中藥第二章鑒別

第二章 中藥制劑的鑒別,中藥制劑的鑒別,利用制劑的處方組成、性狀特征、顯微特征、所含成分的理化性質(zhì)、色譜和光譜特性以及相應(yīng)的物理常數(shù)，確定制劑真實(shí)性的方法，包括性狀鑒別、顯微鑒別和理化鑒別三大類。,特點(diǎn),2、藥物鑒別為已知藥物的確證試驗(yàn),1、藥物鑒別是藥物分析的首項(xiàng)任務(wù),3、鑒別試驗(yàn)是個別分析,4、化學(xué)鑒別試驗(yàn)要有明顯的現(xiàn)象,5、藥物鑒別的方法要求專屬性強(qiáng)、靈敏度高、再現(xiàn)性好、以及操作簡便、快速等特點(diǎn)。,6、制劑鑒別要考慮干擾成分的影響,第一節(jié) 性狀鑒別,性狀：通常是藥品的形狀、狀態(tài)、劑型、外觀色澤、氣味、口味、溶解性、熔點(diǎn)等的總稱。,制備工藝,1形狀或形態(tài) 當(dāng)制劑的形狀或形態(tài)發(fā)生改變時，可能與變質(zhì)、摻雜等有關(guān)。2色 澤 系指制劑在日光下呈現(xiàn)的顏色及光澤度。常與制劑的品種、原料、所含成分、生產(chǎn)工藝、貯藏時間等有關(guān)，一般較為固定，為中藥制劑質(zhì)量的重要標(biāo)志。3氣、味 口嘗制劑時，要取少量有代表性的樣品，咀嚼至少1分鐘，使舌的各部位都充分與藥液接觸，以便能準(zhǔn)確地嘗到藥味。,注意事項(xiàng)：,制劑的性狀指成品的顏色、形態(tài)、氣味等；有包衣的丸劑、片劑應(yīng)描述除去包衣后的片心、丸心的顏色及氣味； 硬膠囊應(yīng)寫明除去膠囊后內(nèi)容物的性狀；制劑色澤有兩種色調(diào)組合，描寫時以后者為主，如棕紅色。,對不同劑型的中藥制劑常采用不同的性狀描述方法,附子理中丸（蜜丸）：本品為棕褐色至棕黑色的水蜜丸，或?yàn)樽睾稚磷睾谏拇竺弁?；除去包衣后顯棕褐色；氣微，味微甜而辛辣,相對密度：八角茴香油相對密度在25時0.9750.988。 折光率：丁香羅勒油折光率為1.5301.540。 旋光度：八角茴香油旋光度為-2 +1。 凝點(diǎn)：八角茴香油凝點(diǎn)不低于15。 熔點(diǎn)：薄荷腦熔點(diǎn)為4244。 餾程：松節(jié)油 在154165餾出的數(shù)量不得少于90.0%（ml/ml）。,二、物理常數(shù)測定,旋光度,1、偏振光：僅在一個平面上振動的光。,2、旋光性：光學(xué)活性物質(zhì)使偏振光偏振面 發(fā)生旋轉(zhuǎn)的性質(zhì)。,右旋體：偏振面右旋(+)左旋體：偏振面左旋(-),3、旋光度() ：偏振光振動平面旋轉(zhuǎn)的角度,通過旋光儀測定，不是物理常數(shù),4、比旋度,當(dāng)旋光性物質(zhì)的濃度為1gml，液層厚度為ldm時所測得的旋光度。,l液層厚度或旋光管長度，dm c溶液濃度，gml,鈉光譜D線（589.3nm）,固體供試品,旋光管 標(biāo)準(zhǔn)石英旋光管,旋光計(jì)的檢定，中國藥典（2010年版）規(guī)定用 A. 葡萄糖作基準(zhǔn)物 B. 水楊醛作基準(zhǔn)物 C. 半乳糖作基準(zhǔn)物 D. 水合氯醛作基準(zhǔn)物 E. 標(biāo)準(zhǔn)石英旋光管,1. 鑒別,2. 在雜質(zhì)檢查中的應(yīng)用 如硫酸阿托品中莨菪堿的檢查,3. 在含量測定中的應(yīng)用 如葡萄糖注射液的含量測定,【實(shí)例分析】谷氨酸鉀注射液（規(guī)格：20ml6.3g）的含量測定,精密量取本品15ml 2份，分別置50ml量瓶中，各加鹽酸10ml，用水稀釋到刻度，搖勻，依法測定旋光度，旋光管的長度為2dm，測得第一份樣品的3次旋光度平均值為4.84、第二份樣品的3次旋光度平均值為4.85，兩份樣品各次的旋光度的級差為0.02。測定前，以溶劑為空白，校正讀數(shù)為0.00；測定后，再次測定溶劑的旋光度， 仍為0.00。 求出谷氨酸鉀注射液標(biāo)示量的百分含量。已知谷氨酸的比旋度為31.532.5。,分析：本法中， 鹽酸的作用是將谷氨酸鉀轉(zhuǎn)變?yōu)楣劝彼帷?兩份樣品的旋光度值級差 0.02，測定前后空白讀數(shù)均為0.00，故測定結(jié)果有效。設(shè)供試品中谷氨酸鉀的濃度c（g/100ml）,測定某藥物的比旋度，配制的供試品溶液濃度為50.0mg/ml，樣品溶液寬2dm，測得旋光度為+3.25，則比旋度為 A. +6.50 B. +32.5 C. +60.0 D. +16.25 E. +325,測定鹽酸土霉素的比旋度時，若稱取供試品0.5050g，置50ml量瓶中，加鹽酸液（91000）稀釋至刻度，用2dm長的樣品管測定，要求比旋度為188 200。