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1樓一、名詞解釋 1cDNA與cccDNA：cDNA是由mRNA通過反轉(zhuǎn)錄酶合成的雙鏈DNA；cccDNA是游離于染色體之外的質(zhì)粒雙鏈閉合環(huán)形DNA。 2標準折疊單位：蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)單元螺旋與折疊通過各種連接多肽可以組成特殊幾何排列的結(jié)構(gòu)塊，此種確定的折疊類型通常稱為超二級結(jié)構(gòu)。幾乎所有的三級結(jié)構(gòu)都可以用這些折疊類型，乃至他們的組合型來予以描述，因此又將其稱為標準折疊單位。 3CAP：環(huán)腺苷酸（cAMP）受體蛋白CRP（cAMPreceptorprotein），cAMP與CRP結(jié)合后所形成的復合物稱激活蛋白CAP（cAMPactivatedprotein） 4回文序列：DNA片段上的一段所具有的反向互補序列，常是限制性酶切位點。 5micRNA：互補干擾RNA或稱反義RNA，與mRNA序列互補，可抑制mRNA的翻譯。 6核酶：具有催化活性的RNA，在RNA的剪接加工過程中起到自我催化的作用。 7模體：蛋白質(zhì)分子空間結(jié)構(gòu)中存在著某些立體形狀和拓撲結(jié)構(gòu)頗為類似的局部區(qū)域 8信號肽：在蛋白質(zhì)合成過程中N端有1536個氨基酸殘基的肽段，引導蛋白質(zhì)的跨膜。 9弱化子：在操縱區(qū)與結(jié)構(gòu)基因之間的一段可以終止轉(zhuǎn)錄作用的核苷酸序列。 10魔斑：當細菌生長過程中，遇到氨基酸全面缺乏時，細菌將會產(chǎn)生一個應急反應，停止全部基因的表達。產(chǎn)生這一應急反應的信號是鳥苷四磷酸(ppGpp)和鳥苷五磷酸（pppGpp）。PpGpp與pppGpp的作用不只是一個或幾個操縱子，而是影響一大批，所以稱他們是超級調(diào)控子或稱為魔斑。 11上游啟動子元件：是指對啟動子的活性起到一種調(diào)節(jié)作用的DNA序列，-10區(qū)的TATA、-35區(qū)的TGACA及增強子，弱化子等。 12DNA探針：是帶有標記的一段已知序列DNA，用以檢測未知序列、篩選目的基因等方面廣泛應用。 13SD序列：是核糖體與mRNA結(jié)合序列，對翻譯起到調(diào)控作用。 14單克隆抗體：只針對單一抗原決定簇起作用的抗體。 15考斯質(zhì)粒：是經(jīng)過人工構(gòu)建的一種外源DNA載體，保留噬菌體兩端的COS區(qū)，與質(zhì)粒連接構(gòu)成。 16藍-白斑篩選：含LacZ基因（編碼半乳糖苷酶）該酶能分解生色底物X-gal(5-溴-4-氯-3-吲哚-D-半乳糖苷)產(chǎn)生藍色，從而使菌株變藍。當外源DNA插入后，LacZ基因不能表達，菌株呈白色，以此來篩選重組細菌。稱之為藍-白斑篩選。 17順式作用元件：在DNA中一段特殊的堿基序列，對基因的表達起到調(diào)控作用的基因元件。 18Klenow酶：DNA聚合酶I大片段，只是從DNA聚合酶I全酶中去除了53外切酶活性 19錨定PCR：用于擴增已知一端序列的目的DNA。在未知序列一端加上一段多聚dG的尾巴，然后分別用多聚dC和已知的序列作為引物進行PCR擴增。 20融合蛋白：真核蛋白的基因與外源基因連接，同時表達翻譯出的原基因蛋白與外源蛋白結(jié)合在一起所組成的蛋白質(zhì)。 二、填空 1DNA的物理圖譜是DNA分子的（限制性內(nèi)切酶酶解）片段的排列順序。 