酶的提取與分離純化-1.ppt

第三章酶的提取與分離純化 電泳 electrophoresis EP 指帶電粒子在電場(chǎng)中向著與其所帶電荷性質(zhì)相反的電極方向移動(dòng)的過程 電泳技術(shù)是根據(jù)各種帶電粒子在電場(chǎng)中遷移速度的不同而對(duì)物質(zhì)進(jìn)行分離的實(shí)驗(yàn)技術(shù) 第四節(jié)電泳 一 電泳的基本理論1 原理 在一定pH條件下 用buffer 不同大小 形狀及帶電顆粒在電場(chǎng)中的移動(dòng)速度不同 用遷移率表示 各自集中到特定的位置上而形成緊密的泳動(dòng)帶 影響遷移率的因素 顆粒性質(zhì) Q越大 r越小 形狀越接近球形 v越快 電場(chǎng)強(qiáng)度 E越高 v越快 電泳液 pH值 離pI越遠(yuǎn) v越快 用buffer保持恒定 離子強(qiáng)度 離子強(qiáng)度越高 v越低 通常 緩沖液離子強(qiáng)度在0 02 0 2之間 電滲 在電場(chǎng)中 液體對(duì)于固體支持物的相對(duì)移動(dòng) 應(yīng)避免用高電滲物質(zhì)作支持介質(zhì) 自由界面電泳 又稱移動(dòng)界面電泳 指在沒有支持介質(zhì)的溶液中進(jìn)行的電泳 區(qū)帶電泳 指有支持介質(zhì)的電泳 待分離物質(zhì)在支持介質(zhì)上分離成若干區(qū)帶 支持介質(zhì)的作用 防止電泳過程中的對(duì)流和擴(kuò)散 2 電泳的分類 按支持介質(zhì)種類的不同 區(qū)帶電泳可分為 紙電泳 用濾紙作支持介質(zhì) 用于核苷酸定性定量分析 醋酸纖維素薄膜電泳 常用于分析血清蛋白 胎盤球蛋白 優(yōu)點(diǎn)是簡(jiǎn)便迅速 便于保存照相 比紙電泳分辨率高 以上兩種類型的電泳 由于介質(zhì)的孔徑度大 沒有分子篩效應(yīng) 主要靠被分離物的電荷多少進(jìn)行分離 瓊脂糖凝膠電泳 一般用于核酸的分離分析 瓊脂糖凝膠孔徑度較大 對(duì)大部分蛋白質(zhì)只有很小的分子篩效應(yīng) 聚丙烯酰胺凝膠電泳 用于核酸和蛋白質(zhì)的分離 純化及檢測(cè) 分辨率高 聚丙烯酰胺和瓊脂糖是目前實(shí)驗(yàn)室最常用的支持介質(zhì) 3 電泳常用設(shè)備 1 電泳儀 提供穩(wěn)定直流電源的裝置 常壓電泳儀 600V 高壓電泳儀 3000V 超高壓電泳儀 30000V 50000V 2 電泳槽 自由界面電泳槽管狀電泳槽板狀電泳槽 3 附屬設(shè)備 二 聚丙烯酰胺凝膠電泳 聚丙烯酰胺凝膠電泳 polyacrylamidegelelectrophoresis PAGE 是以聚丙烯酰胺凝膠作為支持介質(zhì)的一種電泳方法 1 原理聚丙烯酰胺凝膠是由丙烯酰胺單體 Acr 和交聯(lián)劑N N 甲叉雙丙烯酰胺 Bis 在催化劑和加速劑作用下聚合的 CH2 CH C O NH2 CH2 CH C ONHCH2NHC OCH2 CH CH2 CH CH2 CH nCH2 CH C OC ONH2NHCH2NHC O CH2 CH CH2 CH nCH2 CH C OC ONHNH2 丙烯酰胺 N N 甲叉雙丙烯酰胺 聚丙烯酰胺 Acr Bis 聚丙烯酰胺凝膠聚合的催化體系有兩種 