口腔生物學(xué)課件_5口腔細(xì)胞培養(yǎng)及其應(yīng)用.doc

口腔細(xì)胞培養(yǎng)及其應(yīng)用 細(xì)胞培養(yǎng)：模擬體內(nèi)的生理環(huán)境，在適當(dāng)?shù)臈l件下，使活體組織細(xì)胞在體外環(huán)境存活、生長增殖，并維持其結(jié)構(gòu)功能。 貼壁型細(xì)胞： 必須貼附于支持物表面才能生長。大多數(shù)培養(yǎng)細(xì)胞貼附生長，屬于貼壁依賴性細(xì)胞 潛伏期（游離期，貼壁期） 對數(shù)生長期 停止期（平臺期） 潛伏期：細(xì)胞接種培養(yǎng)后，先經(jīng)過一個在培養(yǎng)液中呈懸浮狀態(tài)的懸浮期。此時細(xì)胞胞質(zhì)回縮，胞體呈圓球形。接著是細(xì)胞附著或貼附于底物表面上，稱貼壁，懸浮期結(jié)束。各種細(xì)胞貼附速度不同，這與細(xì)胞的種類、培養(yǎng)基成分和底物的理化性質(zhì)等密切相關(guān)。 初代培養(yǎng)細(xì)胞貼附慢，可長達(dá)1024小時或更多；連續(xù)細(xì)胞系和惡性細(xì)胞系快，1030分鐘即可貼附。細(xì)胞貼附現(xiàn)象是一個非常復(fù)雜和與多種因素相關(guān)的過程。支持物能影響細(xì)胞的貼附；底物表面不潔不利貼附，底物表面帶有陽性電荷利于貼附。另外在貼附過程中，有一些特殊物質(zhì)如纖維連接素，細(xì)胞表面蛋白等也參與貼附過程。這些物質(zhì)都是蛋白類成分，它們有的存在于細(xì)胞膜的表面，有的則來自培養(yǎng)基中的血清。貼附是貼附類細(xì)胞生長增殖條件之一。 超凈臺 濾 器 壓力蒸汽消毒器：濕熱消毒，用途廣 電熱干燥箱：干熱消毒（160 ，2小時）。主要用干玻璃 器皿消毒 濾器：過濾除菌：大多數(shù)培養(yǎng)用液，如人工合成培養(yǎng)基、血清、 酶液等均采用濾過法除菌 超凈工作臺：為細(xì)胞操作提供無菌環(huán)境 紫外燈 ：紫外線消毒。 主要用于培養(yǎng)室空氣、操作臺、塑料 培養(yǎng)皿和培養(yǎng)板等表面消毒 水：新鮮配置的三蒸水或去離子水 平衡鹽溶液：無Ca2+、Mg2+的緩沖液 天然培養(yǎng)基： 天然培養(yǎng)基有血清、血漿、和組織提取液（如雞胚和牛胚浸液）。 優(yōu)點：營養(yǎng)成分豐富，培養(yǎng)效果好 缺點：來源受限。 成分復(fù)雜，影響對某些實驗產(chǎn)物的提取和實驗結(jié) 果的分析。 易發(fā)生支原體污染 合成培養(yǎng)基 合成培養(yǎng)基是根據(jù)細(xì)胞生存所需物質(zhì)的種類和數(shù)量，用人工方法模擬合成的。目前已設(shè)計出許多種培養(yǎng)基，如TC199、MEM、RPMI-1640、 DMEM等。 合成培養(yǎng)基主要成分是氨基酸、維生素、碳水化合物、無機鹽和其它一些輔助物質(zhì)。 優(yōu)點：標(biāo)準(zhǔn)化生產(chǎn)，組分和含量相對固定。 成本低 缺點： 缺少某些成分，不能完全滿足體外細(xì)胞生長需要。 人工合成培養(yǎng)基只能維持細(xì)胞生存，要想使細(xì)胞生長和繁殖，還需補充一定量的天然培養(yǎng)基（如血清）。 血清中含有： 多種蛋白質(zhì)（白蛋白、球蛋白、鐵蛋白等） 多種金屬離子； 激素； 促貼附物質(zhì)，如纖粘蛋白、冷析球蛋白、膠原等。 