則測得的旋光度的范圍應(yīng)為 A、3.804.04 B、380404 C、1.902.02 D、190202 E、1.882.00,折光率,折射現(xiàn)象：光線通過兩種密度不同的透明介質(zhì)時，其速度和方向發(fā)生改變的現(xiàn)象。,i,r,空氣、供試液,折光率是入射角的正弦與折射角的正弦的比值,鈉光譜D線（589.3nm）,20,入射角,折射角,入射角i為90時，sin i=1,這時折射角達(dá)到最大值，稱為臨界角0（一定條件下為常數(shù)）， n=1/sin0,觀測系統(tǒng)和讀數(shù)系統(tǒng),目鏡中顏色的調(diào)節(jié),表示光線從棱鏡入射角達(dá)到了臨界角,1、鑒別和純度檢查2、含量測定,（1）折光率因素(F)法,標(biāo)準(zhǔn)溶液折光率,同溫度時水的折光率,樣品溶液每間隔1%濃度時折光率增加值,樣品%,方法：a.配制濃度已知標(biāo)準(zhǔn)溶液， b.求F(斜率),c.求C測,（2）標(biāo)準(zhǔn)曲線法 配制一系列的標(biāo)準(zhǔn)溶液，濃度在供試品近似濃度附近，測定一系列n， 做出標(biāo)準(zhǔn)曲線（n-C曲線）,未知溶液折光率,同溫度時水的折光率,物質(zhì)的折光率與下列因素有關(guān) A、光線的波長 B、被測物質(zhì)的溫度 C、光路的長短 D、被測物質(zhì)濃度 E、雜質(zhì)含量,20時水的折光率為 A、1.3305 B、1.3325 C、1.3330 D、1.517 E、1.7左右,一、含 義,利用顯微鏡對含藥材粉末的中藥制劑中特有的組織、細(xì)胞及細(xì)胞內(nèi)含物等特征進(jìn)行鑒別的方法。,第二節(jié) 顯微鑒別法,板藍(lán)根顆粒制法,取板藍(lán)根，加水煎煮，煎液濾過，濾液濃縮，加乙醇靜置使沉淀，取上清液，回收乙醇并濃縮至適量。加入適量的蔗糖和糊精，制成顆粒，干燥即得。,顯微鑒別的目的,檢查制劑中 是否有缺少或代用的藥材 對藥品的真實(shí)性進(jìn)行鑒別。,二、程序,處方分析 供試品預(yù)處理 顯微制片 顯微觀察 顯微測量 顯微化學(xué)反應(yīng) 結(jié)果判斷,（一）處方分析,組成較少：全檢-如左金丸（黃連、吳茱萸）組成較多：主藥、貴重藥、毒性藥、混亂品種 -如人參健脾丸：由11味藥材組成 藥典規(guī)定需檢出：人參主藥 砂仁貴重藥 山藥混亂品種,1. 選擇鑒別藥味,2. 選擇專屬性鑒別特征選取該藥材在本制劑中易察見、專屬性強(qiáng)的顯微特征12個排除類似的或因加工而消失的特征,（一）處方分析,人參粉末圖,戊己丸：3 -白芍草酸鈣簇晶 六味地黃丸：6 -牡丹皮草酸鈣簇晶 歸芍地黃丸：8 -白芍糊化淀粉粒團(tuán)塊 -牡丹皮木栓細(xì)胞,（一）處方分析,若制劑的顯微鑒別特征在國家藥品標(biāo)準(zhǔn)中有記載，則可省去該分析過程，直接依法鑒別。中國藥典2005年版：290/564,（二）供試品預(yù)處理,散劑、膠囊劑：直接取粉末制片。片劑：取23片研細(xì)，混勻，粉末制片。,水丸、糊丸、水蜜丸： 取數(shù)丸，置乳缽中研細(xì)，混勻，再取適量 粉末裝片。,（三）顯微制片,粉末制片法： - 冷裝片 -水合氯醛加熱 透化裝片解離組織制片法：觀察單個細(xì)胞,粉末冷裝片：解剖針挑取粉末少許，置載玻片中央偏右處，滴加適量透明劑1-2滴，攪勻，放置蓋玻片水合氯醛試液透化裝片：挑取粉末少許，置載玻片中央偏右處，滴加水合氯醛1-2滴，攪勻，用試管夾夾持載玻片一端，保持水平置酒精燈火焰上方約1-2cm加熱，微沸后，離開火焰，再滴加水合氯醛試液，小火繼續(xù)加熱，如此反復(fù)操作至透化清晰。避免水合氯醛結(jié)晶析出，放冷后滴加稀甘油1-2滴，封片鏡檢。,解離組織制片法,纖維素細(xì)胞壁的細(xì)胞間質(zhì)主要有果膠纖維構(gòu)成，可因與氫氧化鉀或氫氧化鈉等堿液共熱而分解破壞；木化細(xì)胞的細(xì)胞間質(zhì)常因含有木質(zhì)素而不被堿液破壞，可用氧化劑破壞木質(zhì)素，是細(xì)胞分離。氫氧化鉀法-薄壁組織發(fā)達(dá)，木化組織較少或分散存在的供試品。硝鉻酸法，氯酸鉀法-木化組織較多或集成較大群束的供試品。,（四）顯微觀察,2-5個標(biāo)本 對照觀察 “之”字移動,（五）顯微測量,用目微尺，在顯微鏡下測量細(xì)胞及細(xì)胞內(nèi)含物等的大小。,目鏡測微尺,直徑1820mm的圓形玻璃片（ 50格或100格）,臺微尺（標(biāo)定目微尺）,通常將長1mm（或2mm）精確等分成100（或200）小格，每1小格長為10m,標(biāo)定目微尺,測量方法,需測量的目的物顯微制片置顯微鏡載物臺上，用目鏡測微尺側(cè)量目的物的小格數(shù)，乘以上述每一小格的微米數(shù)。