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第4章生物傳感器關鍵技術 分子識別元件固定化 本章主要內(nèi)容基本方法常用的三種經(jīng)典方法LB膜技術分子自組裝 SAM 技術 1 概述 早期的生物活性物質(zhì)測量法 如酶分析法 是在水溶液狀態(tài)下進行的 由于酶在水溶液中一般不太穩(wěn)定 且酶只能和底物作用一次 因此 使用起來很不方便 要使酶作為生物敏感膜使用 必須研究如何將酶固定在各種載體上 稱為酶的固定化技術 同常規(guī)方法相比 使用限制在電極表面的固定化酶具有很多誘人的特征 1 固定化酶可以很快從反應混合物中分離 并能重復使用 2 通過適當控制固定化酶的微環(huán)境 可獲得很多所需要的性質(zhì) 如高穩(wěn)定性 高靈敏度 快速的響應等 3 在選擇電極尺寸和形狀方面具有較大的靈活性 易于微型化或采用復雜的表面 如網(wǎng)狀玻碳 4 可防止溶液中其它物質(zhì)的干擾和對電極表面的玷污等 2 生物敏感膜 分子識別元件 的固定化方法是生物傳感器制作的關鍵問題之一 固定化的目的在于使被測物與生物敏感膜反應所產(chǎn)生的信號耦合到換能器上 以便通過換能器轉(zhuǎn)換為易于檢測的電信號 生物傳感器具有的選擇性 特異性 穩(wěn)定性 高靈敏度和快速響應時間等優(yōu)異特性都需要依靠一種合適的分子識別元件的固定化方法來實現(xiàn) 也決定著生物傳感器是否有研究和應用價值 3 固定化的基本要求 1 保持原有分子識別元件活性 2 盡量減小非特異性吸附 3 固定量大 4 固定牢固 不易脫落 5 均勻 致密 6 不影響換能器的靈敏度和響應時間 4 4 1基本方法 目前 被廣泛研究過的固定化技術主要有吸附法 包埋法 交聯(lián)法 共價鍵合法等 現(xiàn)對它們介紹如下 以酶為例 5 4 1 1吸附法 分子識別元件在電極表面的物理吸附是一種較為簡單的固定化技術 酶在電極上的吸附一般是通過含酶緩沖溶液的揮發(fā)進行的 通常溫度為4 因此 酶不會發(fā)生熱降解 吸附后 還可以通過交聯(lián)法來增加穩(wěn)定性 物理吸附具有無需化學試劑 極少的活化和清洗步驟 很少發(fā)生酶降解 對酶分子活性影響較小等優(yōu)點 但對溶液的pH值變化 溫度 離子強度和電極基底較為敏感 需要對實驗條件進行相當程度的優(yōu)化 該方法由于存在吸附過程的可逆性 生物活性單元易從電極表面脫落 而且同其它固定化技術相比 分子識別元件的壽命較短 因此 在各種生物傳感器的研制中 現(xiàn)已很少采用這種方法 固體吸附劑有 活性炭 硅藻土 多孔陶瓷 多孔玻璃等 6 4 1 2物理包埋法 迄今為止 應用最為普遍的固定化技術是采用凝膠 聚合物包埋 它能將酶分子或細胞包埋并固定在高分子聚合物三維空間網(wǎng)狀結(jié)構中 最為常用的聚合物是聚丙烯酰胺 該技術的特點是 1 可采用溫和的試驗條件及多種凝膠 聚合物 2 大多數(shù)酶可很容易地摻入聚合物膜中 一般不產(chǎn)生化學修飾 3 對酶活性影響較小 4 膜的孔徑和幾何形狀可任意控制 5 包埋的酶不易泄漏 并可采用其它固定化技術如共價鍵合法和交聯(lián)法進一步改進包埋的穩(wěn)定性 6 可固定高濃度的分子識別元件 7 此外 包埋法還具有過程簡單 可對多種分子識別元件進行包埋的優(yōu)點 這種固定技術在某些方面也具有一定的局限 如 必須控制很多試驗因素 聚合物形成過程中產(chǎn)生的自由基對生物活性單元可能產(chǎn)生失活作用 聚合物的空間結(jié)構使之局限于測定較小尺寸的物質(zhì) 而且 由于大的擴散排阻使響應時間增加 采用這種固定化技術時 通常采用物理的方法將凝膠 聚合物限制在電極表面 這使得傳感器難以微型化 8 包埋法包括基質(zhì)包埋法和微膠囊包埋法兩種 微型膠囊包埋法 基質(zhì)包埋法 9 4 1 3交聯(lián)法 