維生素B12的發(fā)酵.doc

維生素B12 的發(fā)酵及應(yīng)用吉韜（2010310126 10生物技術(shù)）摘要：本文綜述維生素B12的基本性質(zhì)，生物合成途徑以及發(fā)酵生產(chǎn)工藝，并對B12的應(yīng)用與市場前景做了分析關(guān)鍵詞: 維生素B12 發(fā)酵 提取 抗生素 一、引言維生素B12是一種水溶性維生素。只需少量即能產(chǎn)生效果， 為深紅色結(jié)晶或結(jié)晶粉末又稱為紅色維生素（red vitamin）或氰鈷胺。維生素 B12具有廣泛的生理作用，它參與體內(nèi)甲基轉(zhuǎn)換及葉酸代謝，促進神經(jīng)髓鞘中脂蛋白的形成，保持中樞神經(jīng)和外周髓鞘神經(jīng)纖維的功能完整，參與廣泛的蛋白質(zhì)及脂肪代謝等。其計量單位為微克（mcgmicrogram，即1/1000000克）。二、正文1. 結(jié)構(gòu)與性質(zhì)維生素B12（VB12）為鈷胺素（Cobalamin）類化合物，他的分子中有4個還原性吡咯環(huán)聯(lián)結(jié)在一起，這種構(gòu)叫做咕啉，他與核苷酸（二甲基苯異咪唑）及核糖相聯(lián)，另一方面與D-1-氨基-2-丙醇相連，鈷與核苷酸之N相偶聯(lián)?；瘜W(xué)上稱氰鈷胺素為維生素B12，除CN后稱鈷胺至少。CN可為其他基團代替，成為不同類型的鈷胺素。一般稱對哺乳類有生理作用的為鈷胺素，稱對哺乳類及微生物都有作用的為維生素B12。本文中維生素B12泛稱此類物。氰鈷胺至少自然界很少，為人工合成產(chǎn)品，可從其他類型轉(zhuǎn)換而來。他是紅色結(jié)晶，其活力為重金屬及氧化還原劑所破壞，但在短期高壓消毒（12）不被破壞，能溶解在1：80水中，溶液為中性，在PH4.55時最穩(wěn)定。輔酶B12（即5-脫氧腺鉗鈷胺素）及甲基B12（甲基鈷胺素）為哺乳類（人類）組織中最主要的輔酶形式。前者在線粒體內(nèi)，后者在胞漿內(nèi)，為合成蛋氨酸所必需者。它們對光不穩(wěn)定，光解后形成水鈷胺素。在氰存在下變成氰鈷胺素，維生素B12、B12a、B12b、B12c都可治療維生素B12的缺乏。氰鈷胺素分子式（CN可以其他基團代替） 氰鈷胺素分子式（CN可以其他基團代替）2.主要功能1）是提高葉酸利用率，與葉酸一起合成甲硫氨酸（由高半胱胺選合成）和膽堿，產(chǎn)生嘌呤和嘧啶的過程中合成氰鈷胺申基先驅(qū)物質(zhì)如甲基鈷胺和輔酶B12，參與許多重要化合物的甲基化過程。維生素B12缺乏時，從甲基四氫葉酸上轉(zhuǎn)移甲基基團的活動減少，使葉酸變成不能利用的形式，導(dǎo)葉酸缺乏癥2）是維護神經(jīng)髓鞘的代謝與功能。缺乏維生素B12時，可引起神經(jīng)障礙、脊髓變性，并可引起嚴重的精神癥狀。維生素B12缺乏可導(dǎo)致周圍神經(jīng)炎。小孩缺乏維生素B12的早期表現(xiàn)是情緒異常、表情呆滯、反應(yīng)遲鈍，最后導(dǎo)致貧血。 3）是促進紅細胞的發(fā)育和成熟。將甲基丙二酰輔酶A轉(zhuǎn)化成琥珀酰輔酶A，參與三羧酸循環(huán)，其中琥珀酰輔酶A與血紅素的合成有關(guān)。 