,（六）顯微化學(xué)鑒別,（七）結(jié)果判斷,藥品檢驗(yàn)報告書,結(jié)論：本品按檢驗(yàn)上述項(xiàng)目，結(jié)果符合規(guī)定。,三、實(shí)例-牛黃解毒片的顯微鑒別,制法： -雄黃、大黃、牛黃、冰片成粉； -黃芩等四味加水煎煮，濾液濃縮成膏； -混勻，壓制成片或包衣，即得。,處方： 雄黃 大黃 牛黃 冰片; 黃芩 石膏 桔梗 甘草,分析結(jié)果：檢-大黃 雄黃（中國藥典）,-牛黃解毒片的顯微鑒別,-牛黃解毒片的顯微鑒別,取樣：取23片，去包衣，乳缽中研細(xì)， 或用刀片從藥片斷面刮取少量粉末。制片：按粉末制片法裝片觀察：置顯微鏡下觀察，應(yīng)有以下特征 -草酸鈣簇晶大，直徑60140m（檢大黃） -不規(guī)則碎塊金黃色或橙黃色，有光澤（檢雄黃）,-牛黃解毒片的顯微鑒別,結(jié)論：本品按中國藥典2005版一部檢驗(yàn)上述項(xiàng)目，結(jié)果符合規(guī)定。,四、注意事項(xiàng),為提高準(zhǔn)確性，可與對照藥材或已經(jīng)鑒定的藥材對照觀察。 藥渣投料或投料量不足等，需配合理化鑒別、含量測定等方法進(jìn)行檢驗(yàn)。,思考,某企業(yè)生產(chǎn)左金丸（黃連、吳茱萸）時，黃連用鹽酸小檗堿或用提取過鹽酸小檗堿的藥渣投料，請?jiān)O(shè)計(jì)檢驗(yàn)方案，揭露這兩種違規(guī)行為。,第三節(jié) 理化鑒別,利用制劑所含化學(xué)成分的理化性質(zhì)，通過化學(xué)反應(yīng)法、光譜法和色譜法等分析方法和技術(shù)檢測有關(guān)成分是否存在，從而判斷制劑的真?zhèn)巍?以制劑藥味中的指標(biāo)性成分（主要為有效成分或特征性成分）為檢測對象，故可以更加客觀深刻地評價藥品的真實(shí)性。對于液體制劑或其它不含原料藥粉的制劑，理化鑒別則顯得為重要。,特點(diǎn),方法,化學(xué)反應(yīng)法微量升華法熒光鑒別法薄層色譜法(今后中藥制劑鑒別的發(fā)展方向)分光光度法氣相色譜法和高效液相色譜法,一、化學(xué)反應(yīng)鑒別法,（一）原理（二）特點(diǎn)1.操作簡便，適用性較強(qiáng)。2.其否定功能往往強(qiáng)于肯定功能,專屬性較差。3.易發(fā)生假陽性或假陰性反應(yīng),處方分析，首選主藥、輔藥、貴重藥和毒性藥作為鑒別重點(diǎn)。 對樣品進(jìn)行預(yù)處理，除去干擾性成分，富集被檢成分。選用專屬性較強(qiáng)的檢測試劑。 必要時做陽性或陰性對照試驗(yàn)加以驗(yàn)證，保證其專屬性和靈敏度。,應(yīng)用注意,大山楂丸 P67,【 成 份 】 山楂、六神曲(麩炒)、麥芽(炒)。【 制 法 】以上三味，粉碎成細(xì)粉，過篩，混勻；另取蔗糖600g，加水270ml與煉蜜600g，混合，煉至相對密度約為1.38（70C）時，濾過，與上述粉末混勻，制成大蜜丸，記得 。,（三）常用的一般化學(xué)反應(yīng),1. 生物堿 （1）碘化鉍鉀反應(yīng) 產(chǎn)生紅棕色沉淀 （2）碘化汞鉀反應(yīng) 產(chǎn)生類白色沉淀 （3）硅鎢酸反應(yīng) 產(chǎn)生白色沉淀 （4）苦味酸反應(yīng) 產(chǎn)生黃色結(jié)晶性沉淀 需在酸性條件下進(jìn)行。 注意事先排除其它成分的干擾。 少數(shù)生物堿不與上述通用沉淀試劑反應(yīng)。,2. 黃酮類化合物 最多使用的檢識反應(yīng)為鹽酸鎂粉反應(yīng)，呈紫紅色。大山楂丸（山楂）、抗骨增生丸（淫羊藿）、參茸保胎丸（黃芩）等。此外，黃芩提取物采用二氯氧鋯-鹽酸顯色反應(yīng)（黃色）進(jìn)行檢識。 3. 蒽醌類化合物 主要應(yīng)用堿液反應(yīng)（Borntrager反應(yīng)），陽性反應(yīng)呈紅色，加酸紅色褪去呈黃色。例如大黃流浸膏（大黃）、天麻首烏片（何首烏）。,4. 皂苷, 泡沫反應(yīng) 甾體堿管多，三萜酸管多或等 醋酐濃硫酸反應(yīng) 甾體皂苷呈現(xiàn)污綠色，三萜皂苷呈現(xiàn)紅、紅紫色。 三氯化銻或五氯化銻反應(yīng) 氯仿液呈紫蘭色。 氯仿濃硫酸反應(yīng) 氯仿層出現(xiàn)紅色或蘭色，硫酸層出現(xiàn)綠色熒光。 地奧心血康膠囊（黃山藥和穿山龍薯蕷的提取物）、養(yǎng)心定悸膏（甘草、紅參、麥冬）。,5. 