通過采用雙功能團試劑 在分子識別元件之間 分子識別元件與凝膠 聚合物之間交聯(lián)形成網(wǎng)狀結(jié)構而使分子識別元件固定化的方法稱為交聯(lián)法 最常用的交聯(lián)試劑為戊二醛 能在溫和的條件下與蛋白質(zhì)的自由氨基反應 其原理反應式如下 雙功能試劑 戊二醛 需要固定的生物敏感膜 蛋白質(zhì) 傳感器 表面帶 NH2 經(jīng)過固定化處理后的傳感器 表面固定上了生物敏感膜 酶 10 采用交聯(lián)法的局限是膜的形成條件不易確定 需要仔細地控制pH值 離子強度 溫度及反應時間 酶膜的厚度及戊二醛的濃度對傳感器的響應具有重要影響 1 當酶膜較厚時 由于擴散受到阻礙 致使響應信號下降 響應時間延長 2 戊二醛的濃度較低時 對固定化酶的失活作用較弱 但固定化酶的量也少 而戊二醛的濃度較高時 酶的固定量雖然增大 但對固定化酶的失活作用也大 3 同時 雙功能團試劑也可能不是選擇性的 既可能發(fā)生分子間鍵合又可能發(fā)生分子內(nèi)鍵合 交聯(lián)法分為酶交聯(lián)法 輔助蛋白交聯(lián)法 吸附交聯(lián)法 載體交聯(lián)法 11 此法借助雙功能試劑 bifunctionalagents 使蛋白質(zhì)結(jié)合到惰性載體或蛋白質(zhì)分子彼此交聯(lián)成網(wǎng)狀結(jié)構 雙功能試劑具有兩個功能基團 能與蛋白質(zhì)中賴氨酸的 氨基 N端的 氨基 酪氨酸的酚基或半胱氨酸的巰基發(fā)生共價交聯(lián) 可供交聯(lián)的雙功能試劑見表3 5 這些交聯(lián)試劑都含有兩個相同的活性基團 因此又稱為同質(zhì)交聯(lián)試劑 其中以戊二醛最經(jīng)常使用 戊二醛能與蛋白質(zhì)分子中的游離氨基形成Schiff堿而發(fā)生交聯(lián) 戊二醛與蛋白質(zhì)的反應 戊二醛 蛋白質(zhì) 關于雙功能試劑 12 13 4 1 4共價鍵合法 將生物分子識別元件通過共價鍵與電極表面結(jié)合而固定的方法稱為共價鍵合法 通常要求在低溫 0 低離子強度和生理pH條件下進行 并加入酶的底物以防止酶的活性部位與電極表面發(fā)生鍵合作用而失活 當共價鍵在生物分子的非活性部位鍵合時 被固定的分子仍能保持較高的活力 電極表面的共價鍵合比吸附困難 但固定化酶穩(wěn)定性較好 因此應用廣泛 共價鍵 14 當向電極表面共價鍵合酶等生物分子識別元件時 需考慮很多因素 鍵合過程通常包括三個步驟 基底表面的活化 酶的偶聯(lián) 除去鍵合疏松的酶 這些步驟中每一步合適的試驗條件都取決于生物分子識別元件及偶聯(lián)劑的特性 下面簡單介紹幾種常用的基底表面活化方法 15 基底表面活化的方法 1 重氮法2 迭氮法3 溴化氰法4 烷基化法 16 重氮法 將含有苯氨基的不溶性載體與亞硝酸反應生成重氮鹽衍生物 使基底表面引進活潑的重氮基團 苯氨基 17 18 迭氮法 含有酰肼基團的基底表面可用亞硝酸活化 生成迭氮化合物 19 溴化氰法 含有羥基的基底表面 如纖維素等 可用溴化氰活化生成亞氨基碳酸衍生物 20 烷基化法 含羥基的基底表面可用三氯 均三嗪等多鹵代物進行活化 形成含有鹵素基團的活化基底表面 21 4 2常用的三種經(jīng)典方法 硅烷化固定法PEI固定法SPA固定法 又稱蛋白A法 22 4 2 1硅烷化固定法 硅烷偶聯(lián)劑最早是于本世紀40年代由美國聯(lián)合碳化物公司 UCC 和道康寧公司 DCC 首先為發(fā)展玻璃纖維增強塑料而開發(fā)的 最初把它作為玻璃纖維的表面處理劑而用在玻璃纖維增強塑料中 硅烷偶聯(lián)劑是繼有機硅工業(yè)中三大產(chǎn)品 硅油 硅橡膠 硅樹脂之后的第四大部類 在有機硅工業(yè)中的地位日趨重要 已成為現(xiàn)代有機硅工業(yè) 有機高分子工業(yè) 復合材料工業(yè)及相關高技術領域中不可缺少的配套化學助劑 而且是一種重要的高科技含量 