1 化學(xué)催化系統(tǒng) AP TEMED催化劑 過硫酸銨 ammoniumpersulfate AP 加速劑 TEMED N N N N 四甲基乙二胺 2 光催化系統(tǒng) 核黃素 光 TEMED 催化劑 核黃素 維生素B2 引發(fā)劑 光TEMED的存在 可加速聚合 凝膠濃度越大 小 孔徑越小 大 可分離分子量較小 大 的顆粒 Acr與Bis的重量比應(yīng)在30左右 凝膠濃度和交聯(lián)度與孔徑大小的關(guān)系 聚丙烯酰胺凝膠濃度參考表 2 分離效應(yīng)PAGE根據(jù)其有無(wú)濃縮效應(yīng) 分為 連續(xù)電泳采用相同孔徑的凝膠和相同的緩沖系統(tǒng)不連續(xù)電泳采用不同孔徑的凝膠和不同緩沖體系電荷效應(yīng)不連續(xù)PAGE分子篩效應(yīng)濃縮效應(yīng) 連續(xù)PAGE 電荷效應(yīng) 分離膠中 蛋白質(zhì)表面凈電荷不同 遷移率不同 分子篩效應(yīng) 大小和形狀不同的樣品分子通過一定孔徑的分離膠時(shí) 受阻滯的程度不同而表現(xiàn)出不同的遷移率 濃縮效應(yīng) 使樣品在濃縮膠中被濃縮成一條窄帶 然后再進(jìn)入分離膠進(jìn)行分離 不連續(xù)聚丙烯酰胺凝膠電泳 系統(tǒng)的不連續(xù)性表現(xiàn)在以下幾個(gè)方面 1 凝膠分上 下兩層 上層為大孔徑的濃縮膠 下層為小孔徑的分離膠 2 緩沖液離子組成及各層凝膠的pH不同 電極緩沖液為pH8 3的Tris 甘氨酸緩沖液 濃縮膠為pH6 8的Tris HCl緩沖液 分離膠為pH8 8的Tris HCl緩沖液 3 在電場(chǎng)中形成不連續(xù)的電位梯度 不連續(xù)系統(tǒng) 有三種物理效應(yīng) 即樣品的濃縮效應(yīng) 凝膠的分子篩效應(yīng)和電荷效應(yīng) 提高了分辨率 三 SDS 聚丙烯酰胺凝膠電泳十二烷基硫酸鈉 聚丙烯酰胺凝膠電泳 sodiumdodecylsulphate polyacrylamidegelelectrophoresis SDS PAGE 簡(jiǎn)稱SDS PAGE 是目前測(cè)定蛋白質(zhì)亞基相對(duì)分子量的一種最好的辦法 1 原理 SDS是種陰離子去污劑 帶有大量負(fù)電荷 與蛋白質(zhì)結(jié)合后使蛋白質(zhì)所帶負(fù)電荷大大超過了天然蛋白質(zhì)原有的負(fù)電荷 因而消除或掩蓋了不同種類蛋白質(zhì)間原有電荷的差異 SDS破壞蛋白質(zhì)氫鍵 疏水鍵 巰基乙醇使二硫鍵打開 引起蛋白質(zhì)構(gòu)象改變 使蛋白質(zhì) SDS復(fù)合物形狀近似橢圓形 短軸相同 1 8nm 長(zhǎng)軸與蛋白質(zhì)分子量成正比 因此 蛋白質(zhì) SDS復(fù)合物在凝膠中的遷移率不受蛋白質(zhì)原有電荷和形狀的影響 只與橢圓棒長(zhǎng)度 蛋白質(zhì)分子量 有關(guān) 未知蛋白質(zhì)在相同條件下進(jìn)行電泳 可在標(biāo)準(zhǔn)曲線上求得分子量 2 操作 SDS PAGE及PAGE 即變性及非變性 1 制膠 變性 buffer中加0 4 SDS a 分離膠 根據(jù)待分離樣品的分子大小選擇一定濃度的分離膠 查表 配制分離膠溶液 