香豆素、內(nèi)酯類和酚類, 氯亞氨基-2，6-二氯醌反應(yīng)（Gibbs反應(yīng)），呈現(xiàn)藍(lán)色。 異羥肟酸鐵反應(yīng) 呈紅色。應(yīng)用品種有：養(yǎng)陰清肺膏（牡丹皮）、前列舒丸（牡丹皮）等。 6. 揮發(fā)性成分 主要使用香草醛濃硫酸反應(yīng)檢識此類成分，正反應(yīng)呈紅、紅紫色。 應(yīng)用品種主要有：萬應(yīng)錠（冰片）、牛黃解毒片（冰片）、養(yǎng)心定悸膏（桂枝、生姜）等。,7. 礦物藥,1）朱砂（主含HgS） 銅片反應(yīng)。 HgS+2HCl+CuCuCl2+Hg（白 ）+H2S2）石膏、牡蠣、海螵蛸等（鈣鹽）草酸銨反應(yīng) CaSO4+(NH4)2C2O4CaC2O4（白）+(NH4)2SO4 CaC2O4溶于鹽酸，難溶于醋酸。 CaC2O4+2HClCaCl2+H2C2O4,3）雄黃（主含As2S2） A. 氯化鋇沉淀法（檢出硫） As2S2+KClO3 +4HNO3 2K3AsO3+H2SO4+Cl2+4NO H2SO4+BaCl2 BaSO4（白） B. 硫化氫反應(yīng)（檢出砷） 2As2S2+7O2 2As2O3+4SO2 As2O3+3H2O 2H3AsO3 2H3AsO3+3H2S As2S3(黃)+6H2O As2S3在鹽酸中析出黃色沉淀，并溶于碳酸銨中 形成可溶性銨鹽。,o,8. 動物藥,常含有較多的蛋白質(zhì)或氨基酸、故常使用茚三酮反應(yīng)鑒別之，正反應(yīng)呈紅紫色。 例如：龜齡集（鹿茸、海馬等） 參茸保胎丸（阿膠、鹿茸等）,（四）操作方法 1.供試液的制備,1、水提取：室溫浸泡：檢驗(yàn)氨基酸、蛋白質(zhì)。 60熱水提?。簷z驗(yàn)糖皂苷、鞣質(zhì).2、乙醇、甲醇提?。簷z驗(yàn)黃酮、酚、有機(jī)酸、生物堿；3、乙醚提取：濾液檢驗(yàn)酯、內(nèi)酯、苷元； 藥渣揮去乙醚，甲醇回流提?。簷z驗(yàn)各種苷類。 4、以50%-70%乙醇回流提取：提取多數(shù)化學(xué)成分；5、升化法提?。荷A的成分，如游離蒽醌苷元等。6、水蒸氣蒸餾法提?。簱]發(fā)性成分。,2、操作方式 試管反應(yīng)：供試液適量置于試管中，加入試劑反應(yīng) 平板反應(yīng)-蒸發(fā)皿或坩堝：揮去溶劑，滴加試劑于殘留物進(jìn)行檢識3、注意事項(xiàng)試管振蕩背景加熱（五）檢驗(yàn)記錄與結(jié)果判斷,（六）應(yīng)用實(shí)例,1.試分析下述鑒別反應(yīng)檢查的是何種藥材？并寫出反應(yīng)原理。 取萬氏牛黃清心丸（處方組成：牛黃、朱砂、黃連、黃芩、梔子、郁金）3g，加水適量，研勻，反復(fù)洗去懸浮物，可得少量朱紅色沉淀，取出，加入鹽酸1ml及光潔銅片少量，加熱煮沸，銅片由黃色變?yōu)殂y白色。,2. 試分析下述鑒別反應(yīng)檢查的是何種藥材？并寫出反應(yīng)原理。取冰硼散（處方組成：冰片、硼砂、朱砂、玄明粉）0.5g，加水3ml，振搖，加鹽酸使成酸性后，濾過，取濾液加氯化鋇試液12滴，即生成白色沉淀，分離后，沉淀在鹽酸中不溶解。,玄明粉的主要成分為硫酸鈉,二、 升華鑒別法,(一)概述原理:本法是利用中藥制劑中所含的某些化學(xué)成分具有升華性，在一定溫度下獲得升華物，根據(jù)升華物的理化性質(zhì)進(jìn)行鑒別的方法。升華物的鑒別方法主要有： 利用顯微鏡觀察晶型； 可見光下觀察顏色； 紫外燈下觀察熒光； 加入合適的試液與其發(fā)生顯色反應(yīng)或熒光反應(yīng)。,微量升華法應(yīng)用于中藥材鑒別,1.茶葉 2.大黃 3.斑蝥 4.何首烏,UV,(二)操作方法（微量升華法、 坩堝法、蒸發(fā)皿法）,（三）注意事項(xiàng)1.升華時應(yīng)緩慢加熱2.樣品粉末用量一般約0.5g （四）應(yīng)用實(shí)例 大黃流浸膏中大黃的鑒別 取本品1ml，置瓷坩堝中，在水浴上蒸干后，坩堝上覆以載玻片，置石棉網(wǎng)上直火徐徐加熱，至載玻片上呈現(xiàn)升華物后，取下載玻片，放冷，置顯微鏡下觀察，有菱形針狀、羽狀和不規(guī)則晶體，滴加氫氧化鈉試液，結(jié)晶溶解，溶液顯紫紅色。,取本品1g，水蜜丸搗碎，小蜜丸或大蜜丸剪碎，平鋪于坩堝中，上蓋一長柄漏斗，徐徐加熱，至粉末微焦時停止加熱，放冷，取下漏斗， 用水5ml沖洗內(nèi)壁， 洗液置紫外光燈（365nm）下觀察， 顯淡藍(lán)綠色熒光。,天王補(bǔ)心丸的鑒別,課堂互動,冰片是從龍腦香的樹脂和揮發(fā)油中取得的結(jié)晶，是近乎純粹的右旋龍腦。中成藥中大多使用合成龍腦（外消旋體）。具有良好的升華性，微量升華法又簡單實(shí)用，是否可以認(rèn)為中成藥中的冰片都能用微量升華法鑒別呢？