高附加值的有機硅產(chǎn)品 23 硅烷化固定法是一種比較成熟 應用較多的固定化方法 硅烷法是對金屬表面進行活化的最常用的方法之一 而3 APTES則是最常用的硅烷化合物 一般過程為 先使表面氧化 然后與水等作用 形成富含 OH的活性表面 例如使用Pt Al電極就是因為這種電極的氧化層非常容易得到 然后用硅烷化試劑 常用3 氨丙基三乙氧基硅烷 3 APTES 的丙酮溶液 得到含氨基或羥基的活性表面 最后在直接進行生物敏感膜的固定或使用雙功能試劑 如GA DSS等 固定 這種固定化方法適合表面為玻璃 活化硅膠 金 鋁等 3 APTES分子式 OCH2CH3 3Si CH2 3NH2DSS 琥珀酸辛二酯 雙功能試劑 24 B Arkles對硅烷偶聯(lián)劑的作用過程提出了四步反應模型 即 1 與硅相連的3個Si X基水解成Si OH 25 2 Si OH之間脫水縮合成含Si OH的低聚硅氧烷 26 3 低聚物中的Si OH與基材表面上的OH形成氫鍵 27 4 加熱固化過程中伴隨脫水反應而與基材形成共價鍵連接 一般認為 在界面上硅烷偶聯(lián)劑的硅與基材表面只有一個鍵合 剩下兩個Si OH 或者與其他硅烷中的Si OH縮合 或者介質(zhì)游離狀態(tài) 28 例1 玻璃表面固定BSA 3 APTES分子式 OCH2CH3 3Si CH2 3NH2DSS 琥珀酸辛二酯 雙功能試劑 29 例2 玻璃表面利用氨基硅烷固定葡萄糖氧化酶 30 例3 玻璃表面利用醛基硅烷固定葡萄糖氧化酶 31 例4 金表面利用氨基硅烷固定單鏈DNA1 表面預處理金表面在使用前要經(jīng)過預處理 以除去表面的有機物質(zhì) 先在1 2mol L的NaOH溶液中浸泡10min 用蒸餾水清洗后 再浸入1 2mol L的HCl溶液中浸泡10min 用蒸餾水清洗 接著用Piranha溶液浸泡30min 再依次用蒸餾水 丙酮 無水乙醇 純凈水清洗 最后用超聲波清洗5min 2 金表面修飾 NH33 APTES是一種很好的表面活性劑 由于3 APTES上的硅原子一端可以與金等無機原子牢固結(jié)合 用3 APTES修飾鍍金石英晶體片表面 形成Au O Si鍵 將3 APTES固定在金表面 這樣金表面就形成為富含 NH2的表面 3 固定ssDNA加入ssDNA 金表面修飾的 NH2能與ssDNA的磷酸基團發(fā)生反應生成磷酰酯而固定ssDNA 從而將ssDNA牢固地結(jié)合在金電極上 32 硅或鋁表面固定固定硅烷 33 4 2 2PEI固定法 PEI 聚乙烯亞胺 法屬于聚合物膜法的一種 多用于比較研究 一般步驟為 先用2 4 的PEI甲醇溶液處理電極 得到PEI修飾層 再用戊二醛活化處理 然后與要固定的生物識別分子反應即可 這種方法的關鍵是控制PEI和戊二醛的濃度以及對未反應醛基的封閉 聚合物膜固定法中還可以采用其他聚合物如 羧甲基纖維素 聚丙烯酰胺 甲基丙烯酸甲酯和甲基丙烯酸乙酯共聚物 聚苯乙烯等 單體在電極表面現(xiàn)場生成聚合物膜的方法可以應用電聚合 等離子體聚合 甚至光聚合等技術來實現(xiàn) 這種聚合膜的特點是薄而均勻 比PEI法 APTE法的固定效果好 這種方法一般需要中間引物 一般為雙功能物質(zhì) 如戊二醛 所以封閉戊二醛未反應的醛基對于傳感器的選擇性和特異性至關重要 34 4 2 3SPA固定法 此法一般是利用一些如蛋白A 蛋白G和BSA等可以牢固地吸附在電極上 主要是金電極 而且本身又可以結(jié)合或標記上生物物質(zhì)的特點來實現(xiàn) 這種方法具有生物毒性小的優(yōu)點 對活體測定有一定的潛力 蛋白A固定法的一般步驟為 1 先在1 2mol L的NaOH溶液中浸泡10min 用蒸餾水清洗后 再浸入1 2mol L的HCl溶液中浸泡10min 用蒸餾水清洗 2 然后用PBS緩沖溶液 pH7 2 浸泡或涂覆金表面 就得到蛋白A修飾的傳感器表面 這一表面可以用來直接固定抗體 