Acr Bis 29 1 分離膠buffer TEMED AP 水迅速倒膠 加水使液面平坦 室溫0 5h聚合完全 b 濃縮膠 用濃縮膠buffer 插上梳子 2 樣品制備 a PAGE 樣品 樣品緩沖液 蔗糖或甘油 指示劑溴酚藍(lán) b SDS PAGE 樣品 樣品緩沖液 SDS 甘油 巰基乙醇 溴酚藍(lán) 煮沸2 5min 以除去亞穩(wěn)態(tài)聚合 3 加樣及電泳 SDS PAGE 電極buffer中加0 1 SDS 溴酚藍(lán)距下端1cm時(shí)停止電泳 4 固定及染色a 固定 將凝膠浸于7 乙酸或12 5 三氯乙酸中固定蛋白質(zhì)組分 b 染色 考馬斯亮藍(lán)染色法銀染法 靈敏度比前者高100倍 其它的染色方法 氨基黑 阿爾辛藍(lán) 過碘酸 Schiff試劑 糖蛋白 四 等電聚焦電泳 isoelectricfocusing IEF 利用蛋白質(zhì)具有不同等電點(diǎn)的特性 以聚丙烯酰胺為電泳支持物 在其中加入載體兩性電解質(zhì) 商品名 Ampholine 一種含有各種連續(xù)pI的小分子混合物 的電泳方法稱聚丙烯酰胺等電聚焦電泳 IEF PAGE 自學(xué) 第五節(jié)酶的濃縮 干燥與結(jié)晶一 酶的濃縮1蒸發(fā)濃縮 圖4 60減壓蒸發(fā)濃縮的簡(jiǎn)易裝置1蒸餾瓶2毛細(xì)管3螺旋夾4橡皮管5溫度計(jì)6出水口7冷凝器8進(jìn)水口9連接管10抽氣口11接收瓶 2超濾濃縮超濾濃縮以壓力差為動(dòng)力 將待濃縮溶液通過超濾膜 酶分子較大被滯留 水分子和小分子選擇性透過 達(dá)到濃縮目的 圖4 61酶的超濾濃縮 3吸水劑 膠過濾濃縮利用葡聚糖凝膠SephadexG 25或G 50等的吸水特性 將干膠直接加入樣品溶液 吸水膨潤(rùn)后 再過濾或離心分出濃縮的酶液 聚乙二醇濃縮 聚乙二醇 polyethyleneglycol 簡(jiǎn)稱PEG 利用PEG的吸水特性 將PEG涂于裝有酶溶液的透析袋上 置于4 下 干PEG粉末吸收水和鹽類 酶溶液即被濃縮 一般用分子量大的PEG 如PEG6 000和PEG20 000 以防止PEG進(jìn)入蛋白質(zhì)溶液 4反復(fù)凍融濃縮利用酶溶液相對(duì)于純水冰點(diǎn)較低的原理使酶分子與小分子物質(zhì)分離 5沉淀法鹽析法 有機(jī)溶劑法 二 酶的干燥酶的干燥多采用冷凍干燥法 將酶溶液在較低溫度下 10 到 50 凍結(jié)成固態(tài) 然后在高度真空條件下 將其中固態(tài)水分直接升華為氣態(tài)而除去 也稱酶的升華干燥 三 酶的結(jié)晶結(jié)晶 Crystallization 是指物質(zhì)以晶體的狀態(tài)從蒸汽或溶液中析出的過程 結(jié)晶的條件酶的純度 純度越高越易結(jié)晶 50 2 酶的濃度 恰到好處 濃度越高越易結(jié)晶 控制在飽和區(qū)以上 過飽和區(qū)以下的介穩(wěn)區(qū)內(nèi) 3 結(jié)晶溫度4 溶液pH5 離子強(qiáng)度6 晶核7 結(jié)晶時(shí)間 第五節(jié)純化方案的設(shè)計(jì)與評(píng)價(jià)一 純化方案的設(shè)計(jì)1純化方法的選擇依據(jù)根據(jù)有效成分和雜質(zhì)之間理化性質(zhì)的差異 