研究生基因工程實驗指導.doc

廣東省高教廳重點實驗室現(xiàn)代生物技術實驗室實驗教材基因工程技術實驗指導(研究生教材)華南農(nóng)業(yè)大學現(xiàn)代生物技術實驗室基因工程實驗分室二零零五年二月編 者 的 話 本實驗指導是為廣東省高教廳重點實驗室之一的“現(xiàn)代生物技術實驗室”開設的“基因工程原理和方法”而編寫的。本課程主要面向廣州石牌地區(qū)六所高校的研究生，也包括部分高年級本科生。該課程以實驗為主，為保證學生在修讀本課程時有較好的理論基礎，要求所有修課學生預修“分子生物學”或“分子遺傳學”。 本課程實驗采用了一個內(nèi)容連貫的實驗系統(tǒng)(用質(zhì)粒載體克隆植物DNA片段)，作為同學們掌握DNA體外重組基本技術的訓練(實驗一至實驗七)。另外，根據(jù)本研究室多年教學、研究工作的經(jīng)驗，我們還把反映近年基因工程技術發(fā)展的PCR、Southern雜交技術等納入實驗內(nèi)容，以保證學生修完本課程后能較快地開展相應研究工作，更好地適應未來研究工作的需要。 本實驗指導由莊楚雄、穆虹、易繼財、姚涓、吳豪、張群宇、劉耀光、梅曼彤等老師參加編寫，易繼財老師負責指導書的編輯等工作。 本實驗指導為試用第三版，試用后我們將根據(jù)各校修課的情況和要求作進一步修改，敬請兄弟院校的同行多提寶貴意見。 編 者 2005年2月目 錄基因工程實驗室學生守則 3實驗一 堿裂解法抽提質(zhì)粒DNA 4實驗二 瓊脂糖凝膠電泳 7實驗三 DNA的酶切 9實驗四 目的片段的回收 11實驗五 DNA的體外連接 12實驗六 重組DNA的轉(zhuǎn)化 15實驗七 重組轉(zhuǎn)化子的快速鑒定 18實驗八 多聚酶鏈式反應( PCR ) 19實驗九 植物DNA的抽提 21實驗十 基因組DNA的Southern雜交分析 24附錄I. 各種試劑的母液配方 28附錄II. 常用實驗器具的清洗方法 31主要參考書 32基因工程實驗室學生守則 1. 實驗課前必須預習實驗指導，了解實驗原理和基本操作過程。 2. 實驗課不得無故缺席、遲到或早退。非課表規(guī)定的實驗時間，應按任課老師的安排，準時來進行操作。 3. 實驗課時，應自覺遵守課堂紀律，保持實驗室的安靜與清潔衛(wèi)生，不得大聲談笑，不得抽煙、隨地亂丟紙屑、吐痰等。 4. 實驗前清點好儀器、用具與試劑，實驗臺面應隨時保持整潔，儀器、藥品擺放整齊。公用試劑用畢，應立即蓋嚴放回原處。勿使試劑、藥品灑在實驗臺面和地面上。 5. 實驗中應嚴格遵守操作規(guī)程進行實驗，細心觀察實驗現(xiàn)象，并如實記錄實驗結(jié)果。每個實驗完成后，要寫實驗報告。 6. 實驗完畢，應清洗好當天所用的器皿和用具，整理好儀器與實驗臺面，經(jīng)任課教師同意方可離開。 7. 使用儀器、藥品、試劑和各種其它物品需注意節(jié)約。洗滌和使用儀器時，應小心仔細，防止損壞儀器。 8. 廢液可倒入水槽內(nèi)，同時放水沖走，強酸、強堿等腐蝕性液體，應先用水稀釋后，方可倒入水槽內(nèi)，并放水沖走。廢紙等其它固體廢物，不得倒入水槽，應倒入廢物桶內(nèi)。 9. 嚴禁隨意動用非當天實驗所需使用的儀器和物品，使用儀器應嚴格按儀器使用的程序進行，貴重儀器需在任課老師的指導下進行操作。實驗過程中如儀器出現(xiàn)故障，應及時向任課老師匯報情況，如違反使用規(guī)定造成的損壞，使用者將負責修理與賠償。 10. 每次實驗課由任課教師安排學生輪流值日，值日生負責當天實驗室的衛(wèi)生、安全和一切服務性的工作，最后關好水電、門窗，經(jīng)任課教師檢查同意后方可離開。實驗一 堿裂解法抽提質(zhì)粒DNA一、目的 學習并掌握基因工程操作技術中最常用的載體質(zhì)粒DNA的提取方法。二、原理 質(zhì)粒DNA的提取常用堿裂解法、煮沸法、SDS法、Triton-溶菌酶法等，其中以堿裂解法最為常用。本方法有質(zhì)粒DNA產(chǎn)量高、快速等優(yōu)點。其原理為: 在堿性溶液中，雙鏈DNA氫鍵斷裂，DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)遭破壞而發(fā)生變性，但由于質(zhì)粒DNA分子量相對較小，且呈環(huán)狀超螺旋結(jié)構(gòu)，即使在高堿性pH條件下，兩條互補鏈也不會充分分離，當加入中和緩沖液調(diào)時，變性質(zhì)粒DNA又恢復到原來的構(gòu)型；而線性的大分子量細菌染色體DNA則不能復性，與細胞碎片、蛋白質(zhì)、SDS等形成不溶性復合物。