由于蛋白A與免疫球蛋白IgG可以特異性結(jié)合 因此蛋白A修飾的傳感器表面可以用來直接測定免疫球蛋白IgG 35 SPA法被公認為是一種非常有效的抗體固定方法 這是因為蛋白A具有與抗體的Fc段結(jié)合的特性 而抗原與抗體的結(jié)合位點在抗體的Fab段 故蛋白A與抗體結(jié)合后不影響抗體與抗原的結(jié)合 且蛋白A與金的親和常數(shù)高達108mol L 修飾層穩(wěn)定 操作簡單 無須中間物 如交聯(lián)劑 引入 因此有很好的重現(xiàn)性及穩(wěn)定性 研究表明蛋白A在電極上成膜好壞與蛋白質(zhì)濃度及成膜時間等因素有關 浸泡法優(yōu)于涂覆法 前者自組裝所形成的功能膜有序致密 且活性損失更小 而后者固定抗體增大了蛋白A非特異性吸附 重現(xiàn)性要差一些 不過需指出的是SPA法只能用來固定抗體 而不能固定抗原或其它生物物質(zhì) 36 4 3LB膜技術 生物傳感器的響應速度和響應活性是一對相互影響的因素 以酶傳感器為例 一般情況下隨固定的酶量增大 響應活性相應增高 但酶量大會使膜的厚度增加 造成響應速度減慢 近年來盛行研究用于活體測定的微型傳感器 傳感器的直徑在微米級 生物膜的制作技術也必須與之相適應 于是有些學者將注意力轉(zhuǎn)向Langmuir Blodgett LB 膜技術 37 LB膜基本原理是 許多生物分子 如脂質(zhì)分子和一些蛋白質(zhì)分子 在潔凈的水表面展開后能形成水不溶性液態(tài)單分子膜 小心壓縮表面積使液態(tài)膜逐漸過渡到成為一個分子厚度的擬固態(tài)膜 圖3 5 這種膜以技術的發(fā)明者命名 稱為LB膜 LB膜實驗對液體的純度 pH和溫度有很高的要求 液相通常是純水 操作壓力通過壓力傳感器和計算機反饋系統(tǒng)調(diào)整 38 一旦制備好單分子膜 可以將膜轉(zhuǎn)移到預備好的基片上去 轉(zhuǎn)移過程通過馬達微米螺旋系統(tǒng)進行操作 使基片在單分子膜與界面作起落運動 當基片第一次插入并抽出時就有一層單分子膜沉積在基片表面 若要沉積三層單分子膜 就需作第二次起落運動 圖3 6 部分單分子膜被移出膜槽所引起的槽內(nèi)壓強變化由壓力傳感器和反饋裝置進行自動壓力補償 39 利用LB膜技術制作酶膜主要有兩個優(yōu)點 一 酶膜可以制得很薄 數(shù)納米 厚度和層數(shù)可以精確控制 二 可以獲得高密度酶分子膜 由此可能協(xié)調(diào)響應速度和響應活性這對矛盾 需要解決的一個特殊問題是 酶分子多為水溶性 難以在水相中成膜 可能要設計更復雜的膜結(jié)構 如先將雙功能試劑把酶分子輕度交聯(lián) 使其能在水面懸浮展開 再施加壓力形成單分子膜 或者借助脂質(zhì)分子的雙極性在脂質(zhì)單分子層上嵌入酶蛋白分子膜來制備LB酶膜 40 基本步驟如下 使兩性化合物在水相上形成單分子膜 用三甲基氯鹽配制的10 的甲苯溶液處理SnO2電極 使其疏水化 在20mN m2的表面壓力下用垂直提升法使單分子膜沉積在SnO2電極表面 2 5 戊二醛處理單分子膜1h 使外層引入甲?；鶊F 表面甲?；鶊F與GOD溶液反應1h 形成單分子GOD膜 采用LB技術首次制成GOD電極 41 4 4分子自組裝 SAM 技術 隨著生命科學 材料科學和納米科學的發(fā)展 分子有序自組裝化學 尤其是分子有序單層及多層組裝膜越來越引起科技界廣泛關注 通過對自組裝分子的設計 可以達到人為控制表面組成 結(jié)構及其功能的目的 Langmuir blodgett LB 膜 自組單層膜或簡稱自組膜 self assembledmonolayer SAM 是目前研究廣泛 對固體表面進行修飾最為有效的兩種分子有序組裝體系 分子自組裝可以從分子水平上設計多種有序的結(jié)構 為器件的應用 如非線性光學器件 具有選擇性化學響應的傳感材料的合成 微電子器件及電分析化學和生物傳感器等方面的發(fā)展開辟了廣闊的前景 