調(diào)節(jié)溶解度 沉淀法 根據(jù)分子大小 形狀的不同 離心分離 膜分離 凝膠過濾 根據(jù)分子電荷性質(zhì)的不同 離子交換層析 電泳 根據(jù)專一性結(jié)合的方法 親和層析 其它 吸附層析 疏水層析 2純化方法的排序先選用粗放 快速 有利于縮小樣品體積的方法 精確 費(fèi)時(shí) 需樣品少的方法 宜后選用 二 純化方案的評(píng)價(jià)1酶活力測(cè)定 酶活力 enzymeactivity 又稱酶活性 即單位時(shí)間內(nèi)酶促反應(yīng)的產(chǎn)物生成量 是酶催化某一化學(xué)反應(yīng)的能力 方法 在酶反應(yīng)開始后不同時(shí)間 從反應(yīng)系統(tǒng)中取出一定量反應(yīng)液 用適當(dāng)方法停止其反應(yīng)后 再根據(jù)產(chǎn)物和底物在物化性質(zhì)上的差別進(jìn)行分析 求得單位時(shí)間的酶促反應(yīng)變化量 常用的方法 化學(xué)分析法 比色法 產(chǎn)物可與特定的化學(xué)試劑反應(yīng)生成穩(wěn)定的有色溶液 分光光度法 利用底物和產(chǎn)物光吸收性質(zhì)的不同 量氣法 酶促反應(yīng)中產(chǎn)物或底物之一為氣體 滴定法 pH值測(cè)量法 產(chǎn)物之一是自由的酸性物質(zhì)或堿性物質(zhì) 多用pH電極測(cè) 常用終止反應(yīng)方法 改變反應(yīng)最適條件 加酸 堿 加熱 加酶變性劑 5 三氯乙酸 酶活力單位 通常采用國(guó)際酶學(xué)委員會(huì)規(guī)定的單位 在純化過程中 為了方便 可采用自行規(guī)定的單位 只要達(dá)到可比較的目的即可 如直接以光密度值表示 2蛋白質(zhì)濃度測(cè)定 紫外吸收法 酪氨酸 色氨酸殘基中苯環(huán)有共軛雙鍵 在A280有最大吸收 特點(diǎn) 簡(jiǎn)便 快速 不損耗樣品 但干擾因素多 雙縮脲法 具有兩個(gè)或兩個(gè)以上肽鍵的化合物均有雙縮脲反應(yīng) 優(yōu)點(diǎn) 快速 缺點(diǎn) 靈敏度差 酚試劑 Folin 酚 測(cè)定法 繁瑣 但靈敏度 準(zhǔn)確度高 染料結(jié)合法 考馬斯亮藍(lán)染色法 又稱Bradford法 靈敏 簡(jiǎn)便 快速 干擾少 是常用的檢測(cè)法 3酶的純化指標(biāo)純度提純倍數(shù)回收率常用比活力表示酶的純度 酶活力 u ml 比活力 蛋白質(zhì)含量 mg蛋白 ml酶液 比活力越高 酶純度也越好 提純倍數(shù) 提純后比活力 提純前比活力提純倍數(shù)越大 表示該方法純化效果越好 回收率 提純后酶總活力 提純前酶總活力 100 表示提純過程中酶損失程度的大小 回收率越高 損失越小 總活力 酶活力單位數(shù) 酶液總體積即樣品中全部酶活力 判斷一個(gè)分離純化方法的優(yōu)劣 常用總活力的回收率和比活力的提純倍數(shù)兩個(gè)指標(biāo) 回收率 反映酶的損失情況 提純倍數(shù) 表示方法的有效程度 一個(gè)好的純化步驟是回收率較高 提純倍數(shù)也較大 4純化表 提純倍數(shù) 0 6 0 416 1 449 8 0 4