,消糜栓,取本品1粒，置具塞錐形瓶中，在90水浴中加熱，待栓劑完全融化，立即取出，趁熱加入醋酸乙酯50ml，充分振搖，放置至室溫，0以下放置20分鐘，取出，立即濾過，取續(xù)濾液2ml，作為供試品溶液。 另取冰片對照品，加醋酸乙酯制成每1ml含5mg的溶液，作為對照品溶液。 照薄層色譜法（中國藥典2000年版一部附錄 B）試驗(yàn)，吸取上述兩種溶液各2l，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以環(huán)己烷-醋酸乙酯（85:15）為展開劑，展開，取出，晾干，噴以5%香草醛硫酸溶液，在105加熱至斑點(diǎn)顯色清晰。供試品色譜中，在與對照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點(diǎn)。,聚氧乙烯單硬脂酸酯1748g 甘油22g,三、 熒光鑒別法,（一）概述原理：利用中藥制劑中所含的某些化學(xué)成分，在紫外光或可見光下能產(chǎn)生一定顏色熒光，或經(jīng)試劑處理后能產(chǎn)生熒光的性質(zhì)進(jìn)行鑒別的方法。特點(diǎn)： 簡便、靈敏，具有一定的專屬性。例如大黃和土大黃 ，前者顯棕色至棕紅色熒光，而后者顯亮藍(lán)色熒光，很容易區(qū)分。,熒光,常溫下，處于基態(tài)的分子吸收一定的紫外可見光的輻射能成為激發(fā)態(tài)分子，激發(fā)態(tài)分子通過無輻射躍遷至第一激發(fā)態(tài)的最低振動能級，再以輻射躍遷的形式回到基態(tài)，發(fā)出比吸收光波長長的光而產(chǎn)生熒光。,（三）操作方法 通常取中成藥的提取液點(diǎn)加于濾紙上或加入蒸發(fā)皿中，置紫外光燈（365nm）下約10cm處觀察所產(chǎn)生的熒光。必要時可在供試品上加酸、堿或其它試劑，再觀察熒光及其變化。,硫色素反應(yīng),下列升華性成分分別存在于哪些藥材中A.蒽醌類B.牡丹酚C.苯甲酸D.斑蝥素E香夾酸與桂皮酸1決明子2斑蝥3安息香4牡丹皮5大黃6何首烏7 徐長卿,A.游離蒽醌衍生物B.苯甲酸和桂皮酸C.小檗堿D.桂皮醛E.莨菪堿1 藥材粉末微量升華,得梭針狀結(jié)晶,加堿液顯紅色,它檢查2 藥材粉末滴加95%乙醇和30%硝酸,鏡下產(chǎn)生針簇狀結(jié)晶。它檢查3 藥材粉末微量升華，得針狀，針簇狀和棒狀結(jié)晶，香氣濃。它檢查4 粉末的氯仿提取物加10%鹽酸苯肼，鏡檢可見桿狀結(jié)晶。它檢查5 粉末的氨性乙醚提取物加KII2試液，鏡下呈黃紫色，飛鳥狀結(jié)晶。它檢查,四、薄層色譜鑒別法Thin Layer Chromatography （TLC）,色譜過程是組分分子在流動相和固定相間多次“分配”的過程。,（一）概述,1、定義 基于相同物質(zhì)在同一的色譜條件下，表現(xiàn)出相同的色譜行為這一基本規(guī)律，將供試品和對照物同板、同法點(diǎn)樣、展開、干燥、顯色后，對比分析所得供試品與對照物的色譜圖，對藥品進(jìn)行定性鑒別。,2、特點(diǎn),(1) 簡便快速(數(shù)十秒數(shù)十分鐘)(2) 廣泛適用性(3)分離效率高(多柱路)用畢一次棄去，可直接用樣品的粗提物點(diǎn)樣(4) 色譜后衍生的靈活性、專屬性(5) 分析結(jié)果直觀性,系統(tǒng)適用性試驗(yàn)(05版藥典新增) 檢測靈敏度 主要用于限量檢查. 分離度 用于限量檢查和含量測定時，要求定量峰與相鄰峰之間有較好的分離度，除另有規(guī)定外，分離度R=2(d2-d1)/（W1+W2）應(yīng)大于1.0。 重復(fù)性 主要用于含量測定.即同一供試品溶液在同一塊薄層板上平行點(diǎn)樣的待測成分的峰面積測量值的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)應(yīng)不大于3.0%；需顯色后測量的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差應(yīng)不大于5.0%。,3.對照物（對照品、對照藥材、對照提取物（2010版16個）的設(shè)置方式 設(shè)置一種或數(shù)種對照品 設(shè)置一種或數(shù)種對照藥材 設(shè)置對照提取物 同時設(shè)置對照品和對照藥材(“雙對照”),提取方法：甲醇提取薄層板：硅膠G+0.5%NaOH展開劑： 甲苯-乙酸乙酯-甲酸（15:2:1）檢測波長：365nm,1 2 3 4 5 6,1 大黃素2 大黃素甲醚3-4 何首烏對照藥材5-6 首烏丸,首烏丸薄層色譜鑒別,TLC已廣泛用于中藥材及其制劑的檢驗(yàn)，成為中藥鑒別的重要方法和鮮明特色。 