核酸提取和注意事項(xiàng).ppt

學(xué)習(xí)匯報(bào)核酸提取的原理及方法 匯報(bào)人 富貴青海大學(xué)2010級(jí)研究生 前言 核酸是遺傳信息的載體 是最重要的生物信息分子 是分子生物學(xué)研究的主要對(duì)象 因此 核酸的提取是分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)中最重要 最基本的操作 核酸簡(jiǎn)介基因組DNA提取質(zhì)粒DNA提取真核細(xì)胞總RNA提取瓊脂糖凝膠電泳 核酸是由核苷酸或脫氧核苷酸通過3 5 磷酸二酯鍵連接而成的一類生物大分子 包括核糖核酸 RNA 和脫氧核糖核酸 DNA 兩類 DNA主要儲(chǔ)存遺傳信息 RNA主要傳遞遺傳信息 核酸簡(jiǎn)介 質(zhì)粒 Plasmid 是一種染色體外的穩(wěn)定遺傳因子 大小從1 200kb不等 為雙鏈 閉環(huán)的DNA分子 并以超螺旋狀態(tài)存在于宿主細(xì)胞中 質(zhì)粒主要發(fā)現(xiàn)于細(xì)菌 放線菌和真菌等細(xì)胞中 它具有自主復(fù)制和轉(zhuǎn)錄能力 能在子代細(xì)胞中保持恒定的拷貝數(shù) 并表達(dá)所攜帶的遺傳信息 核酸簡(jiǎn)介基因組DNA提取質(zhì)粒DNA提取真核細(xì)胞總RNA提取 基因組DNA提取的幾種常用方法 CTAB法SDS法其他方法 基因組DNA提取 CTAB法 CTAB法原理 植物DNA提取經(jīng)典方法 CTAB hexadecyltrimethylammoniumbromide 十六烷基三甲基溴化銨 是一種陽離子去污劑 可溶解細(xì)胞膜 并與核酸形成復(fù)合物 該復(fù)合物在高鹽溶液中 0 7mol LNaCl 是可溶的 通過有機(jī)溶劑抽提 去除蛋白 多糖 酚類等雜質(zhì)后加入乙醇沉淀即可使核酸分離出來 基因組DNA提取 CTAB法 CTAB提取緩沖液的經(jīng)典配方 Tris HCl pH8 0 提供一個(gè)緩沖環(huán)境 防止核酸被破壞 EDTA螯合Mg2 或Mn2 離子 抑制DNase活性 NaCl提供一個(gè)高鹽環(huán)境 使DNP充分溶解 存在于液中 CTAB溶解細(xì)胞膜 并結(jié)合核酸 使核酸便于分離 巰基乙醇是抗氧化劑 有效地防止酚氧化成醌 避免褐變 使酚容易去除 基因組DNA提取 CTAB法 CTAB提取緩沖液的改進(jìn)配方 PVP 聚乙烯吡咯烷酮 是酚的絡(luò)合物 能與多酚形成一種不溶的絡(luò)合物質(zhì) 有效去除多酚 減少DNA中酚的污染 同時(shí)它也能和多糖結(jié)合 有效去除多糖 基因組DNA提取 CTAB法 CTAB法實(shí)驗(yàn)流程 基因組DNA提取 SDS法 SDS法原理SDS是一種陰離子去垢劑 在高溫 55 65 條件下能裂解細(xì)胞 使染色體離析 蛋白變性 釋放出核酸 提高鹽 KAc或NH4Ac 濃度并降低溫度 冰浴 使蛋白質(zhì)及多糖雜質(zhì)沉淀 離心后除去沉淀 上清液中的DNA用酚 氯仿抽提 反復(fù)抽提后用乙醇沉淀水相中的DNA SDS法適用于大部分實(shí)驗(yàn)材料基因組DNA提取 如動(dòng)物組織 細(xì)胞 全血 細(xì)菌 酵母等 基因組DNA的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè) 瓊脂糖凝膠電泳 以瓊脂糖凝膠作為支持物 利用DNA分子在泳動(dòng)時(shí)的電荷效應(yīng)和分子篩效應(yīng) 達(dá)到分離混合物的目的 小鼠gDNA電泳圖 基因組DNA提取常見問題 DNA樣品不純 抑制后續(xù)酶解和PCR反應(yīng)DNA降解DNA量少 基因組DNA提取常見問題分析 DNA樣品不純 抑制后續(xù)酶解和PCR反應(yīng)DNA中含有蛋白 多糖 多酚類物質(zhì) 抽提純化 高鹽洗滌DNA在溶解前 有酒精殘留 酒精抑制后續(xù)酶解反應(yīng) 重新沉淀DNA中殘留有金屬離子 重新70 