技術性能參數(shù) JClinMicrobiol 2010Aug 45 8 2635 40 Epub2007May30 MTBDRplus技術性能參數(shù) 中國人群存在一定數(shù)量的KatGS315N突變 WHO 蓋茨基金會推薦使用的快速線性探針技術 可以在6小時內(nèi)給出藥敏鑒定結果可以做一線結核藥物 異煙肼利福平 二線結核藥物的耐藥檢測 乙胺丁醇 氟喹諾酮類藥物 可注射結核藥物 標本可是涂片陽性的痰標本 或是培養(yǎng)物技術步驟簡單 核酸提取 PCR擴增 核酸雜交儀檢測每個試劑條上自帶質控 CC雜交質控 AC擴增質控 TUB結核分枝桿菌質控 確保整個實驗流程的可信度 HAIN 結核分枝桿菌耐藥快速檢測系統(tǒng)特點 五 交叉引物恒溫擴增技術 CrossPrimingAmplification CPA 本試劑盒將病原體DNA擴增 核酸雜交和核酸試紙條檢測三種技術有機地融為一體 在恒溫擴增反應中加入兩對TB特異性引物 一對特異性探針 同時一次性完成TBDNA的擴增及雜交過程 然后用3號一次性核酸檢測裝置對TB感染進行定性診斷 其檢測靈敏度為10個病原體 高特異引物設計確保了結果的可靠性 由于待測樣本的擴增 PCR管蓋和石蠟油雙重保護 和檢測過程均在物理封閉條件下完成 所以本試劑盒具有防止實驗室擴增物交叉污染 防止假陽性的效果 杭州優(yōu)思達公司 CPA技術原理圖 A 引入交叉引物位點 B 交叉引物擴增 C 檢測產(chǎn)物 CPA技術路線圖 有色顆粒 抗A抗體 雙重標記的特異性擴增物 陽性 抗 抗體 試紙條檢測結果判讀原理圖 結果的判讀 陽性 試紙條出現(xiàn)兩條紅色條帶 一條位于質控區(qū) C線 一條位于檢測區(qū) T線 且其強度 L4 與附帶的色卡比較 表明樣本中含有結核分枝桿菌 且其水平達到或超過本試劑盒的最低檢出限陰性 試紙條質控區(qū) C線 出現(xiàn)一條紅色條帶 檢測區(qū) T線 沒有條帶或者其強度 L4 與附帶的色卡比較 表明樣本中不含結核分枝桿菌 或其水平低于本試劑盒的最低檢出限無效 試紙條質控區(qū) C線 未出現(xiàn)條帶 表明試劑盒已損壞 失效或者操作有誤 恒溫擴增 CPA CPA的優(yōu)勢 快速 簡單 靈活 穩(wěn)定 Affordable低價 不需昂貴的設備和分子實驗室 Sensitive靈敏 10個菌 ml 與快培比較 87 Specific特異 能鑒別人型和牛型結核分枝桿菌 User friendly容易使用 不需PCR儀 操作簡單 Rapid robust快速 穩(wěn)定 樣本到結果2小時 Equipment free無儀器 僅需離心機 水浴鍋或金屬浴 Deliverable易儲運 不需冷鏈運輸 裝置可儲存于室溫 ASSURED CPA技術性能參數(shù) 六 環(huán)介導恒溫擴增技術 Loop MediatedIsothermalAmplification LAMP 環(huán)介導恒溫擴增法是日本榮研化學獨立研發(fā)的一種 簡便 快速 準確 廉價 的基因擴增方法 它的特征是針對目標DNA鏈上的六個區(qū)段設計四個不同的引物 然后再利用鏈置換反應在一定溫度下進行反應 反應只需要把基因模板 引物 鏈置換型DNA合成酶 基質等共同置于一定溫度下 60 65 經(jīng)一個步驟即可完成 擴增效率極高 可在15min 1h內(nèi)實現(xiàn)109 1010倍的擴增 而且由于有著高度的特異性 只需根據(jù)擴增反應產(chǎn)物的有無可對靶基因序列的存在與否作出判斷 不需要使雙鏈DNA先變性成單鏈擴增反應在等溫下可持續(xù)進行擴增效率極高針對六個區(qū)段使用兩種不同的引物 可特異性擴增靶基因序列僅使用一種鏈置換DNA聚合酶 成本低廉擴增產(chǎn)物是在同一條DNA鏈上互補序列周而復始形成大小不一的結構當模板是RNA時 僅需加入逆轉錄酶即可與DNA一樣進行擴增 LAMP技術原理動畫圖 LAMP方法建立階段所需的試劑 DNA擴增RNA擴增 模板DNA引物FIPF3BIPB3BstDNA聚合酶dNTPs反應緩沖液 模板RNA引物FIPF3BIPB3BstDNA聚合酶逆轉錄酶dNTPs反應緩沖液 LAMP技術結果判讀原理圖 LAMP法結果判斷方式 目視檢查混濁 LAMP法結果判斷方式 目視檢查綠色熒光 濁度檢測儀 擴增反應在等溫條件 60 65 下連續(xù)進行 可以使用簡便 廉價的擴增裝置擴增效率高 可在短時間內(nèi)完成擴增 可在短時間內(nèi)得出結果有非常高的特異性 可得出 擴增反應發(fā)生 有目的菌存在 的結論產(chǎn)生大量擴增產(chǎn)物 檢測方法簡便 無需用電泳 特殊探針等 可通過濁度儀 熒光目視方法確認擴增結果從擴增到檢測可在1個反應試管內(nèi) 封閉系統(tǒng) 完成 可防止由于擴增產(chǎn)物產(chǎn)生的污染從RNA經(jīng)一步反應可完成擴增 無需另外進行逆轉錄反應 小結 LAMP技術特點 LAMP技術的應用領域 食品領域 食物中毒致病菌的檢測 食品的衛(wèi)生管理 食物中毒的防止 臨床領域 病原菌 病毒的檢測及鑒定 通過SNP多態(tài)性分型決定用藥量 農(nóng)業(yè)領域 植物病害的早期發(fā)現(xiàn)及蔓延防止 轉基因作物的檢測 環(huán)境領域 環(huán)境 水中病原微生物的檢測 工業(yè)領域 工業(yè)產(chǎn)品用大量DNA的生產(chǎn)成為可能 畜牧業(yè)領域 雌雄性別判斷 病原微生物的檢測 遺傳病的發(fā)現(xiàn) LAMP技術性能參數(shù) 七 DNA微陣列 基因芯片 技術 DNA微陣列或芯片技術是利用光導化學合成 照相平板印刷以及固相表面化學合成等技術 在固相表面合成成千上萬個寡核苷酸探針 或將液相合成的探針由微陣列器或機器人點樣于尼龍膜或硅片上 再與放射性同位素或熒光物標記的DNA或cDNA雜交 用于分析DNA突變及多態(tài)性 DNA測序 監(jiān)測同一組織細胞在不同狀態(tài)下多種組織細胞基因表達水平的差異