中國藥典大多數(shù)品種采用硅膠薄層色譜法，少數(shù)使用聚酰胺薄層色譜法和氧化鋁色譜法。 薄層色譜法還可用于藥品的雜質(zhì)檢查和含量測定。,4、供試液的制備,分散溶劑提取法（單一、分段）液液萃取法固液萃取法,一捻金中人參二醇和人參三醇的鑒別,左：稀酸水解后氯仿萃取，受大黃中成分的干擾， 無法辨認(rèn)人參二醇和人參三醇。右：氧化鋁小柱,（1）展開劑待測成分斑點(diǎn)Rf = 0.3-0.7,與相鄰成分分離度大于1單一溶劑極性順序,5、影響TLC的主要因素,選擇展開劑的方法三角形法,將要被分離的物質(zhì)的溶液間隔地點(diǎn)在薄層板上，用吸滿不同展開劑的毛細(xì)管點(diǎn)到不同樣品點(diǎn)的中心，借毛細(xì)管作用，展開溶劑從圓心向外擴(kuò)展，這樣就出現(xiàn)了不同的圓心色譜,選擇展開劑的方法微量圓環(huán)法,洗脫能力,流動相分子與組分分子競爭占據(jù)吸附劑表面活性中心的過程。流動性極性增加，占據(jù)吸附劑表面活性中心能力 ，洗脫力,強(qiáng),強(qiáng),復(fù)合溶劑系統(tǒng),占比例大（底劑）：極性相對小，溶解物質(zhì)和基本分離；占比例?。O性調(diào)節(jié)劑）：極性相對大，有較強(qiáng)洗脫力，但不能提高分辨率；適量中等極性的溶劑：有利于不相溶解的溶劑混合，并可降低展開劑的粘度，提高展開速度；展開劑中加入少量酸或堿（拖尾抑制劑）可抑制某些斑點(diǎn)的拖尾，利于弱酸、弱堿性物質(zhì)的分離。,提取方法：甲醇提取薄層板：硅膠G+0.5%NaOH展開劑： 甲苯-乙酸乙酯-甲酸（15:2:1）檢測波長：365nm,1 2 3 4 5 6,1 大黃素2 大黃素甲醚3-4 何首烏對照藥材5-6 首烏丸,首烏丸薄層色譜鑒別,萬氏牛黃清心丸中黃連的鑒別,黃連對照藥材50mg，加甲醇10ml，置水浴上加熱回流15分鐘，濾過，濾液蒸干，殘?jiān)蛹状?ml使溶解，作為對照藥材溶液。另取再取鹽酸小檗堿對照品，加甲醇制成每1ml含0.5mg的溶液，作為對照品溶液。,照薄層色譜法（附錄B）試驗(yàn)，吸取含量測定項(xiàng)下備用溶液及上述兩種溶液各2l，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以苯醋酸乙酯甲醇異丙醇濃氨試液（12:6:3:3:1）為展開劑，展開，取出，晾干，置紫外光燈（365nm)下檢視。供試品色譜中，在與對照藥材色譜和對照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同的黃色熒光斑點(diǎn)。,取該品3g，加乙醚15ml，研磨，棄去乙醚。殘?jiān)鼡]干乙醚，加醋酸乙酯30ml，加熱回流提取1小時，放冷，濾過，濾液蒸干，殘?jiān)蛹状?ml使溶解，濾過，濾液作為供試品溶液。另取梔子苷對照品，加甲醇制成每1ml含1mg的溶液，作為對照品溶液。照薄層色譜法（附錄B）試驗(yàn)，吸取上述兩種溶液各5l，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以醋酸乙酯丙酮甲酸水（10:7:2:0.5）為展開劑，展開，取出，晾干，噴以10%硫酸乙醇溶液，在105加熱約10分鐘。供試品色譜中，在與對照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點(diǎn)。,萬氏牛黃清心丸中梔子的鑒別,注意,多元展開劑能反復(fù)使用嗎？每次展開后，展開劑組分的比例由于揮發(fā)或被固定相選擇性地吸附必然會改變。展開劑可以一次配制很多，方便隨時取用嗎？應(yīng)在使用前新鮮配制，特別是含低沸點(diǎn)溶劑時尤為重要，以避免組分揮發(fā)而引起的比例變化。,（2）相對濕度,硅膠的硅醇基以氫鍵形式優(yōu)先吸附水，物理吸附使硅膠的活度降低，影響了弱極性物質(zhì)的吸附，濕度增大，化合物的Rf值相應(yīng)地 。在相對濕度50%-60%時，平衡后的硅膠含水量約13%，多數(shù)情況下，是適用的。,增大,厚樸中厚樸酚及和厚樸酚的鑒別,萬應(yīng)錠(左圖：濕度32，右圖：70),不同濕度對蒼術(shù)正己烷提取物薄層行為的影響,展開時的最佳相對濕度范圍決定于溶質(zhì)和溶劑的極性，隨溶質(zhì)和溶劑極性的增加相對濕度的范圍也相應(yīng)地增大。原因：展開室中展開劑蒸氣有取代吸附在薄層上水分子的趨勢。苯：適宜的相對濕度范圍很窄乙醚：相對濕度在20%-50% 氯仿-異丙醇-25%氨水（45:45:10）：相對濕度在20%-80%,解決辦法：,A.