乙醇漂洗 基因組DNA提取常見問題分析 DNA降解材料不新鮮或反復(fù)凍融未很好抑制內(nèi)源核酸酶的活性提取過程操作過于劇烈 DNA被機(jī)械打斷外源核酸酶污染 基因組DNA提取常見問題分析 DNA提取量少實(shí)驗(yàn)材料不佳或量少 選取新鮮 幼嫩 材料破壁或裂解不充分 充分研磨 破壁酶 延長(zhǎng)裂解時(shí)間沉淀不完全 低溫 延長(zhǎng)沉淀時(shí)間洗滌使得丟失DNA 核酸簡(jiǎn)介基因組DNA提取質(zhì)粒DNA提取真核細(xì)胞總RNA提取瓊脂糖凝膠電泳 質(zhì)粒DNA提取 質(zhì)粒DNA提取的方法 堿裂解法煮沸法 質(zhì)粒DNA提取 堿裂解法原理 離心柱型質(zhì)粒DNA提取試劑盒工作原理 離心柱型質(zhì)粒DNA提取試劑盒采用改進(jìn)的SDS 堿裂解法裂解細(xì)胞 離心吸附柱內(nèi)的硅基質(zhì)膜在高鹽 低pH值狀態(tài)下選擇性地結(jié)合溶液中的質(zhì)粒DNA 再通過漂洗液將雜質(zhì)和其它細(xì)菌成分去除 最后用低鹽 高pH值的洗脫緩沖液將純凈質(zhì)粒DNA從硅基質(zhì)膜上洗脫 質(zhì)粒DNA提取及檢測(cè) 實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備 1 實(shí)驗(yàn)器材臺(tái)式高速離心機(jī) 旋渦混合儀 移液器 定時(shí)器 marker筆 電子天平 電泳設(shè)備 凝膠成像系統(tǒng) 微波爐 量筒 試劑瓶 錐形瓶等 2 實(shí)驗(yàn)耗材無菌2mL 1 5mLEP管 各規(guī)格Tip 一次性手套等 3 實(shí)驗(yàn)試劑質(zhì)粒小提試劑盒 離心柱型 YRBIO LB培養(yǎng)基 抗生素 瓊脂糖 DNALoadingBuffer GoldView核酸染料 TAE電泳緩沖液等 4 實(shí)驗(yàn)材料對(duì)數(shù)期菌株 pEGFP N1inDH5 質(zhì)粒DNA提取 堿裂解法 堿裂解法試劑配方 質(zhì)粒DNA提取 實(shí)驗(yàn)流程 質(zhì)粒DNA提取 電泳檢測(cè) 瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè) 質(zhì)粒DNA的三種帶型 1 共價(jià)閉合環(huán)狀DNA分子 質(zhì)粒雙鏈沒有斷裂 超螺旋結(jié)構(gòu) 泳動(dòng)速度最快 2 半開環(huán)質(zhì)粒DNA分子 質(zhì)粒的一條鏈斷裂 松弛的環(huán)狀分子 泳動(dòng)速度最慢 3 線性DNA分子 質(zhì)粒的兩條鏈均斷裂 泳動(dòng)速度居中 質(zhì)粒DNA提取常見問題 RNA殘留質(zhì)粒斷裂量少 質(zhì)粒DNA提取常見問題分析 RNA殘留忘記加RNaseA I液中RNaseA失效 酶量不夠 質(zhì)粒斷裂II液裂解時(shí)間過長(zhǎng) 裂解時(shí)動(dòng)作過于劇烈 質(zhì)粒DNA提取常見問題分析 量少凝膠是否有問題 菌體量少菌體重懸不徹底裂解不完全菌株老化嚴(yán)謹(jǐn)型質(zhì)粒 質(zhì)粒類型 嚴(yán)謹(jǐn)型 這些質(zhì)粒的復(fù)制是在寄主細(xì)胞嚴(yán)格控制之下進(jìn)行的 與寄主細(xì)胞的復(fù)制偶聯(lián)同步 所以 往往在一個(gè)細(xì)胞中只有一份或幾份拷貝 松馳型 這些質(zhì)粒的復(fù)制是在寄主細(xì)胞的松弛控制之下進(jìn)行的 每個(gè)細(xì)胞中含有10 200份拷貝 如果用一定的藥物處理抑制寄主蛋白質(zhì)的合成才會(huì)使質(zhì)?？