2RNA酶的剪切分為（自體催化）、（異體催化）兩種類型。 3原核生物中有三種起始因子分別是（IF-1）、（IF-2）和（IF-3）。 4蛋白質(zhì)的跨膜需要（信號肽）的引導，蛋白伴侶的作用是（輔助肽鏈折疊成天然構(gòu)象的蛋白質(zhì)）。 5啟動子中的元件通?？梢苑譃閮煞N：（核心啟動子元件）和（上游啟動子元件）。 6分子生物學的研究內(nèi)容主要包含（結(jié)構(gòu)分子生物學）、（基因表達與調(diào)控）、（DNA重組技術(shù)）三部分。 7證明DNA是遺傳物質(zhì)的兩個關(guān)鍵性實驗是（肺炎球菌感染小鼠）、（T2噬菌體感染大腸桿菌）這兩個實驗中主要的論點證據(jù)是：（生物體吸收的外源DNA改變了其遺傳潛能）。 8hnRNA與mRNA之間的差別主要有兩點：（hnRNA在轉(zhuǎn)變?yōu)閙RNA的過程中經(jīng)過剪接，）、 （mRNA的5末端被加上一個m7pGppp帽子，在mRNA3末端多了一個多聚腺苷酸(polyA)尾巴）。 9蛋白質(zhì)多亞基形式的優(yōu)點是（亞基對DNA的利用來說是一種經(jīng)濟的方法）、（可以減少蛋白質(zhì)合成過程中隨機的錯誤對蛋白質(zhì)活性的影響）、（活性能夠非常有效和迅速地被打開和被關(guān)閉）。 2006-3-19 08:11 回復 10蛋白質(zhì)折疊機制首先成核理論的主要內(nèi)容包括（成核）、（結(jié)構(gòu)充實）、（最后重排）。 11半乳糖對細菌有雙重作用；一方面（可以作為碳源供細胞生長）；另一方面（它又是細胞壁的成分）。所以需要一個不依賴于cAMPCRP的啟動子S2進行本底水平的永久型合成；同時需要一個依賴于cAMPCRP的啟動子S1對高水平合成進行調(diào)節(jié)。有G時轉(zhuǎn)錄從（S2）開始，無G時轉(zhuǎn)錄從（S1）開始。 12DNA重組技術(shù)也稱為（基因克?。┗颍ǚ肿涌寺。?。最終目的是（把一個生物體中的遺傳信息DNA轉(zhuǎn)入另一個生物體）。典型的DNA重組實驗通常包含以下幾個步驟： 提取供體生物的目的基因（或稱外源基因），酶接連接到另一DNA分子上（克隆載體），形成一個新的重組DNA分子。 將這個重組DNA分子轉(zhuǎn)入受體細胞并在受體細胞中復制保存，這個過程稱為轉(zhuǎn)化。 對那些吸收了重組DNA的受體細胞進行篩選和鑒定。 對含有重組DNA的細胞進行大量培養(yǎng)，檢測外援基因是否表達。 13、質(zhì)粒的復制類型有兩種：受到宿主細胞蛋白質(zhì)合成的嚴格控制的稱為（嚴緊型質(zhì)粒），不受宿主細胞蛋白質(zhì)合成的嚴格控制稱為（松弛型質(zhì)粒）。 14PCR的反應體系要具有以下條件： a、被分離的目的基因兩條鏈各一端序列相互補的DNA引物（約20個堿基左右）。 b、具有熱穩(wěn)定性的酶如：TagDNA聚合酶。 c、dNTP d、作為模板的目的DNA序列 15PCR的基本反應過程包括：（變性）、（退火）、（延伸）三個階段。 16、轉(zhuǎn)基因動物的基本過程通常包括： 將克隆的外源基因?qū)氲揭粋€受精卵或胚胎干細胞的細胞核中； 接種后的受精卵或胚胎干細胞移植到雌性的子宮； 完成胚胎發(fā)育，生長為后代并帶有外源基因； 利用這些能產(chǎn)生外源蛋白的動物作為種畜，培育新的純合系。 17雜交瘤細胞系的產(chǎn)生是由（脾B）細胞與（骨髓瘤）細胞雜交產(chǎn)生的，由于（脾細胞）可以利用次黃嘌呤，（骨細胞）提供細胞分裂功能，所以能在HAT培養(yǎng)基中生長。 