本節(jié)重點介紹自組裝單分子膜的制備與表征 42 自組裝單分子膜的主要體系 有機硅烷 SiO2 或Al2O3 玻璃 石英 硅 云母 GeO2 ZnSe 烷基硫醇 金 或銀 銅 最常用 二羥基硫化物 RSR 或二羥基二硫化物 RS SR 金 醇 或胺 鉑 羧酸 Al2O3 或GuO AgO 自組裝分子 傳感器表面 43 4 4 1單分子自組裝膜概述 自組單層膜是分子自發(fā)地強化學吸附在固 液或氣 固界面形成熱力學穩(wěn)定和能量最低的有序體系 特點 高度有序 定向密集 組織完好和穩(wěn)定的分子單層 SAMs的組成結(jié)構和功能關系易于調(diào)控及表征 而且制備方法簡易 是研究表面和界面現(xiàn)象的理想模型體系 44 SAMs的形成是三種作用力作用的結(jié)果 1 長鏈有機分子的頭基與傳感器基底之間強烈的化學鍵合作用 2 自組分子鏈之間的范德華相互作用 3 分子鏈內(nèi)或末端特殊功能團之間的相互作用 由于這三種性質(zhì)不同的相互作用 推動了自組裝過程 也促進了自組裝分子在傳感器表面上成膜由無序到有序的重組 屬于高度有序的復雜組裝體系 傳感器基底 頭基 尾基 分子鏈 45 這種高度有序表現(xiàn)在有序具有多重性 化學吸附在基底表面上的頭基在二維平面空間中具有準晶格結(jié)構 為第一重有序 長鏈結(jié)構的自組分子的軸方向有序排列 為第二重有序 鑲嵌在烷基鏈內(nèi)或其末端的特殊功能團也具有準晶格結(jié)構 為第三重有序 第二重有序 第一重有序 第三重有序 46 自組裝現(xiàn)象的發(fā)現(xiàn)可以追溯到1946年Zisman以及后來Kuhn的工作 在過去20年中 自組膜的構造與表征無論在研究的深度還是廣度方面均有了長足的進步 1983年 美國化學家Nuzzo和Allara的工作成為自組膜發(fā)展史上的里程碑 他們通過在雙硫化合物的稀溶液中吸附的方法 在金表面制備了致密的硫醇自組膜 通過設計自組裝分子使其具有不同的頭基和尾基 可以在大的自由度上控制自組膜體系所涉及的作用力 自組分子與基底 自組分子之間 內(nèi)含特殊官能團之間 自組分子與溶劑之間的相互作用等 47 研究這些相互作用可以加深我們對與其密切相關的結(jié)構 潤濕 黏接 潤滑以及特殊電化學 光化學等方面的了解 推動自組裝技術在近代高科技的廣泛應用 另一方面 SAMs所具有的明晰微結(jié)構 為電化學研究提供了一個重要的實驗場所 藉此可以探測在電極表面上分子微結(jié)構和宏觀電化學響應之間的關系 與用常規(guī)方法制備的化學修飾電極相比 SAMs是分子單層膜化學修飾電極發(fā)展的最高形式 它將在提高分析檢測的靈敏度和選擇性 在控制電活性中心與電極距離 研究長程電子轉(zhuǎn)移等電分析化學的應用和理論方面發(fā)揮重要作用 48 SAM成膜與眾所周知的LB成膜最本質(zhì)的區(qū)別在于 前者屬于化學吸附 后者屬于物理吸附 生物分子識別元件在基片表面的化學吸附是一個放熱過程 從熱力學角度分析它有利于膜的形成 分子將盡可能多地與基片表面鍵合 盡可能達到最緊密排列 烷基鏈間的范德華力促使分子緊密排列 49 4 4 2分子自組裝單層膜的類型和表征 1 自組膜的類型常見的SAMs的類型有 脂肪酸在金屬氧化物表面強吸附形成自組膜 表面硅烷化形成有機硅烷自組膜 有機硫化物在金屬表面和半導體表面形成自組膜等 50 1 脂肪酸在金屬氧化物表面的自組膜長鏈的脂肪酸 CnH2n 1COOH 是典型的LB膜成膜分子 但是它也可以形成自組膜 如圖 其動力來源于羧基陰離子與金屬氧化物表面陽離子的成鹽過程 Allara和Nuzzo研究了直鏈脂肪酸在氧化鋁表面形成的自組膜 Pemberton等對上述化合物在氧化銀表面上的組裝結(jié)構做了考察 Tao等利用接觸角等方法比較詳細地考察了雙炔酸化合物的自組膜 飽和脂肪酸在某些金屬或其氧化物表面 酸 堿反應 形成表面鹽 RCO2 M 51 2 