記錄相對濕度B.控制相對濕度a 硫酸溶液法b 無機(jī)鹽溶液法c 用另一塊玻璃板蓋在活化后的薄層上，只有原點(diǎn)區(qū)露出以便點(diǎn)樣。,（3）溫度,RH恒定的情況下，一般在較高溫度展開時，Rf值較高。一般來說溫度變化在5， Rf值變化一般不會超過0.02。溫度首先影響各有機(jī)溶劑的蒸發(fā)程度，影響了展開槽中各蒸氣比例，故影響到被分離物質(zhì)的層析行為。其次，溫度的變化影響了含水展開劑兩相的溶解度，改變了溶劑的比例。,三七總皂苷的薄層鑒別,常溫展開三七皂苷R1與人參皂苷分不開，低于10可以分開,補(bǔ)充：溶劑蒸氣,薄層色譜與柱色譜的區(qū)別之一就是溶劑的蒸氣相在展開箱中也參與色譜展開而形成三維的層析過程。展開箱的氣體空間在層析過程中起著重要的作用。,展開室飽和 是指展開前及展開中溶劑系統(tǒng)中所有組分在整個氣體空間達(dá)到平衡，即達(dá)到飽和狀態(tài)。預(yù)吸附 指薄層板的干燥板面（即未被溶劑濕潤的部分）對展開室空間氣體分子的吸附，即預(yù)飽和。吸附飽和 是指薄層板未被溶劑濕潤的部分與展開室的飽和氣體空間達(dá)到平衡狀態(tài)，即“完全飽和”，這是預(yù)吸附的極限狀態(tài)。毛細(xì)管飽和 指薄層板所有的自由空隙借毛細(xì)管作用被溶劑充滿的過程，即相當(dāng)于展開后薄層的狀態(tài)。,邊緣效應(yīng)(未飽和的展開室中展開 ),在展開過程中極性較弱和沸點(diǎn)較低的溶劑在薄層的邊緣較易揮發(fā)，因此邊緣部分的展開劑中極性溶劑的比例增大，Rf值相應(yīng)增大。,脫混(未飽和的展開室中展開 ),用兩種或多種極性相差很大的溶劑組成的展開劑時，由于吸附劑對不同極性溶劑產(chǎn)生不同的吸附作用，形成展開劑組分的濃度梯度，當(dāng)溶劑完全分離時，往往在薄層板上出現(xiàn)第二個溶劑前緣。,預(yù)吸附和吸附飽和,吸附劑表面的空間是很有限的，當(dāng)用多組分溶劑展開時，不同溶劑分子在吸附區(qū)相互競爭，如硅膠是親水性吸附劑，它首先對溶劑組分中的極性分子有更大的親和力，所以在吸附平衡過程中，被吸附的各組分的濃度比與氣體空間的很不相同，與溶劑的液相組成差別更大。因此在未飽和的情況下展開過程是很復(fù)雜的。,常規(guī)的平底展開箱在展開前較難達(dá)到展開箱飽和，所以普通的做法是在內(nèi)壁加貼與之等寬等高的用溶劑濕潤的濾紙有助于達(dá)到飽和。用雙槽展開箱在其一側(cè)槽中加溶劑可以較容易地達(dá)到吸附飽和及展開箱飽和。,人參及西洋參的薄層鑒別,操作者的熟練程度,不合格的手鋪?zhàn)灾瓢?新鮮溶劑與多次開瓶使用后的溶劑,（二）儀器與材料,1、薄層板：市售薄層板（亦稱預(yù)制薄層板）（1）硅膠：微酸性極性固定相，適用于酸性、中性物質(zhì)分離（可制備成酸性不同或堿性硅膠擴(kuò)大使用范圍）。（2）氧化鋁：堿性極性固定相，適用于堿性、中性物質(zhì)分離（可制備成中性或酸性氧化鋁擴(kuò)大使用范圍）。（3）纖維素：含有羥基的極性固定相，適用于分類親水性物質(zhì)。（4）聚酰胺：含有酰胺基極性固定相，適用于酚類、醇類化合物的分離。,自制薄層板 最常用的固定相有硅膠G、硅膠GF254、硅膠H、硅膠HF254等。其顆粒大小，一般要求直徑為1040m。薄層板采用濕法制備，即使用涂布器（鋪板器）將制好的固定相糊均勻涂布于玻板上。,傾注法,2.點(diǎn)樣器材（定量點(diǎn)樣）,定容毛細(xì)管（微升毛細(xì)管） 微量注射器 點(diǎn)樣器,3.展開容器,專用展開缸 水平式 直立式： 平底式 上行展開 雙槽式雙槽展開缸具有節(jié)省溶劑、便于預(yù)平衡、可控制展開箱內(nèi)的濕度等優(yōu)點(diǎn)。展開缸蓋子應(yīng)能密閉，體積應(yīng)與薄層板大小相適應(yīng)。,全自動點(diǎn)樣儀,手動點(diǎn)樣儀,微升毛細(xì)管,雙槽展開缸,4.顯色（檢視）裝置噴霧顯色應(yīng)使用玻璃噴霧瓶或?qū)Ｓ脟婌F器，要求用壓縮氣體使顯色劑呈均勻霧狀噴出；浸漬顯色可用專用玻璃器皿或適宜的展開缸做為浸漬槽；蒸氣熏蒸顯色可在雙槽展開缸或大小適宜的干燥器中進(jìn)行； 熒光檢視裝置為裝有可見光、254nm及365nm紫外光源和相應(yīng)濾光片的暗箱，可附加攝像設(shè)備供拍照圖像用，暗箱內(nèi)光源應(yīng)有足夠的光照度。,噴霧顯色,熒光顯色,（三）操作步驟1、薄層板制備 （1）市售薄層板 臨用前一般應(yīng)在110活化30分鐘。 （2）自制薄層板 1份固定相和3份水（或0.20.5羧甲基纖維素鈉水溶液），在110活化30分鐘，立即置干燥器中備用。