截悢?shù)增至幾千份 如較早的質(zhì)粒pBR322即屬于松弛型質(zhì)粒 要經(jīng)過氯霉素處理才能達(dá)到更高拷貝數(shù) 核酸簡(jiǎn)介基因組DNA提取質(zhì)粒DNA提取真核細(xì)胞總RNA提取瓊脂糖凝膠電泳 總RNA提取 通用方法 異硫氰酸胍 苯酚法 TRIzol法 原理 核酸在中性條件下 因磷酸基解離而帶負(fù)電荷 這一部分由于水化而溶于水 而在酸性條件下 磷酸基的負(fù)電荷消失 水溶性下降 因此 在酸性酚的處理下 DNA向疏水性的酚層移動(dòng) 而RNA由于有 OH的存在有親水性 因此向水層移動(dòng) TRIzol試劑 TRIzol試劑中的主要成分為異硫氰酸胍和苯酚 其中異硫氰酸胍可裂解細(xì)胞 促使核蛋白體的解離 使RNA與蛋白質(zhì)分離 并將RNA釋放到溶液中 當(dāng)加入氯仿時(shí) 它可抽提酸性的苯酚 而酸性苯酚可促使RNA進(jìn)入水相 離心后可形成水相層和有機(jī)層 這樣RNA與仍留在有機(jī)相中的蛋白質(zhì)和DNA便分離開 水相層主要為RNA 有機(jī)層主要為DNA和蛋白質(zhì) 總RNA提取 樣本準(zhǔn)備 植物 動(dòng)物組織樣本 新鮮取材或組織離體后液氮速凍 存于液氮或 80 為避免反復(fù)凍融 需小份分裝 50 100mg 份 細(xì)胞樣本 新鮮收集待用或加入TRIzol后 80 凍存細(xì)胞沉淀 血液樣本 新鮮血液分離出淋巴細(xì)胞 待用或加入TRIzol后 80 凍存細(xì)胞沉淀 真核細(xì)胞總RNA提取 實(shí)驗(yàn)步驟 收集細(xì)胞 離心洗滌 裂解變性 異丙醇沉淀 抽提 RNA溶液 干燥溶解 293細(xì)胞樣品為例 上層溶液 RNA提取常見問題 RNA降解DNA殘留OD260 OD280比值偏低電泳帶型異常 RNA降解外源RNase的污染裂解液質(zhì)量裂解液用量不足樣品本身富含RNase環(huán)境溫度過高 RNA提取常見問題分析 DNA殘留樣本量過多吸取到中間層及下層試劑解決辦法 DNA酶 RNasefree 消化 再抽提純化處理 OD260 OD280比值偏低蛋白污染 苯酚殘留 加入氯仿后徹底混勻 并且離心分層的離心力和時(shí)間要足夠 不要吸入中間層及有機(jī)相 寧愿多損失些上清 減少起始樣品量 確保裂解完全 徹底 解決辦法 重新抽提一次 再沉淀 溶解 RNA提取常見問題分析 電泳帶型異常上樣量超過3 g電壓超過8V cm電泳緩沖液陳舊均可能導(dǎo)致28S和18S條帶分不開 核酸簡(jiǎn)介基因組DNA提取質(zhì)粒DNA提取真核細(xì)胞總RNA提取瓊脂糖凝膠電泳 DNA的瓊脂糖凝膠電泳 1原理 DNA分子在高于其等電點(diǎn)的pH溶液中帶負(fù)電荷 在電場(chǎng)中向正極移動(dòng) 而瓊脂糖凝膠具有分子篩作用 不同分子量或分子形狀的核酸 其移動(dòng)速度有差異 因此 利用這種 電荷 和 分子篩 的雙重效應(yīng) 達(dá)到分離核酸的目的 DNA的瓊脂糖凝膠電泳 2 瓊脂糖凝膠分離DNA的范圍 DNA的瓊脂糖凝膠電泳 3 DNA染料A EB溴化乙錠 EthidiumBromide EB 可以嵌入核酸雙鏈的堿基對(duì)之間 在紫外線激發(fā)下 發(fā)出紅色熒光 EB染料優(yōu)點(diǎn) 染色操作簡(jiǎn)便 快速 室溫下15 20min 不會(huì)使核酸斷裂 靈敏度高 10ng或更少的DNA即可檢出 可以直接加到樣品中或膠中 價(jià)格低廉 EB是誘變劑 使用時(shí)一定要戴手套 EB廢液要經(jīng)過處理才能丟棄 肉眼觀察EB染色的DNA B 新型低毒染料 如GoldView SYBRGreen SYBRGold等 毒性較低 但價(jià)格較昂貴 靈敏度較好 但不如EB DNA的瓊脂糖凝膠電泳 4 瓊脂糖膠液制備 1 50ml 4 1稱取0 5g瓊脂糖 置于250ml錐形瓶中 加入60ml1 TAE電泳緩沖液 微波爐中加熱 使瓊脂糖溶解 一般需反復(fù)煮沸3次 瓊脂糖才能充分溶解 加熱過程中要不時(shí)搖動(dòng) 使附于瓶壁上的瓊脂糖顆粒進(jìn)入溶液 加熱時(shí)應(yīng)蓋上封口膜 以減少水分蒸發(fā) 4 2待膠液冷卻至60 左右時(shí) 加入5 的GoldView染料 混勻 既成瓊脂糖膠液 DNA的瓊脂糖凝膠電泳 7