通過離心沉淀，細胞碎片、染色體DNA及大部分蛋白質(zhì)等可被除去，而質(zhì)粒DNA及小分子量的RNA則留在上清液中?；祀s的RNA可用RNA酶(RNaseA)消除。再用酚/氯仿處理，可去除殘留蛋白質(zhì)。三、實驗材料 含質(zhì)粒pBluescript II的大腸桿菌DH10B。四、儀器設備 高壓滅菌鍋 超凈工作臺 恒溫搖床 臺式離心機（冷凍式或非冷凍式） 旋渦振蕩器五、實驗用具 培養(yǎng)用試管 量筒 冰盒 微量離心管 微量取液器 吸管頭若干六、試劑(配制方法見附錄) LB培養(yǎng)基 氨芐青霉素(Amp, 100 mg/ml) 20% SDS 溶液I； 溶液II(最好現(xiàn)配現(xiàn)用)； 溶液III(-20預冷) 4 N NaOH 3 M NaAc(pH5.2) 無水乙醇 TE緩沖液(pH 8.0) RNase A(10 mg/ml) 70%乙醇 飽和酚/氯仿/異戊醇(25:24:1，注：在本實驗指導的其它章節(jié)省略為“酚/氯仿”，而“氯仿”均指已加入了1/24體積的異戊醇)七、實驗步驟1. 細菌的培養(yǎng)(1) 配制LB液體和瓊脂培養(yǎng)基，并高壓滅菌。(2) 在含Amp 100 mg/ml的瓊脂培養(yǎng)基平板上(劃線或涂抹)培養(yǎng)出單菌落(37，1820小時)。(3) 在培養(yǎng)管中加入含Amp 100 mg/ml的LB液體培養(yǎng)基(45 ml/管)，挑取單菌落至培養(yǎng)基中。將培養(yǎng)管傾斜插在搖床中，37搖過夜(約200 rpm，1416小時，一般不超過18小時)。如需大量提取，挑取單菌落至接入含50 ml LB培養(yǎng)基的三角瓶中，37搖18小時。2. 質(zhì)粒DNA的抽提（如使用冷凍離心機，設為4預冷）吸取1.5 ml菌液至1.5 ml離心管中。 離心(5000 rpm, 2分鐘)，棄上清液。如想提取多一點DNA，再吸取1.5 ml菌液至同一離心管中，離心，棄上清液。用移液器盡可能除去上清液。加入150 ml溶液I ，用旋渦振蕩器充分懸浮菌體。加入250 ml溶液II ，緩慢地上下翻轉(zhuǎn)離心管10多下，溫和混勻。室溫下放置5分鐘。加入180 ml預冷的溶液III ，上下翻轉(zhuǎn)離心管10多下，溫和混勻，冰浴10分鐘，或放入20冰箱5分鐘（避免過長時間產(chǎn)生凍結(jié)）。離心 (12000 rpm，5分鐘，4)。（離心完后把離心機溫度設為20）。移取上清液。加2/3倍體積的酚/氯仿抽提，離心 (12000 rpm，5分鐘)。 移取上清液（約500550ml），加2倍體積無水乙醇（大量提取時上清液的容量大，可用0.6倍體積異丙醇代替乙醇），混勻。離心（12000 rpm，5分鐘，室溫)，倒掉酒精。離心幾秒鐘，用移液器盡可能除去酒精。用0.5 ml 70酒精洗DNA沉淀一次，離心2分鐘，倒掉酒精。離心幾秒鐘，用移液器盡可能除去酒精，風干10分鐘。加50100 ml TE(含20 mg/ml RNaseA)溶解DNA沉淀。37放置數(shù)小時，-20保存?zhèn)溆?。高拷貝質(zhì)粒DNA的產(chǎn)量一般為35 mg/ml菌液。此DNA可直接用于限制性內(nèi)切酶切割等反應。如需要更高純度的DNA，可進一步純化。3. 質(zhì)粒DNA的進一步純化加入TE使DNA溶液為100 ml，加入100 ml酚/氯仿，充分振蕩。離心(12000 rpm, 5分鐘)，吸取上清液。加入1/10體積的3 M NaAc，加2倍體積的預冷無水乙醇，混勻。置于-70oC冰箱約10分鐘以上或-20oC冰箱30分鐘至數(shù)小時。離心（12000 rpm，15分鐘，4oC)，倒掉酒精，離心幾秒鐘，用移液器盡可能除去酒精。用0.5 ml 70酒精洗DNA沉淀一次，離心2分鐘，倒掉酒精。離心幾秒鐘，用移液器盡可能除去酒精，風干。加50100 ml TE溶解DNA沉淀。(如大量提取質(zhì)粒DNA，溶液I，II，III的用量可相應增加，如培養(yǎng)液為50 ml時，溶液I，II，III的用量可分別為2 ml，4.0 ml，3 ml）。 本實驗方法提取及純化的質(zhì)粒DNA的純度只能滿足一般目的的要求。對于純度要求很高的情況，如作為克隆載體和測序的模板，最好使用廠商提供的質(zhì)粒純化試劑盒提取。八、實驗注意事項1. 