18隨著研究的深入第一代抗體稱為（多克隆抗體）、第二代（單克隆抗體）、第三代（基因工程抗體）。 19目前對昆蟲病毒的基因工程改造主要集中于桿狀病毒，表現(xiàn)在引入（外源毒蛋白基因）；（擾亂昆蟲正常生活周期的基因）；（對病毒基因進行修飾）。 20哺乳類RNA聚合酶啟動子中常見的元件TATA、GC、CAAT所對應的反式作用蛋白因子分別是（TFIID）、（SP-1）和（CTF/NF1）。 21RNA聚合酶的基本轉(zhuǎn)錄因子有、TF-A、TF-B、TFII-D、TF-E他們的結(jié)合順序是：（D、A、B、E）。其中TFII-D的功能是（與TATA盒結(jié)合）。 22與DNA結(jié)合的轉(zhuǎn)錄因子大多以二聚體形式起作用，轉(zhuǎn)錄因子與DNA結(jié)合的功能域常見有以下幾種（螺旋-轉(zhuǎn)角-螺旋）、（鋅指模體）、（堿性-亮氨酸拉鏈模體）。 23限制性內(nèi)切酶的切割方式有三種類型分別是（在對稱軸5側(cè)切割產(chǎn)生5粘端）、（在對稱軸3側(cè)切割產(chǎn)生3粘端（在對稱軸處切割產(chǎn)生平段）。 24質(zhì)粒DNA具有三種不同的構(gòu)型分別是：（SC構(gòu)型）、（oc構(gòu)型）、（L構(gòu)型）。在電泳中最前面的是（SC構(gòu)型）。 25外源基因表達系統(tǒng)，主要有（大腸桿菌）、（酵母）、（昆蟲）和（哺乳類細胞表）。 26轉(zhuǎn)基因動物常用的方法有：（逆轉(zhuǎn)錄病毒感染法）、（DNA顯微注射法）、（胚胎干細胞法）。 三、簡答 1分別說出5種以上RNA的功能？ 轉(zhuǎn)運RNAtRNA轉(zhuǎn)運氨基酸 核蛋白體RNArRNA核蛋白體組成成 信使RNAmRNA蛋白質(zhì)合成模板 不均一核RNAhnRNA成熟mRNA的前體 小核RNAsnRNA參與hnRNA的剪接 小胞漿RNAscRNA/7SL-RNA蛋白質(zhì)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)定位合成的信號識別體的組成成分 反義RNAanRNA/micRNA對基因的表達起調(diào)節(jié)作用 核酶RibozymeRNA有酶活性的RNA 2原核生物與真核生物啟動子的主要差別？ 原核生物 TTGACA-TATAAT-起始位點 -35-10 真核生物 增強子-GC-CAAT-TATAA5mGpp起始位點 -110-70-25 3對天然質(zhì)粒的人工構(gòu)建主要表現(xiàn)在哪些方面？ 天然質(zhì)粒往往存在著缺陷，因而不適合用作基因工程的載體，必須對之進行改造構(gòu)建： a、加入合適的選擇標記基因，如兩個以上，易于用作選擇,通常是抗生素基因。 b、增加或減少合適的酶切位點，便于重組。 c、縮短長度，切去不必要的片段，提高導入效率，增加裝載量。 d、改變復制子，變嚴緊為松弛，變少拷貝為多拷貝。 e、根據(jù)基因工程的特殊要求加裝特殊的基因元件 4舉例說明差示篩選組織特異cDNA的方法？ 制備兩種細胞群體，目的基因在其中一種細胞中表達或高表達，在另一種細胞中不表達或低表達，然后通過雜交對比找到目的基因。 例如：在腫瘤發(fā)生和發(fā)展過程中，腫瘤細胞會呈現(xiàn)與正常細胞表達水平不同的mRNA，因此，可以通過差示雜交篩選出與腫瘤相關(guān)的基因。也可利用誘導的方法，篩選出誘導表達的基因。 5雜交瘤細胞系的產(chǎn)生與篩選？ 