4），是維生素B12還參與脫氧核酸（DNA）的合成，脂肪、碳水化合物及蛋白質(zhì)的代謝，增加核酸與蛋白質(zhì)的合成。 3 主要用途3.1醫(yī)療方面用于治療和預(yù)防維生素B12缺乏癥。 用于胃切除或吸收不良綜合癥，維生素B12缺乏造成貧血的預(yù)防。 用于補充因消耗性疾病，甲狀腺機能亢進，妊娠，哺乳等造成的維生素B12需求增加。 貧血。 肝障礙貧血。 放射性引起的白細胞減少。 神經(jīng)疼，肌肉疼，關(guān)節(jié)疼。 末梢神經(jīng)炎，末梢神經(jīng)麻痹。 脊髓炎，脊髓變性。 3.2飼料添加劑維生素B12對于機體生長是一種不可缺少的微量營養(yǎng)物質(zhì)，大多數(shù)動物的植物性飼料中不含維生素B12，動物一方面靠胃腸中的微生物合成，一方面靠外界添加。為了滿足動物維生素的需要就必須補充維生素添加劑。 豬和雞等非反芻動物缺乏維生素B12主要表現(xiàn)是生長發(fā)育停滯，也有少數(shù)豬可出現(xiàn)輕度的正常紅細胞性貧血。此外，還可使雞的孵化率和豬的生殖率降低。缺乏癥的臨床癥狀包括食欲不振、生長停滯、單純貧血，嚴重的也有神經(jīng)癥狀。 飼料維生素B12能促進家禽，特別是幼禽幼畜的生長發(fā)育。 可用于： 維生素B12缺乏所引起的豬、雞生長發(fā)育不良和貧血； 缺鈷地區(qū)牛、羊所出現(xiàn)的地方性消瘦??； 神經(jīng)炎、神經(jīng)痛等的非特異性治療； 提高飼料蛋白的利用率； 經(jīng)濟動物的飼養(yǎng)； 用B12溶液處理魚卵或魚苗，可提高魚對水中有毒物質(zhì)如苯和重金屬的耐受力。 3.3其它食品添加劑 可作為儀器著色劑：如火腿，香腸，冰淇淋，魚肉醬。 用于化妝品，肥皂，牙膏等，也可用于廁所，冰箱，口腔等防臭，消除硫化物和醛的氣味。4、維生素B12的發(fā)酵生產(chǎn)（一）抗生素廢液中提取早在1952年美國T.R.Wood等人就發(fā)現(xiàn),當(dāng)用加有鈷化合物的培養(yǎng)基培養(yǎng)灰色鏈霉菌時,可大大提高維生素B12在整個培養(yǎng)液中的濃度,但是對于鈷化合物的濃度要求要適量,過高的濃度會對菌體細胞產(chǎn)生毒性;另有研究表明,添加適量的氰化合物也同樣可促進抗生素廢液中B12類似物的含量,但需嚴格掌握其用量(二)放線菌發(fā)酵自從人們發(fā)現(xiàn)可從抗生素廢液中提取得到維生素B12后,許多科學(xué)家將目光轉(zhuǎn)向了采用放線菌,其中主要是鏈霉菌屬中的灰色鏈霉菌和橄欖色鏈霉菌來發(fā)酵產(chǎn)維生素B12,而于鏈霉素的生成,而始終未能使得維生素B12的產(chǎn)生處于主導(dǎo)地位,因此,我們應(yīng)選出鏈霉素發(fā)酵支路的關(guān)鍵酶,并將其抑制,這樣便可大大提高維生素B12的得率,使得大量產(chǎn)生維生素B12成為可能（三）下水道廢液中提取采用生物活性污泥法處理的廢水中,通常含有多的B12,干的活性污泥可先用水浸提,然后過濾掉固形顆粒,之后可分離、純化B12，此得到的B12有如下特點:1、無需前培養(yǎng),這樣大大減少了前期投入;2能耗大,尤其是濃縮這一關(guān)鍵性步驟將造成大的能量損耗;3、用此法得到的B12的濃度雖并不低,但受活性污泥這一來源的影響,由此獲得的B12并不能直接進入食品或藥品級產(chǎn)品,而通常只局限于飼料添加劑（四）丙酸菌發(fā)酵 (五）巨大芽孢桿菌生產(chǎn) VB12以巨大芽孢桿菌為例,將培養(yǎng)基用氨水調(diào)至pH7.0,發(fā)酵液需要連續(xù)不停地攪拌和大量通氣,溫度需控制在30左右,每隔一定時間需用5%的氨水來調(diào)pH,同時需定期補充碳、氮源,以期達到最高產(chǎn)量(六）采用轉(zhuǎn)基因的發(fā)酵生產(chǎn)目前,人們對于B12的控制基因已經(jīng)非常清因此,這就使得將其轉(zhuǎn)入大腸桿菌,以期大量生產(chǎn),但該方法真正用于大生產(chǎn)還有待時日,即使用于生產(chǎn),也會不可避免地存在這樣的問題,如導(dǎo)入的質(zhì)粒不能穩(wěn)定地遺傳下去,會隨發(fā)酵條件的變化而脫落等,因此,就近些年,維生素B12的生產(chǎn)仍需按傳統(tǒng)發(fā)酵來完成5、維生素B12的提取對于維生素B12提取,不斷有新的方法提出,主要有兩種,一種為溶劑提取法,另一種為離子交換樹脂法(一)有機溶劑提取研究表明,采用兩相混合溶劑,可簡單地純化和提取出來,常用的溶劑為苯甲醇和水的混合溶液,基本過程如下:發(fā)酵液吸附(活性碳)洗脫(吡啶)濃縮層析(Al2O3)洗脫(甲醇)收集紅色液濃縮結(jié)晶（二）離子交換樹脂法離子交換樹脂法提取隨著離子交換柱在工業(yè)上的廣泛應(yīng)用,人們嘗試用陰陽離子交換樹脂來進行維生素B12的提取,并取得了較好的效果,過程如下所示:發(fā)酵液陽離子樹脂(LonacC-240)陰離子樹脂(LonacAC-300)蒸餾水沖洗收集紅色液體部分濃縮冷凍干燥86、目前維生素B12發(fā)酵生產(chǎn)面臨的問題及今后的發(fā)展方向針對目前國內(nèi)維生素B12的發(fā)展?fàn)顩r,提出如下的發(fā)展方向:（1）搞好維生素B12發(fā)酵菌株的選育工作,同時可借助于紫外線誘變、原生質(zhì)體融合等生物技術(shù)工程手段,提高單株的產(chǎn)量（2）進行高密度培養(yǎng),首先增加生物量,以期提高單位發(fā)酵效率;（3）由于目前關(guān)于維生素B12的代謝途徑和基因表達序列已基本研究清楚，因此,可采用基因工程手段,使該基因片段能在宿主細胞中多次表達,并使其能穩(wěn)定遺傳,將會是維生素B12發(fā)酵的一大革命;（4）研制新型的誘導(dǎo)劑,以進一步提高其產(chǎn)量;（5）研制高效專用的生物反應(yīng)器,采用連續(xù)流加培養(yǎng);（6）采用固定化技術(shù),將菌種包埋或吸附于載結(jié)束語發(fā)酵周期過長、菌體量和產(chǎn)物積累量不一致,都直接導(dǎo)致了維生素B12的生產(chǎn)成本過高。高產(chǎn)菌株的獲得是發(fā)酵生產(chǎn)的關(guān)鍵,在改進發(fā)酵工藝的同時,對生產(chǎn)菌的育種工作也備受關(guān)注,目前利用傳統(tǒng)方法誘變育種和基因工程育種的研究方興未艾。維生素B12是微生物次級代謝產(chǎn)物,反饋調(diào)節(jié)機制對菌體中維生素B12的積累具有重要作用。只有進行詳盡代謝