高壓消毒需專人看管，壓力至0.5磅時拔下電源插頭放氣，繼續(xù)加熱至1.0磅保持20分鐘(通、斷開關控制)。2. 無菌操作臺使用前，開紫外燈滅菌，開紫外燈時勿開鼓風裝置。3. 對抗菌素不能用高溫滅菌，需待培養(yǎng)基滅菌后冷卻到不燙手的時候再加入。4. 為避免細菌污染環(huán)境，多余的菌液經(jīng)煮沸殺滅后方可倒入洗滌槽。5. 加入溶液II、溶液III搖勻時一定要溫和，不能劇烈搖動。6. 在酚/氯仿萃取后，吸取上清液時，應注意勿將下層酚/氯仿吸入以免帶入雜質(zhì)；但也不要留下太多上清液，使DNA損失較多。九、實驗時間安排1. 第一天下午配制液體和瓊脂培養(yǎng)基。（5:30）左右在瓊脂培養(yǎng)基平板上劃線接菌，培養(yǎng)過夜長出單菌落。2. 第二天下午（5:30）挑取單菌落植菌培養(yǎng)過夜。3. 上午9:00左右停止培養(yǎng)，于室溫或4存放。下午抽提質(zhì)粒（純化在實驗二電泳期間進行）。實驗二 瓊脂糖凝膠電泳一、目的 學習瓊脂糖凝膠電泳分離DNA的原理和方法，檢測質(zhì)粒DNA的純度、濃度與分子量。二、原理 瓊脂糖是一種天然聚合長鏈狀分子，沸水中溶解，45開始形成多孔性剛性濾孔，凝膠孔徑的大小決定于瓊脂糖的濃度。DNA分子在堿性環(huán)境中帶負電荷，在外加電場作用下向正極泳動。DNA分子在瓊脂糖凝膠中泳動時，有電荷效應與分子篩效應。不同DNA，其分子量大小及構(gòu)型不同，電泳時的泳動率就不同，從而分出不同的區(qū)帶。瓊脂糖凝膠電泳法分離DNA，主要是利用分子篩效應，遷移速度與分子量的對數(shù)值成反比關系。溴化乙錠(EB)為扁平狀分子，在紫外光照射下發(fā)射熒光。EB可與DNA分子形成EB-DNA復合物，其發(fā)射的熒光強度較游離狀態(tài)EB發(fā)射的熒光強度大10倍以上，且熒光強度與DNA的含量成正比。用肉眼觀察，可檢測到5 ng以上的DNA。 質(zhì)粒DNA有環(huán)狀超螺旋、開環(huán)、和線性三種構(gòu)型，電泳時其遷移率各不同(超螺旋 線性 開環(huán))。三、實驗材料 上次實驗提取的質(zhì)粒DNA。四、實驗設備 微波爐 電泳儀 微型電泳槽 紫外透射檢測儀 五、實驗用具 微量取液器 吸管頭若干 加樣板 量筒100 ml1 三角瓶500 ml1 透明膠帶六、試劑(配制方法見附錄) 瓊脂糖 10TBE電泳緩沖液 10載樣緩沖液 EB母液（0.5 mg/ml）DNA(Hind)七、實驗步驟 1. 制膠 (1) 稱取0.8 g瓊脂糖加入盛有100 ml 1TBE電泳緩沖液的500 ml三角瓶中，搖勻，用電子天平稱三角瓶的總重量。在微波爐或電爐上加熱至瓊脂糖完全熔解，放在天平上加蒸餾水至原重量。冷卻到約60后，加入100 ml的0.5 mg/ml溴化乙錠（EB，終濃度為0.5 mg/ml）或者5 ml的Gold View溶液，并搖勻。 (2) 用膠帶將制膠板兩端封好，將溶解的瓊脂糖(約50)倒入其中，直至厚度為46 mm。 (3) 插入適當?shù)氖嶙?，在室溫下冷卻凝固。 (4) 充分凝固后撕掉兩端的膠布，小心垂直向上拔出梳子，以保證點樣孔完好。 (5) 將凝膠置入電泳槽中，加電泳緩沖液至液面覆蓋凝膠12 mm。 2. 點樣 用微量取液器(P20) 吸取實驗一的DNA樣品2 ml于點樣板小孔中，再加入8 ml TE或電泳緩沖液及1 ml的載樣緩沖液，混勻后，小心加入點樣孔，藍色樣品混合物將沉入點樣孔下部。同時點10mlDNA(Hind酶切,30 ng/ml)作為分子量標準。 4. 電泳 打開電源開關，調(diào)節(jié)電壓至35 V/cm，可見到溴酚藍條帶由負極向正極移動，約一小時后即可觀察。 5. 觀察 將電泳好的凝膠置于紫外透射檢測儀上，戴上防護觀察罩，打開紫外燈，可見到橙紅色核酸條帶，根據(jù)條帶粗細和熒光強度，可粗略估計該樣品DNA的濃度。同時根據(jù)已知分子量的標準DNA，通過線性DNA條帶的相對位置初步估計樣品的分子量。八、注意事項 1. 用微波爐煮膠時，膠液的量不應超過三角瓶容量的1/3，否則易溢出。 2. 煮好的膠應冷卻至50左右時再倒，以免制膠板變形，并減少漏膠的機會。 3. 倒膠注意厚度(46 mm)，充分凝固后再拔出梳子，以保持齒孔形狀完好。也可待膠稍凝固后，放入4冰箱10多分鐘，以加速膠的凝固。 4. 加樣前趕走點樣孔中的氣泡，點樣時吸管頭垂直，切勿碰壞凝膠孔壁，以免使帶型不整齊。 5. 一般情況下不必每點一個樣品都換槍頭，吸電泳緩沖液洗幾次即可再點下一個樣品。 6. 