各種生長因子 轉(zhuǎn)移蛋白 不明成分 無血清培養(yǎng)基的主要研制策略：在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中補充各種必需因子，如激素、生長因子 、結(jié)合蛋白 、貼壁和擴展因子 等。 無血清培養(yǎng)基由基礎(chǔ)培養(yǎng)基和替代血清的補充成分組成。 無血清細(xì)胞培養(yǎng)基的使用保證了實驗結(jié)果的準(zhǔn)確性、可重復(fù)性和穩(wěn)定性，減少了細(xì)胞污染，簡化了提純和鑒定各種細(xì)胞產(chǎn)物的程序。 低溫保護(hù)劑的應(yīng)用 在細(xì)胞凍存時加入溫保護(hù)劑，能大大提高凍存效果。 常用的低溫保護(hù)劑是DMSO，它是一種滲透性保護(hù)劑，可迅速透入細(xì)胞，提高胞膜對水的通透性，降低冰點，延緩凍結(jié)過程，能使細(xì)胞內(nèi)水分在凍結(jié)前透出細(xì)胞外，在胞外形成冰晶，減少胞內(nèi)冰晶，從而減少冰晶對細(xì)胞的損傷。 凍存和復(fù)蘇的原則：慢凍快融 當(dāng)細(xì)胞冷到零度以下，可以產(chǎn)生以下變化：細(xì)胞器脫水，細(xì)胞中可溶性物質(zhì)濃度升高，并在細(xì)胞內(nèi)形成冰晶。 如果緩慢冷凍，可使細(xì)胞逐步脫水，細(xì)胞內(nèi)不致產(chǎn)生大的冰晶；相反結(jié)晶就大，大結(jié)晶會造成細(xì)胞膜、綱胞器的損傷和破裂。復(fù)蘇過程應(yīng)快融，目的是防止小冰晶形成大冰晶，即冰晶的重結(jié)晶。 原代培養(yǎng) 取自體內(nèi)新鮮組織并置于體外條件下生長的細(xì)胞在傳代之前稱為原代培養(yǎng)。 傳代培養(yǎng) 細(xì)胞在培養(yǎng)器皿中生長一定時間后，被分開接種到新的培養(yǎng)器皿中。 功能特點 分泌功能 礦化功能 收縮功能 附著能力 再生能力 增殖分化影響因素 生長因子 胰島素 纖維粘連蛋白 抗壞血酸 羥基磷灰石 二、唾液腺細(xì)胞 細(xì)胞形態(tài)特點 腺泡上皮細(xì)胞 導(dǎo)管上皮細(xì)胞 肌上皮細(xì)胞 免疫組織化學(xué)染色 腺泡上皮細(xì)胞：角蛋白、淀粉酶、對氨基水楊酸、導(dǎo)管上皮膜、 前角蛋白、單克隆角蛋白、分泌成分陽性反應(yīng) 導(dǎo)管上皮細(xì)胞：角蛋白、上皮膜蛋白、磷酸酐酶抗體染色陽性反應(yīng) 肌上皮細(xì)胞： 肌動蛋白、S100蛋白、肌凝蛋白抗體染色陽性反應(yīng) 功能特點 分泌功能 腺泡細(xì)胞：淀粉酶、PRP、唾液過氧化物酶、特異蛋白等 腺泡上皮細(xì)胞：頂端分泌、基底及側(cè)膜分泌 導(dǎo)管細(xì)胞：膠原 肌上皮細(xì)胞：膠原 唾液腺細(xì)胞的增殖分化 基底潛能干細(xì)胞理論 單細(xì)胞全能干細(xì)胞理論 雙細(xì)胞亞全能干細(xì)胞理論 增殖分化功能影響因素 細(xì)胞因子 激素 細(xì)胞外基質(zhì) 鈣離子 三、口腔粘膜細(xì)胞 培養(yǎng)方法 組織塊法 酶消化法 細(xì)胞形態(tài)特點 免疫組織化學(xué)染色 波形絲蛋白表達(dá)陰性 多種角蛋白表達(dá)陽性 功能 分泌：膠原蛋白和非膠原蛋白 金屬蛋白酶 四、頜骨相關(guān)的硬組織細(xì)胞 分散組織 機械分離法 消化分離法 培養(yǎng)細(xì)胞的純化 人工純化（酶消化法，機械刮除法，反復(fù) 貼壁法，克隆法等） 自然純化 細(xì)胞的凍存與復(fù)蘇 所謂冷凍保存，就是將體外培養(yǎng)物或生物活性材料懸浮在加有或不加冷凍保護(hù)劑的溶液中，以一定的冷凍速率降至零下某一溫度，并在此溫度下對其長期保存的過程。