有機硅烷在羥基化表面的自組膜有機硅烷衍生物在羥基化的表面形成自組裝膜是基于有機硅烷與基底表面的羥基結(jié)合 如左圖 同時伴隨著橫向的Si O Si形式的交聯(lián) 從1980年Sagiv報道C18H37SiCl3 OTS 在玻璃片上形成自組膜以來 可供利用的基底包括二氧化硅 氧化鋁 石英 云母 氧化鍺和金等 另一種自組裝法是飽和烷基鏈直接鍵合于半導體硅表面 如右圖 飽和烷鏈直接鍵合于半導體硅表面 自由基反應 形成硅烷化臺物 有機硅衍生物在羥基化表面上 聚合反應 形成聚硅氧烷結(jié)構 52 相對來說 構造硅烷衍生物自組裝膜有一定難度 主要有三個方面的問題 一 溶液中水的含量 完全無水和含水過多均會引起自組膜的不完整性 二 自組裝膜形成時的溫度較難控制 三 基底的影響 從這個意義上來講 無論從實驗的重復性 還是膜的最終結(jié)構方面均不如羧酸自組裝膜或硫醇自組裝膜理想 53 3 有機硫化物在金屬表面 半導體表面的自組裝膜 下節(jié)詳細介紹 硫化物在金屬表面或半導體表面形成的自組裝膜是目前研究得最廣泛 最深入的一類 如圖 除硫醇類外還有硫醚 雙硫化合物 苯硫酚 巰基吡啶 原磺酸鹽等可在金屬表面形成自組膜 適合于含硫化合物形成自組膜的基底材料除單晶或多晶的金以外 還包括銀 銅 鉑 汞 鐵以及膠體金微粒等 有機硫化物在金屬或半導體表面上 以金為典型 軟 硬酸堿反應 形成硫醇鹽 RS M 54 一般認為硫醇分子在金表面的結(jié)合是S H鍵斷裂并伴隨著氫分子的生成 R S H Aun0R S Aun0 1 2H2在完全無氧的氣相條件下同樣形成分子自組裝單層膜 是以上機理的證據(jù)之一 最近以來 人們用多種方法對RS 的生成機理進行了證明 對于Au S鍵的鍵合強度 一般推測為40kcal mol 用電化學方法求得上述過程的反應熱為 5 5kcal mol 和理論預測值比較接近 5kcal mol 分別取RS H H2 RS Au的鍵能為87 104和40kcal mol 55 設計合成末端帶有功能基團的硫醇分子 在表面研究中占有重要位置 烷基鏈末端導入的功能團有 CH3 CF3 CH CH2 C CH X CN OH OCH3 NH2 N CH3 2 SO3H S OCH3 3 COOH COOCH3 COONH2等 另一方面 將特殊活性基團引入自組裝膜中進行考察 例如含電活性基團的自組裝膜被廣泛用于電子傳遞的動力學研究 56 4 其他類型的自組膜硅表面的烷烴分子自組單層膜是在硅表面通過C Si化學鍵合而形成的 Linford和chidsey利用RC O O O O CR與硅表面 H Si 111 或H Si 100 的多步自由基反應 獲得較為致密的自組膜 Si R與Si O O CR的形成增加了成膜性 但是在熱水中浸泡 表面分子濃度則有較大的下降 可能是Si O O CR被還原脫落所致 用烯烴和 RC O O 2的混合物進行反應也可以得到致密有序的分子單層膜 其覆蓋度只有90 左右 表明仍然有較多的缺陷 同時橢圓偏振與紅外的數(shù)據(jù)也證明 亞甲基鏈與垂直方向的夾角接近45 分子軸向的偏轉(zhuǎn)角為53 可以認為是由于分子間距較大 0 665nm 而造成 57 5 分子自組單層膜表面的進一步功能化由于許多化合物可以和自組膜表面的尾基反應且不影響自組膜本身的結(jié)構 而尾基的反應主要受膜的空間效應及靜電作用影響 因此自組膜上可以進一步連接更多樣的功能分子從而有目的地裁剪表面的組成及特性 擴展了自組膜的研究和應用范圍 自組膜表面上的酯基可以在親核試劑作用下發(fā)生水解 轉(zhuǎn)化為羧基或羥基 構成自組膜的分子間可以發(fā)生聚合反應 聚合后的自組裝膜會增加膜的穩(wěn)定性 減小受熱脫附 并能抑制自組膜與溶液中硫醇的交換反應 自組裝膜的聚合包括末端乙烯基團的交聯(lián) 末端吡咯基團的電聚合等 58 通過配對鍵合反應也可以在自組裝膜表面共價連接新功能化合物 最常用的共價轉(zhuǎn)化反應是在配對試劑碳化二亞胺 