凝膠中含有EB，切勿直接用手接觸膠，廢棄膠應集中處理，勿亂丟。九、時間安排一個下午完成。在電泳進行期間，按實驗一進行質(zhì)粒DNA的純化。實驗三 DNA的濃度測定及酶切一、目的 學習利用紫外分光光度法測定DNA溶液濃度及利用限制性內(nèi)切酶切割DNA的方法，并通過電泳檢測酶切的效果，為以后的連接作準備。二、原理 DNA的吸收光譜峰在260 nm處，據(jù)計算，測定此波長下DNA溶液的OD值， 當OD260= 1時，雙鏈DNA含量約為50 mg/ml，據(jù)此可用紫外分光光度計測定溶液中DNA含量。由于蛋白質(zhì)的吸收峰在280 nm處，在測定DNA含量時，還常計算OD260/OD280之值，如該值為1.82.0時，認為已達到較高的純度，如低于此值，表明其內(nèi)含雜質(zhì)較多，可能影響酶切反應。 目前已發(fā)現(xiàn)三類不同的限制性內(nèi)切酶即I型、II型和III型。其中II型能專一識別堿基順序，并在該處切斷雙鏈DNA，因而在基因工程中得到廣泛應用。DNA經(jīng)限制性內(nèi)切酶作用產(chǎn)生兩種斷裂狀態(tài)：粘性末端或平末端。限制性內(nèi)切酶HindIII識別的堿基序列為：酶切作用后產(chǎn)生5突出的粘性末端 5-AAGCTT-3 A 5-AGCTT 3-TTCGAA-5 TTCGA-5 A 酶切反應需Mg2+及其它一些輔助離子和一定的鹽離子濃度，不同內(nèi)切酶對鹽離子有不同的要求，如鹽離子濃度使用不當或甘油含量過高(5%)，會使酶的識別位點發(fā)生改變，產(chǎn)生星活性(star activity)。絕大多數(shù)酶的反應溫度37，也有個別要求在50 65。三、實驗材料 提純的質(zhì)粒DNA和水稻基因組DNA。四、儀器設備 分光光度檢測儀 電泳儀 微型電泳槽 紫外透射檢測儀 恒溫培養(yǎng)箱 五、實驗用具 微量取液器 微量離心管(0.5 ml1) 吸管頭若干 點樣板六、試劑 限制性內(nèi)切酶HindIII及對應的緩沖液(試劑商提供) 無菌雙蒸水 10TBE電泳緩沖液 0.8%瓊脂糖 載樣緩沖液七、實驗步驟 1. DNA濃度純度的測定 取實驗一的DNA 2 ml (約100 200 ng)至一干凈的離心管，加入198 ml蒸餾水稀釋。先加200 ml 蒸餾水至比色杯，進行紫外光空白測定，然后倒掉蒸餾水，加入200 ml已稀釋的DNA溶液，測定260 nm及280 nm的光吸收值(OD260及OD280)，計算DNA濃度及OD260/OD280比值。 2. 酶切：按下表配制酶解混合液DNA緩沖液(1/10 V) 10 mlDNA45 mg加雙蒸水至總體積(V)100 ml酶(HindIII)40 U 混勻，37保溫1.5 3小時，電泳前在4保存。 3. 電泳檢測：取酶解液310 ml電泳 (具體步驟見實驗二)。 4. 觀察結(jié)果。八、注意事項 1. 用紫外分光光度法測DNA含量時，對純度不高的DNA測定結(jié)果往往不準確(偏高)，且測定所用DNA量較多。用瓊脂糖凝膠法電泳(與已知濃度的DNA標準系列對照)定量更為可靠。 2. 酶切的DNA應具備一定的純度，其中不能含跡量的酚、氯仿、SDS等。 3. 反應總體積中甘油的濃度要小于5，即內(nèi)切酶的體積應小于10%反應總體積(購來的酶含50甘油)。 4. 內(nèi)切酶從-20冰箱取出后，應放入冰浴中，在其它試劑加完后最后加。 5. 每次取酶必須使用新的滅菌吸管頭，1個吸管頭不能反復使用，更不能交叉使用。 6. 注意混勻，可用用手指輕彈管壁，使酶切體系所有成分混勻，然后短暫離心，使管壁液滴沉入管底。九、時間安排DNA濃度純度測定、酶切，一個下午；電泳檢測一個下午。實驗四 目的片段的回收一、目的 DNA分子經(jīng)限制性內(nèi)切酶消化以后，產(chǎn)生較小的片段，我們須從中選出我們需要的片段（目的片段），進一步作亞克隆，或用作探針。通過本實驗，我們將學習掌握從瓊脂糖凝膠電泳中回收DNA片段的一種方法。二、原理 回收目的片段的方法有多種，常用的有凍融法、低熔點瓊脂糖法、透析袋法、電泳回收法、玻璃孔回收法等。本實驗采用電泳回收法。通過特別的V形電泳槽，將挖出的含有目的片段的凝膠置于V形槽前，接通電泳電源，DNA即進入V形管中，回收V形管中溶液即可，V形管較小，回收的DNA片段能保持較高的濃度。三、實驗材料 實驗三酶切的水稻基因組DNA。