脾B細胞+骨髓瘤細胞，加聚乙二醇（PEG）促進細胞融合，HAT培養(yǎng)基中培養(yǎng)（內(nèi)含次黃嘌呤、氨基蝶呤、T）生長出來的脾B-骨髓瘤融合細胞繼續(xù)擴大培養(yǎng)。 細胞融合物中包含： 脾-脾融合細胞：不能生長，脾細胞不能體外培養(yǎng)。 骨-骨融合細胞：不能利用次黃嘌呤，但可通過第二途徑利用葉酸還原酶合成嘌呤。氨基蝶呤對葉酸還原酶有抑制作用，因此不能生長。 骨-脾融合細胞：在HAT中能生長，脾細胞可以利用次黃嘌呤，骨細胞提供細胞分裂功能。 6、利用雙脫氧末端終止法（Sanger法）測定DNA一級結(jié)構(gòu)的原理與方法？ 原理是采用核苷酸鏈終止劑2，3，-雙脫氧核苷酸終止DNA的延長。由于它缺少形成3/5/磷酸二脂鍵所需要的3-OH，一旦參入到DNA鏈中，此DNA鏈就不能進一步延長。根據(jù)堿基配對原則，每當DNA聚合酶需要dNMP參入到正常延長的DNA鏈中時，就有兩種可能性，一是參入ddNTP,結(jié)果導致脫氧核苷酸鏈延長的終止；二是參入dNTP,使DNA鏈仍可繼續(xù)延長，直至參入下一個ddNTP。根據(jù)這一方法，就可得到一組以ddNTP結(jié)尾的長短不一的DNA片段。 方法是分成四組分別為ddAMP、ddGMP、ddCMP、ddTMP反應后，聚丙烯酰胺凝膠電泳按泳帶可讀出DNA序列。 7、激活蛋白（CAP）對轉(zhuǎn)錄的正調(diào)控作用？ 環(huán)腺苷酸（cAMP）受體蛋白CRP（cAMPreceptorprotein），cAMP與CRP結(jié)合后所形成的復合物稱激活蛋白CAP（cAMPactivatedprotein）。當大腸桿菌生長在缺乏葡萄糖的培養(yǎng)基中時，CAP合成量增加，CAP具有激活乳糖（Lac）等啟動子的功能。一些依賴于CRP的啟動子缺乏一般啟動子所具有的典型的-35區(qū)序列特征（TTGACA）。因此RNA聚合酶難以與其結(jié)合。 CAP的存在（功能）：能顯著提高酶與啟動子結(jié)合常數(shù)。主要表現(xiàn)以下二方面： CAP通過改變啟動子的構(gòu)象以及與酶的相互作用幫助酶分子正確定向,以便與-10區(qū)結(jié)合，起到取代-35區(qū)功能的作用。 CAP還能抑制RNA聚合酶與DNA中其它位點的結(jié)合，從而提高與其特定啟動子結(jié)合的概率。 8、典型的DNA重組實驗通常包括哪些步驟？ a、提取供體生物的目的基因（或稱外源基因），酶接連接到另一DNA分子上（克隆載體），形成一個新的重組DNA分子。 b、將這個重組DNA分子轉(zhuǎn)入受體細胞并在受體細胞中復制保存，這個過程稱為轉(zhuǎn)化。 c、對那些吸收了重組DNA的受體細胞進行篩選和鑒定。 d、對含有重組DNA的細胞進行大量培養(yǎng)，檢測外援基因是否表達。 9、基因文庫的構(gòu)建對重組子的篩選舉出3種方法并簡述過程。 抗生素抗性篩選、抗性的插入失活、蘭-白斑篩選或PCR篩選、差式篩選、DNA探針 多數(shù)克隆載體均帶有抗生素抗性基因（抗氨芐青霉素、四環(huán)素）。當質(zhì)粒轉(zhuǎn)入大腸桿菌中后，該菌便獲得抗性，沒有轉(zhuǎn)入的不具有抗性。但不能區(qū)分是否已重組。 在含有兩個抗性基因的載體中，如果外源DNA片段插入其中一個基因并導致該基因失活，就可用兩個分別含不同藥物的平板對照篩選陽性重組子。如pUC質(zhì)粒含LacZ基因（編碼半乳糖苷酶）該酶能分解生色底物X-gal(5-溴-4-氯-3-吲哚-D-半乳糖苷)產(chǎn)生藍色，從而使菌株變藍。當外源DNA插入后，Lac