而復(fù)蘇就是以一定的復(fù)溫速率將凍存的體外培養(yǎng)物或生物活性材料恢復(fù)到常溫的過程。不論是微生物、動物細(xì)胞、植物細(xì)胞還是體外培養(yǎng)的器官都可以進(jìn)行凍存，并在適當(dāng)條件下復(fù)蘇。 常規(guī)細(xì)胞培養(yǎng)法 細(xì)胞培養(yǎng)的污染、檢測與控制 微生物污染 空氣、器材、操作、試劑、組織標(biāo)本 微生物污染的檢測 細(xì)菌和真菌的污染和檢測 肉眼直接觀察法 培養(yǎng)檢查法 顯微鏡觀察法 支原體的污染和檢測 造成支原體高污染率的原因： 0.8 um，無細(xì)胞壁，可透過一般過濾膜（0.22-0.45 um）； 2.支原體污染時，沒有明顯的肉眼或一般光學(xué)顯微鏡可觀察到的特征變化 ；3.過去缺乏簡單、快速且可靠的檢測方式； 4.細(xì)胞流通間缺乏物品管理，造成實驗室間的相互污染； 5.研究或操作人員忽略污染問題； 6.已受污染的細(xì)胞； 7.已受污染的培養(yǎng)基、血清。 支原體之檢測： 相差顯微鏡觀察法、電鏡法 Hayflick培養(yǎng)基直接培養(yǎng)法 DNA熒光染色法 PCR方法 微生物污染的控制 抗生素除菌法 加溫處理 化學(xué)污染 細(xì)胞交叉污染 第二節(jié) 口腔醫(yī)學(xué)中相關(guān)細(xì)胞培養(yǎng)及其特點 一、 牙齒相關(guān)細(xì)胞 牙髓細(xì)胞 培養(yǎng)中的細(xì)胞成分： 成纖維細(xì)胞 未分化的間充質(zhì)細(xì)胞 培養(yǎng)方法 取材 浸泡 修剪 鋪瓶 培養(yǎng) 細(xì)胞形態(tài)特點 免疫組織化學(xué)染色 波形絲蛋白表達(dá)陽性 角蛋白、神經(jīng)絲蛋白、結(jié)蛋白、膠質(zhì)細(xì)胞 原纖維酸性蛋白表達(dá)陰性 生長增殖特點 成功率 快速增殖期 死亡 功能特點 堿性磷酸酶活性 礦化現(xiàn)象 對鈣調(diào)節(jié)因子的作用 對細(xì)胞因子的反應(yīng) 對氫氧化鈣、羥基磷灰石蓋髓劑的反應(yīng) 牙周膜細(xì)胞 培養(yǎng)方法 取材 浸泡 修剪 鋪瓶 培養(yǎng) 培養(yǎng)中的細(xì)胞成分： 成纖維細(xì)胞 未分化的間充質(zhì)細(xì)胞 細(xì)胞形態(tài)特點 免疫組織化學(xué)染色 波形絲蛋白表達(dá)陽性 角蛋白、神經(jīng)絲蛋白、結(jié)蛋白、膠質(zhì)細(xì)胞 原纖維酸性蛋白表達(dá)陰性 生長增殖特點 成功率 快速增殖期 死亡 指數(shù)增生期：這是細(xì)胞增值最旺盛的階段，細(xì)胞分裂相增多。指數(shù)增生期細(xì)胞分裂相數(shù)量可作為判定細(xì)胞生長旺盛與否的一個重要標(biāo)志。一般以細(xì)胞分裂指數(shù)表示，即細(xì)胞群中每1000個細(xì)胞中的分裂相數(shù)。一般細(xì)胞的分裂指數(shù)介于0.1%0.5%，初代細(xì)胞分裂指數(shù)低，連續(xù)細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞分裂指數(shù)可高達(dá)3%5%。 