四、儀器設備 電泳儀 電泳槽 V形管回收電泳槽 紫外透射檢測儀 五、實驗用具 微量取液器 吸管頭若干 刀片 微量離心管 扁頭鑷子六、試劑 0.8%瓊脂糖 10TBE電泳緩沖液 7 M醋酸銨 載樣緩沖液七、實驗步驟 1. 大量酶切產(chǎn)物的電泳分離。 瓊脂糖為0.8，選用大型電泳槽及厚梳子，并在低電壓下電泳以提高分辨率。 2. 紫外燈下用刀片小心切出含1000bpDNA片段的凝膠。 3. 把凝膠片置于特制的“V”型槽平臺上，在“V”型槽中加入0.5TBE電泳緩沖液(使其剛好淹過膠面)，再在“V”型孔中加入7 M NH4Ac，接通電源進行電泳。 4. 紫外燈下檢測凝膠塊是否含有DNA，判斷DNA是否全部進入V形管溶液中。 5. 當DNA進入V形管中，放掉電泳槽中的緩沖液，吸出V形管中的溶液。 6. 溶液加兩倍體積的無水酒精，混勻，置-70oC兩小時或-20oC過夜。 7. 12000 rpm離心10分鐘，沉淀用70酒精洗一次，風干，加入10 ml TE。取1 ml與8 ml TE及1ml載樣緩沖液混合，電泳檢查并根據(jù)帶的亮度估算其濃度。八、注意事項 挖含目的DNA的凝膠時，盡量減少周圍凝膠的帶入。九、時間安排 一個下午。實驗五 DNA的體外連接一、目的 學習DNA重組技術中的核心步驟，DNA片段之間的體外連接方法，將實驗四回收的目的片段與載體質(zhì)粒片段進行定向連接。二、原理 DNA連接酶催化兩個雙鏈DNA片段5端磷酸和3端羥基之間形成磷酸二酯鍵。DNA連接酶主要有：T4噬菌體DNA連接酶和大腸桿菌連接酶兩種。T4 DNA連接酶的底物可為：(1) 一條鏈帶有缺口的雙鏈DNA分子；(2) 兩個存在互補粘性末端的雙鏈DNA片段；(3) 兩個存在平末端的DNA片段；(4) RNADNA雜合體中，具缺口的RNA和DNA分子。大腸桿菌DNA連接酶適當?shù)牡孜镏皇菐笨诘碾p鏈DNA分子和具有同源互補粘性末端的不同DNA片段，它不能催化平末端DNA分子之間的連接。 T4 DNA連接酶催化DNA連接的反應分三步進行：(1) 輔助因子ATP中磷酸基團與T4 DNA連接酶上的Leu殘基的NH2結(jié)合，形成酶-AMP復合物；(2) 酶-AMP復合物活化DNA鏈5端的磷酸基團，形成磷酸磷酸酯鍵；(3) DNA鏈3端的羥基活化與5端磷酸根形成磷酸二酯鍵，釋放AMP，完成DNA鏈間的連接。大腸桿菌DNA連接酶催化DNA分子連接的機制及反應過程大致與T4 DNA連接酶相同，只是輔助因子為NAD+。用于克隆的質(zhì)粒載體在酶切成線狀后，一般需用堿性磷酸酯酶(CIP或BAP)進行去磷酸化處理，以防止載體自身環(huán)化，減少不含重組子的菌落產(chǎn)生。三、實驗材料 實驗四所得的DNA片段，以及用質(zhì)粒純化試劑盒提取的高純度載體質(zhì)粒pBluescript II(由教師提取)。四、儀器設備 恒溫水浴鍋 低溫恒溫水浴鍋 電泳儀 電泳槽 紫外透射檢測儀 五、實驗用具 微量取液器 吸管頭若干 微量離心管(1.5 ml，已滅菌)六、試劑 HindIII及10反應緩沖液 無菌雙蒸水 堿性磷酸酯酶(CIP) 1 M Tris-HCl (pH9.0) T4 DNA連接酶及10緩沖液(含ATP) 酚:氯仿七、實驗步驟 1. 載體的酶切和去磷酸化處理(1) 在離心管中加入5 mg pKS質(zhì)粒 DNA，10 ml 10 HindIII緩沖液，加雙蒸水至98 ml，最后加入20 U HindIII酶。充分混勻，離心30秒，在37恒溫水浴鍋保溫30分鐘。(2) 加入5 ml 1M Tris-HCl (pH9.0)，2 U CIP，充分混勻，離心30秒，在37恒溫水浴鍋保溫，60分鐘。(加pH9.0的Tris-HCl緩沖液，目的是將pH7.5 8.0的酶切緩沖液的pH值調(diào)到適合CIP的pH8.5左右)。(3) 溫育結(jié)束時，加EDTA (pH 8.0)至終濃度為5 mM，混勻，于65加熱60分鐘(或于7510分鐘)。然后用酚/氯仿抽提兩次；上清液加0.1體積3 M醋酸鈉，充分混勻，再加2.5倍體積的無水乙醇，充分混勻后于-20放置15分鐘。12000 rpm離心15分鐘，沉淀用冷70酒精洗一次，風干后用40 ml TE溶解(DNA濃度約為80100 ng/ml)。 2. 連接 在微量離心管中加入 載體DNA 1 ml (80100ng) 目的片段DNA 50-100 ng ddH2O 加至8ml混勻，45 50，5分鐘(使粘性末端分開）加入10T4 DNA連接酶緩沖液1 ml用1連接酶緩沖液將連接酶稀釋成0.2 Weiss單位或12 NEB單位/ml再加入已稀釋的T4 DNA連接酶1 ml混勻，稍離心，在PCR儀上進行連接反應65，5min，置于4oC保存?zhèn)溆冒?