EDC DCC等 作用下 形成酰胺和酯基 大多數(shù)蛋白質(zhì) 酶 或其他生物分子都是通過其暴露的 NH2基或 COOH基與自組膜表面末端 COOH基或 NH2基發(fā)生配對反應而鍵合到電極表面或戊二醛作用下發(fā)生胺基縮合反應被固定 利用生物分子的特異性相互作用也可以較穩(wěn)定地鍵合 如生物素 親合素間的識別反應 NADH與其對應的酶分子間的重組 自組膜上的DNA單鏈與其互補鏈之間的雜交反應等 59 2 自組單層膜的表征SAMs所具有的有序 密集和穩(wěn)定等特點 有利于用近代物理和化學技術進行表征 有關研究多集中在金表面 以硫醇類SAMs體系為代表 物理法包括接觸角 橢圓偏振 X射線光電子能譜 XPS 石英晶體微天平 QCM 紅外光譜 表面增強拉曼 SERS 掃描隧道顯微鏡 STM 原子力顯微鏡 AFM 熒光光譜 表面等離子體共振 SPR 等方法 化學法中主要是電化學的循環(huán)伏安 CV 法和交流阻抗 EIS 法 特別便于檢測SAMs的品質(zhì) 還能給出膜中缺陷的分布 膜的形成機理和過程動力學 基團的氧化還原行為 以及電子轉(zhuǎn)移速率與距離關系等 60 4 4 3金表面的硫醇自組裝單分子膜及生物分子固定 自組裝 SAM 技術是一種應用較晚但發(fā)展非常迅速的技術 應用它可以在電極表面獲得致密有序的單分子層 而且分子另一端可以帶上不同的活性功能團 因而可適應不同的修飾電極的要求 硫醇分子在金表面的自組膜是最有代表性和研究最多的類型SAMs體系 61 4 4 3 1為什么傳感器基底一般選擇金 主要基于以下三個原因 1 金是一種相當惰性的金屬 不易被氧化 并且具有抗大氣污染的優(yōu)點 2 在存在有其他許多功能團的情況下 金與硫之間具有強烈的作用 鍵能184kJ mol 很少有其他基團與之競爭 保證了這種吸附的選擇性 而形成單分子膜的能力 從而提高了自組裝的選擇性 減少了膜的雜質(zhì) 3 巰基分子在金表面能夠形成非常緊密排列的晶態(tài)或液晶態(tài)單分子膜 由于巰基與金的結(jié)合非常牢固 所以在生物傳感器的研究中 金電極表面上硫醇分子的SAM應用最多 62 在金電極上 硫醇分子與Au 表面形成六方晶格 相鄰硫原子間距為0 497nm 烷基鏈間的平均距離為5 0埃 單個硫醇分子所占面積為0 214nm2 通過電子衍射 原子力顯微鏡表征進一步證實該高度有序排列結(jié)構 烷基鏈并不完全垂直于金表面 而有一定的傾斜角 30 即烷基鏈與金表面法線的夾角 在高度有序的自組膜中 硫醇的頭基影響自組膜的傾斜角 末端基團的取向還與硫醇頭尾基之間亞甲基數(shù)有關 奇偶 效應 當自組膜修飾電極放置于溶液中 膜的外部有序性會稍稍降低 其降低程度跟膜的末端基團與溶液的作用情況有關 63 4 4 3 2為什么自組裝分子常選擇硫醇 常用的SAM成膜物質(zhì)主要有 二硫化合物 R SS R 硫化物 R S R 以及巰基化合物 R SH 其中巰基化合物應用最為廣泛 其在金電極上自組裝的經(jīng)典反應為 烷基硫醇在金表面的自組裝具有如下特性 1 成膜速率越低 膜的有序性越好 2 在溶液中 烷基硫醇不易聚合 成膜的條件容易控制 3 選擇性愈高 吸附的雜質(zhì)愈少 4 在超高真空條件下 采用蒸發(fā)鍍膜的方法可以制備具有原子級平整度的基片 64 烷基硫醇在自組裝單分子膜的研究中扮演了重要角色 在大多數(shù)情況下起著不可替代的作用 正是烷基硫醇使得自組裝單分子膜的研究內(nèi)容豐富多彩 烷基硫醇和烷基二硫醇具有顯著的特征 例如HS CH2 nX X SH OH COOH NH2等 分子含有兩個活性基團 此外分子鏈可以含有烯雙鍵 CH CH 炔三鍵 C C 偶氮 N N 基 共軛烯鍵 CH CH CH CH 共軛炔鍵 C C C C 和其他特殊功能團 在分子自組裝時 單分子膜形成后分子鏈的活性尾基X可以繼續(xù)與其他物質(zhì)反應 所以烷基硫醇起到的作用相當于 多功能橋 