特點： 是細(xì)胞增生最活躍、活力最旺盛的階段 培養(yǎng)物中細(xì)胞數(shù)量呈指數(shù)增長,細(xì)胞群體均一 是理想的實驗用細(xì)胞 在接種細(xì)胞數(shù)量適宜情況下，指數(shù)增生期持續(xù)35天后，隨細(xì)胞數(shù)量不斷增多、生長空間漸趨減少、最后細(xì)胞相互接觸匯合成片。細(xì)胞相互接觸后，如培養(yǎng)的是正常細(xì)胞，由于細(xì)胞的相互接觸能抑制細(xì)胞的運動，這種現(xiàn)象稱接觸抑制。 細(xì)胞接觸匯合成片后，雖發(fā)生接觸抑制，只要營養(yǎng)充分，細(xì)胞仍然能夠進(jìn)行增殖分裂，因此細(xì)胞數(shù)量仍在增多。但當(dāng)細(xì)胞密度進(jìn)一步增大，培養(yǎng)液中營養(yǎng)成分減少，代謝產(chǎn)物增多時，細(xì)胞因營養(yǎng)的枯竭和代謝物的影響，則發(fā)生密度抑制，導(dǎo)致細(xì)胞分裂停止。 停滯期：細(xì)胞數(shù)量達(dá)飽和密度后，細(xì)胞遂停止增殖，進(jìn)入停滯期。此時細(xì)胞數(shù)量不再增加，故也稱平臺期。停滯期細(xì)胞雖不增殖，但仍有代謝活動，繼而培養(yǎng)液中營養(yǎng)漸趨耗盡，代謝產(chǎn)物積累、pH降低。此時需做分離培養(yǎng)即傳代，否則細(xì)胞會中毒，發(fā)生形態(tài)改變，重則從底物脫落死亡，故傳代應(yīng)越早越好。 培養(yǎng)細(xì)胞的體外生長環(huán)境 無污染環(huán)境 超凈工作臺的工作原理是利用鼓風(fēng)機驅(qū)動空氣遁過高效濾器除去空氣中的塵埃顆粒，使空氣得到凈化。凈化空氣徐徐通過工作臺面，使工作臺內(nèi)構(gòu)成無菌環(huán)境。 基 質(zhì) 玻璃基質(zhì) 塑料 飼養(yǎng)細(xì)胞 生物性基質(zhì)處理培養(yǎng)表面 金屬 氣體環(huán)境和氫離子濃度 Hepers 緩沖液 CO2 +H2O H2CO3 H+ + HCO3- CO2: 5% 液相環(huán)境 溫度 滲透壓 二、 細(xì)胞培養(yǎng)的基本方法 無菌操作技術(shù) 體外培養(yǎng)細(xì)胞缺乏抗感染能力，所以防止污染是決定培養(yǎng)成功或失敗的首要條件。即便使用設(shè)備完善的實驗室，若實驗者粗心大意，技術(shù)操作不規(guī)范,也會導(dǎo)致污染。因而,為在一切操作中最大可能地保證無菌，每一項工作都必須做到有條不紊和完全可靠。 培養(yǎng)前準(zhǔn)備 在開始實驗前要制定好實驗計劃和操作程序。有關(guān)數(shù)據(jù)的計算要事先做好。根據(jù)實驗要求，準(zhǔn)備各種所需器材和物品放置操作場所(培養(yǎng)室、超凈臺)內(nèi)消毒。這可以避免開始實驗后，因物品不全往返拿取而增加污染機會。 培養(yǎng)室的消毒 無菌培養(yǎng)室每天都要用0.2%的新潔爾滅拖洗地面次(拖布要專用)，紫外線照射消毒30-50min，超凈工作臺臺面每次實驗前要用75酒精擦洗。然后紫外線消毒30min。些操作用具如移液器、廢液缸、污物盒、試管架等用75%酒精擦洗后置于臺內(nèi)同時紫外線消毒。 洗手和著裝 原則上和外科手術(shù)相同。并于開始操作前要用75酒精消毒手和前臂。如果實驗過程中手觸及可能污染的物品和出入培養(yǎng)室都要重新用消毒液洗手。進(jìn)入原代培養(yǎng)室需徹底洗手還要戴口罩、著消毒衣帽。 培養(yǎng)過程中的無菌操作 在無菌環(huán)境進(jìn)行培養(yǎng)或做其它無菌工作時，首先要點燃酒精燈。以后一切操作，如按裝吸管帽、打開或封閉瓶口等，都需在火焰近處并經(jīng)過