、注意事?. 克隆用的載體質(zhì)粒要求較高純度，使之能用最少的酶和較短的反應時間達到完全的切斷。使用過量的內(nèi)切酶或CIP以及過長時間的反應會使載體末端缺失，產(chǎn)生大量的假陽性菌落(白色但沒有插入子)。2. 使用T4 DNA連接酶之前，應看清楚生產(chǎn)廠家所使用的活性定義單位，以便采用合適的酶濃度反應條件，不致造成不必要的浪費。3. 目的DNA片段與載體DNA之間的摩爾濃度比例一般是3:11:1，并且使反應體系中DNA的總末端濃度適于DNA分子之間連接，但又不易形成多分子連接的寡聚物，造成片段多拷貝插入。九、時間安排 二個下午。實驗六 重組DNA的轉(zhuǎn)化一、目的 學習將體外重組DNA(實驗五的連接產(chǎn)物)引入受體細胞，使受體菌具有新的遺傳特性，并從中篩選出轉(zhuǎn)化子的常用方法。二、原理 把外源DNA分子導入到某一宿主細菌細胞的過程稱為轉(zhuǎn)化(transformation)。當細菌處于容易吸收外源DNA的狀態(tài)即感受態(tài)時，轉(zhuǎn)化最易發(fā)生。常用的轉(zhuǎn)化方法是用CaCl2處理受體菌，使細菌細胞進入敏感的感受態(tài)。當細菌處于冰凍(0)的CaCl2溶液中，細菌細胞膨脹成球形，轉(zhuǎn)化混合物中的DNA形成抗DNase的羧基鈣磷酸復合物粘附于細胞表面，經(jīng)42短時間熱沖擊處理，促進細胞吸收外源DNA。在豐富培養(yǎng)基上生長數(shù)小時后，球狀細胞復原并分裂增殖，被轉(zhuǎn)化的細菌中，載體中抗抗生素基因得到表達，在選擇性培養(yǎng)基平板上，可選出所需的轉(zhuǎn)化子。 本實驗所用重組DNA的載體帶有E.coli中的b-半乳糖苷酶基因 (LacZ)的調(diào)控序列和部分編碼序列，編碼區(qū)內(nèi)插入了一個多克隆位點，進入宿主菌后可與宿主細胞之間實現(xiàn)a-互補而產(chǎn)生Lac+，在生色底物X-gal存在下形成蘭色菌落。如有外源DNA插入到質(zhì)粒的該位點，則破壞了互補能力，菌落呈白色。三、實驗材料 實驗五的連接產(chǎn)物(重組DNA)、受體菌(E.coli，DH5a)。四、儀器設備 高壓滅菌鍋 超凈工作臺 冷凍高速離心機 恒溫水浴鍋 冰箱 恒溫搖床 恒溫培養(yǎng)箱五、實驗用具 離心管50 ml1 電爐 試管1 微量取液器 微量離心管 培養(yǎng)皿 冰浴保溫瓶 錐形瓶150 ml1 燒杯六、試劑 LB培養(yǎng)基 無菌雙蒸水 氨芐青霉素(Amp) 0.1 mol/L CaCl2 SOC培養(yǎng)基 X-gal IPTG七、實驗步驟 1 . 感受態(tài)細胞的制備挑取E.coli DH5a受體菌單菌落(23 mm)于有50 ml LB培養(yǎng)基的500-ml錐形瓶中。37振蕩(250rpm)培養(yǎng)約2.5小時(活細胞數(shù)不超過108個/ml)。（以下步驟均在超凈工作臺操作）超凈工作臺上，倒入經(jīng)消毒的50 ml離心管中，蓋嚴。在1L燒杯冰浴中放置10分鐘，使菌液冷卻至0。4，4000 rpm離心10分鐘收集菌體。棄上清液，倒置在紙巾上1分鐘。加10 ml預冷的0.1 mol/L CaCl2 ，懸浮菌體。冰浴25分鐘。離心（4，4000 rpm，10分鐘）。加入1.5 ml 預冷的0.1 mol/L CaCl2，小心懸浮4冰箱保存過夜(1224小時)。 2 . 轉(zhuǎn)化 在1.5 ml離心管中加入感受態(tài)細胞ddH2O連接物載體質(zhì)粒重組質(zhì)?？瞻讓φ?00 ml2 ml000CK(陰性對照)200 ml001ml (10 ng)0CK(陽性對照)200 ml001 ml(10 ng)自我環(huán)化對照200 ml02 ml(不含插入子)00處 理200 ml02 ml00用吸管頭溫和混勻冰浴30分鐘42，靜置90秒冰浴23分鐘加入800 ml 37預熱的SOC液體培養(yǎng)基用1000-ml取液器移至培養(yǎng)管，37搖動（200rpm）45分鐘。各取100200 ml涂板，將培養(yǎng)皿置于室溫至液體被吸收。倒置培養(yǎng)皿，37培養(yǎng)過夜.觀察轉(zhuǎn)化結(jié)果(白色為陽性，藍色為陰性)八、注意事項1. 