MFB 如果分子鏈含有不飽和功能團如 C C CH CH C C C C CH CH CH CH 單分子膜還可以聚合成網(wǎng)狀聚合物 65 4 4 3 3金表面自組裝硫醇分子的步驟及影響因素 金表面的自組裝單分子膜的制備方法一般是 1 在進行自組裝前必須進行預處理以除去金表面的有機物和雜質(zhì) 其預處理方法為 先用1 2M的NaOH溶液浸泡10分鐘 再用1 2M的HCl溶液浸泡10分鐘 然后用三蒸水清洗幾次并晾干 2 迅速置于一定濃度的硫醇乙醇溶液中浸泡一段時間 3 取出電極并用三蒸水沖洗干凈 這樣 金電極表面即可修飾上一層表面帶特定功能基團的單分子層固相膜 其中浸泡時間長短的選擇對自組裝膜的好壞 是否均勻 致密 非常關鍵 這主要與硫醇的性質(zhì)以及濃度有關 為了得到致密的分子單層膜 可采取適當?shù)?退火 處理 如將自組膜電極插入熱的修飾液中 或經(jīng)循環(huán)伏安掃描 或在修飾液中反復浸泡等以獲得致密穩(wěn)定的分子單層膜 66 其他金屬電極上自組膜的沉積也可以在一定的電位控制下進行 以確保金屬處于還原態(tài) 但在堿性溶液中過負的電位下 自組膜會脫附 利用此特性可以在硫醇的堿性溶液中從脫附電位處正向慢慢掃描而形成自組膜 如果硫醇容易揮發(fā) 也可以在蒸氣相中進行自組裝 這樣得到的自組膜與溶液中吸附所得的自組膜沒有大的差別 67 自組裝單層膜法雖然在檢測的靈敏性和可重復性方面有很大提高 稀溶液中硫醇可以在1h內(nèi)組裝形成單層自組膜 組裝時間與硫醇的烷基鏈鏈長有關 一般濃度高則所需的時間短 通常自組裝膜可以覆蓋整個金表面 但針孔或缺陷會導致硫醇殘基的氧化使金 硫鍵氧化斷裂 成膜分子倒伏或脫落 影響生物分子固定的效果 并且針孔對于電導 電容等電化學檢測所造成的誤差是十分可觀的 取代的烷基硫醇形成的自組膜有較高的有序性和取向度 對于尾基相對較小的基團如 NH2 OH 則自組膜的取向度不會受到影響 但對于較大的尾基如 COOH 則會降低自組膜堆積的密度 降低尾基的有序性 此時可以與短鏈硫醇以一定摩爾比混合自組裝 形成混合自組膜 68 影響分子自組裝和單分子膜的品質(zhì)的因素較多 主要因素包括基片表面物質(zhì)和表面的粗糙度 活性分子反應基團的活性和空間位阻 分子鏈的大小和極性 溶質(zhì)的極性和溶液的濃度等 自組裝的速率受到多種因素的影響 有溫度 溶劑 溶液濃度 吸附分子的鏈長和基片物質(zhì)的清潔程度等 這些因素是相對容易控制的 有的因素如界面反應的速率和單分子層吸附的可逆性是由系統(tǒng)本身決定的 69 4 4 3 4生物識別分子的固定 生物識別分子主要通過兩種途徑在自組裝膜上進行固定 1 選擇帶合適功能團 如 NH2 COOH OH等 的硫醇先進行自組裝 然后再通過活性功能基團來固定生物識別分子 2 先將生物識別分子標記上巰基 SH 基團 然后直接通過自組裝來達到固定生物識別分子的目的 現(xiàn)一般采用前一種方法 因為這種方法在傳感器的制作上比較簡單 而后一種方法需要許多化學合成方面的知識 而且可能對生物識別分子的活性有影響 所以我們主要介紹第一種方法 70 自組膜的活潑性尾基 功能基團 如 COOH NH2 OH等在與生物識別分子固定 偶聯(lián) 前一般需要先進行活化活化有兩個目的 加速和提高自組裝膜上的尾基與生物識別分子的固定速度和固定量 由于目前用于生物分子固定的多為一些小分子硫醇 而這些自組裝膜具有較強的剛性 生物相容性較差 不利于生物傳感器靈敏度的提高 71 尾基 COOH通常用碳二亞胺 EDC CMC N N 羰基二咪唑 CDI 對硝基酚 磺酰氯等活化 EDC與NHS N 羥基琥珀酰亞胺 聯(lián)合使用能提高生物識別分子的固定效率 使氨基和羧基之間的縮合反應變得更容易 因為它把羧基轉(zhuǎn)化為一種更具有反應活性的中間體 尾基 NH2可以用戊二醛 TST 三氯 S 三嗪 等活化 形成的活潑酯或酰氯等活潑化合物與生物分子中的氨基反應生成酰