為了達到較高的轉(zhuǎn)化效率，LB和SOC液體培養(yǎng)基需用進口的胰蛋白胨(Tryptone)和酵母浸出粉（Yeast extract）。2. 轉(zhuǎn)化實驗使用的玻璃器皿、微量吸管、離心管管，應徹底洗凈并進行高壓消毒，表面去污劑、化學試劑的污染將大大降低轉(zhuǎn)化率。微量吸管應剪去尖端擴大口徑。3. 制備感受態(tài)細胞的培養(yǎng)時間最好以OD值來決定。對某種菌株在培養(yǎng)后不同時間取樣測定OD600值，比較不同OD值時細胞的轉(zhuǎn)化效率，以確定對該種菌株的最佳OD值，以后每次實驗就以確定的OD值為指標選用細胞培養(yǎng)時間。4. 轉(zhuǎn)化態(tài)細胞應盡量保持低溫，離心管應提前預冷。5. 受體菌細胞經(jīng)CaCl2處理后，細胞壁較脆，懸浮時小心操作。6. 制備好的感受態(tài)細胞可急凍保存?zhèn)溆茫涸?L燒杯中裝入100ml無水酒精，在-70 -80冰箱預冷。將感受態(tài)細胞分裝入離心管(0.2 ml/管)，置于-80酒精急凍，并保存在-70 -80冰箱。九、時間安排 實驗前一天下午下班前接種劃平板。 實驗當天上午下班(11:30)前搖菌。實驗當天下午約2:00開始制備感受態(tài)細胞，配培養(yǎng)基、滅菌、倒平板，第二天下午做轉(zhuǎn)化實驗。實驗七 重組轉(zhuǎn)化子的快速鑒定一、目的 掌握快速鑒定重組轉(zhuǎn)化子的方法。二、原理 雖然大部分質(zhì)粒載體都可通過藍白色選擇重組轉(zhuǎn)化子，但在實際應用中往往有相當部分的白色克隆是不含插入子的。本鑒定方法是用堿性裂解液把轉(zhuǎn)化子菌體裂解，然后直接用瓊脂糖凝膠分離，通過比較白色和蘭色轉(zhuǎn)化子質(zhì)粒的遷移率，鑒定出重組轉(zhuǎn)化子。三、實驗材料：實驗六得到的轉(zhuǎn)化子。四、儀器設備：電泳裝置。五、實驗用具：96孔平板，牙簽。六、試劑 含抗生素LB平板 10 mM EDTA (pH8.0) 1 M KCl 10 x載樣緩沖液 0.8%瓊脂糖凝膠 2堿性裂解液：母液配制50 ml所需的量最終濃度4 M NaOH2.5 ml0.2 M10% SDS2.5 ml0.5 %蔗 糖15 g30%七、 實驗步驟 1. 用牙簽從轉(zhuǎn)化選擇平板選取幾十個白色和幾個藍色菌落，殖在LB平板上，37過夜。 2. 在96孔平板每孔加入20 ml 10mM EDTA。 3. 用牙簽挑取少量菌體(不能太多)，懸浮于各孔中(其中12孔是藍色菌落作為對照)，將平板接觸旋渦器幾秒鐘。 4. 加入20 ml裂解液，將平板接觸旋渦器幾秒鐘，靜置5分鐘。 5. 將等量的1M KCl和載樣緩沖液混合，各孔中加入6 ml，將平板接觸旋渦器幾秒鐘。 6. 按藍色菌落，白色菌落.最后藍色菌落的順序，各取2030 ml點樣。 7. 電泳，觀察。與藍色菌落質(zhì)粒遷移率比較，可判別白色菌落的重組質(zhì)粒是否含有插入子。八、注意事項挑取菌落勿太少，也不能太多。此外，裂解后菌液較粘，點樣時吸管頭勿垂直拉出以免帶出點樣孔內(nèi)的菌液樣品。實驗八 多聚酶鏈式反應(PCR)一、目的 了解PCR的基本原理，掌握PCR的基本操作技術。二、原理 PCR (Polymerase Chain Reaction)是80年代中發(fā)展起來的一種DNA特定片段體外擴增技術。它已廣泛應用于基因克隆、文庫構(gòu)建、DNA序列分析、生化檢測、基因定位等領域。最初PCR是用E.coli DNA聚合酶I的Klenow片段進行，但Klenow片段高溫下迅速失活，因此每一輪反應都需要加一份新酶，這不僅麻煩，還往往導致產(chǎn)量低，產(chǎn)物長短不一等現(xiàn)象。隨后，從噬熱細菌(Thermas aquaticus)中分離到熱穩(wěn)定的Taq聚合酶，才解決了這一問題。由于Taq DNA聚合酶高溫下穩(wěn)定，在整個擴增過程中不需要添加新的酶，從而保證了PCR技術的實用性，使其得以迅速發(fā)展。 PCR的原理及過程如下: (1) 將反應體系(模板DNA、引物1、引物2、Mg2+、4種dNTP和Taq DNA聚合酶)置于高溫(94)下變性，使模板雙鏈DNA解鏈為兩條單鏈；(2) 在低溫(3765)下退火，使引物與模板鏈3端結(jié)合，形成部分雙鏈DNA；(3) 在中溫(72)下，通過Taq DNA聚合酶使引物從5端向3端延伸，隨著4種dNTP的摻入合成新的DNA互補鏈，完成第一輪變性、退火和聚合反應循環(huán)。反復進行這種變性、退火和聚合反應循環(huán)，可使兩端引物限定范圍內(nèi)的DNA序列以指數(shù)形式擴增(見附圖)。循環(huán)的次數(shù)主要取決于模板的濃度，從理論上講一個目的DNA分子經(jīng)20輪擴增后，可達106。三、實驗材料 重組質(zhì)粒DNA。四、儀器設備 DNA熱循環(huán)儀 電泳儀 電泳槽 紫外檢測儀 臺式離心機五、實驗用具 0.5ml離心管10個 吸管頭若干個 微量取液器(20 ml)一支 1.5ml離心管20個 離心管架兩個六、試劑 1. 反應緩沖液：由Taq酶供應廠商提供。 2. 四種核苷酸混合物(dNTPs)：濃度為2 mM。 3. 寡核苷酸(PCR引物)：上游引物和下游引物(一般長度為1720個核苷酸)。 4. Taq DNA聚合酶 5. 1.2% 瓊脂糖凝膠七、實驗步驟 1. 模板DNA的抽提：按堿裂解法抽提得到質(zhì)粒DNA。 2. PCR操作： (1) PCR反應混合液的配制 （n為反應數(shù)）： n x 2.0 ml反應緩沖液(含15 mM MgCl2) n x 1.0 ml dNTPs (2 mM) n x 1.0 ml上游引物(5 mM) （引物在反應液中的濃度通常為0.20.5mM） n x 1.0 ml下游引物(5 mM) n x 0.50.8單位Taq酶 加無菌水至總體積 n x 19 ml 每個PCR管中加入19 ml反應混合液，1 ml稀釋質(zhì)粒DNA（2 ng），再加2滴礦物油，防止水分蒸發(fā)。稍離心。 含有重組質(zhì)粒的菌體也可直接用于PCR擴增：用牙簽點取少量菌體在空的PCR管底部插幾下，加入反應混合液和滴礦物油即可。注意：菌體不可太多，太多的菌體(即雜質(zhì))會抑制Taq酶的活性。(2) PCR反應過程：94，1分鐘(預變性，可用STOP鍵或Pause鍵進行) 94，30秒 55，1分鐘 35個循環(huán) 72，2分鐘 72，5分鐘 3. PCR產(chǎn)物的檢測：取5 ml PCR產(chǎn)物在瓊脂糖凝膠中電泳，然后放在紫外檢測儀下觀察，記錄結(jié)果。八、注意事項 由于PCR靈敏度非常高，所以應當采取措施以防反應混合物受痕跡量DNA的污染。因而在實驗中應注意下列事項： 1. 所有的與PCR有關的試劑，只作PCR實驗用，而不挪作它用。 2. 操作中所用的PCR管、離心管、吸管頭等都只能一次性使用。4. 特別注意防止引物受到用同一引物擴增的DNA的污染。應從引物母液中取一小部分稀釋成工作液作平常用，以避免污染引物母液。九、時間安排一個下午；PCR產(chǎn)物電泳檢測時，進行植物DNA的抽提。實驗九 植物DNA的抽提一、目的 掌握總DNA的抽提方法和原理。二、原理 植物的各個部位都可用作總DNA的抽提材料，但常用的材料為植物葉片和幼苗。為了獲得高純度的DNA，用作抽提材料的植物幼苗，最好先在黑暗的條件下放置幾天，以消除葉綠素的影響。 植物總DNA的抽提方法有多種，不同的植物都有最合適的抽提方法。但各種方法的基本原理都一樣，其原理是先用機械的方法使組織和細胞破碎，然后加入十二烷基肌酸鈉(sarkosyl)、十六烷基三甲基溴化銨(hexadeyltrimethyl ammomum bromide，簡稱為CTAB)、十二烷基硫酸鈉(sodium dodecyl sulfate，簡稱為SDS)等離子型表面活性劑，溶解細胞膜和核膜蛋白，使細胞膜和核膜破裂，進入細胞核內(nèi)的表面活性劑解聚核中的核蛋白(并與蛋白質(zhì)形成混合物)；再加入酚和氯仿等表面活性劑，使蛋白變性；經(jīng)離心除去植物的組織和變性蛋白；上清液中加入無水乙醇使DNA沉淀；沉淀DNA溶于TE溶液中，即得植物總DNA溶液。三、實驗材料：水稻葉片等植物材料。四、儀器設備 高速冷凍離心機 電泳裝置2套 液氮罐 高速臺式離心機 振蕩器1臺五、實驗用具 1.5毫升離心管架1個 7毫升離心管架1個 50ml離心管架1個 玻璃滴管5支 研缽一套 紗布 離心管50 ml10、7 ml10、1.5 ml10 (離心管、吸頭及玻璃滴管均需消毒)六、試劑 無水乙醇, 70%乙醇 氯仿 瓊脂糖 TBE電泳緩沖液 TE緩沖液(pH 8.0) 10 mg/ml的RNase溶液 3 M乙酸鈉(NaAc) 限制性內(nèi)切酶(Pst I 或EcoR I) 抽提緩沖液(配制1升)： 母 液配制1升所需的量最終濃度 5 M NaCl 100 ml500 mM1 M Tris-HCl(pH 8.0) 100 ml100 mM500 mM EDTA(pH