薄層板一般要求新鮮制備，當(dāng)天使用。使用前應(yīng)在反射光及透射光下檢查質(zhì)量，若板面不均勻、不平整或有麻點(diǎn)、有氣泡、有破損及污染等情況，應(yīng)棄去不用。,2、供試品溶液、對照物的選擇及對照品溶液的制備,TLC分離能力有限，需對樣品進(jìn)行必要的提取、分離和凈化。按供試品溶液的制法，制備對照品溶液,萬應(yīng)錠（清熱，鎮(zhèn)驚，解毒 ）,供試液制備：取本品6 g,研碎,加甲醇20ml，置水浴上溫浸1小時，濾過，取濾液1Oml，蒸干，殘?jiān)?0%氫氧化鈉溶液5ml置水浴中加熱水解8小時，放冷，加水1Oml，用醋酸乙酯提取兩次，每次20ml水液加鹽酸調(diào)節(jié)至pH23，用乙醚提取2次，每次30ml，合并乙醚液，揮干，殘?jiān)蛹状既芙猓钩? ml，作為供試品溶液。對照液制備：取熊去氧膽酸，鵝去氧膽酸*，膽酸，去氧膽酸，豬去氧膽酸對照品，加甲醇制成每1ml各含lmg的溶液，作為對照品溶液。,薄 層 板：硅膠G自制板，長20cm；厚度：500um點(diǎn) 樣：供試品溶液與對照品溶液分別點(diǎn)樣24 ul展 開 劑：異辛烷一醋酸乙酯一冰醋酸(15：7：5)展 開方 式：展開箱用展開劑預(yù)平衡15分鐘，上行展開：展距：16一18cm顯 色：噴以硫酸乙醇溶液(1 -10）在110加熱數(shù)分鐘，至斑點(diǎn)顯色清晰。置紫外光燈(365nm)下檢視。色 譜識別：供試品色譜中，分別在與對照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的熒光斑點(diǎn)。注 意事 項(xiàng)：盡量在低溫及低相對濕度(40%以下)下展開。,1-3、萬應(yīng)錠 4、萬應(yīng)錠（水解后酸化前醋酸乙酯提取部分） 5、混合膽酸對照（膽酸（S1）+豬去氧膽酸（S2）+熊去氧膽酸（S3）+鵝去氧膽酸（S4）+去氧膽酸（S5） 6、熊去氧膽酸,本圖譜所用的展開劑容易脫混，而使色譜上部部分斑點(diǎn)擠壓，且產(chǎn)生第二溶劑前沿，但不影響鑒別。,2、點(diǎn)樣1.供試品溶液的制備 采用浸漬法、回流以及超聲等方法提取，液液萃取法或固液萃取法進(jìn)行精制。2.原點(diǎn)的點(diǎn)加（圓點(diǎn)狀或窄細(xì)的條帶狀）原點(diǎn)基線距板底邊1015mm，圓點(diǎn)狀原點(diǎn)直徑一般不大于3mm；條帶狀的寬度一般為510mm。原點(diǎn)間距離一般不少于8mm，毛細(xì)管接觸點(diǎn)樣時應(yīng)少量多次點(diǎn)加，才能保證原點(diǎn)小而圓。,自動點(diǎn)樣設(shè)備進(jìn)行帶狀點(diǎn)樣P77,樣品溶液體積大、濃度稀 使用時樣品溶液吸在微量注射器中，點(diǎn)樣器不接觸薄層，而是用氮?dú)鈱⒆⑸淦麽樇獾娜芤捍德湓诒由?，薄層板在針頭下定速移動點(diǎn)寬5-10mm的窄帶。帶狀點(diǎn)樣展開后的斑點(diǎn)不僅分辨率明顯高于點(diǎn)狀點(diǎn)樣，而且精密準(zhǔn)確，為定量分析提供最佳條件。,原點(diǎn)起始線,5mm,8mm,815cm,11.5cm,溶劑前沿,展開劑液面,原點(diǎn),（展開距離）,(點(diǎn)樣位置),3、展開 一般采用上行一次展開。必要時可進(jìn)行二次展開或雙向展開。 Eg：益氣養(yǎng)血口服液中陳皮的薄層鑒別即采用二次展開，先以乙酸乙酯甲醇水吡啶（10017135）展至3cm，取出晾干；再以甲苯乙酸乙酯甲醇水（201011上層）展至8cm，取出晾干。,雙向展開,在兩個垂直的方向上進(jìn)行展開。將樣品點(diǎn)在薄層板的一個角上，展開適當(dāng)距離后，揮干溶劑，再將薄層板以與原展開方向成90 的方向進(jìn)行展開。,展開前一般需用展開劑對展開缸進(jìn)行預(yù)平衡，即使缸內(nèi)展開劑氣液兩相達(dá)到動態(tài)平衡，該過程亦稱“飽和”。為此可在展開缸內(nèi)加入適量展開劑，密閉，保持1530分鐘。預(yù)平衡后，迅速將薄層板放入展開缸中，立即密閉，展開。若薄層板需同時預(yù)平衡，可將點(diǎn)樣后的薄層板放入雙槽展開缸的一側(cè)槽中，另一側(cè)槽中加入展開劑，如上法預(yù)平衡后，再將展開劑移入放有薄層板的槽中，展開。展開劑配制后若分層，則應(yīng)按要求放置分層后取需要的一相（上層或下層）使用。,4、顯色與檢視 1）有顏色的可在日光下檢視 2）無色或淺色的成分多用噴霧法或浸漬法以適宜的顯色劑顯色，或再加熱使之顯色，在日光下檢視。 3）有熒光的物質(zhì)或遇某些試劑可激發(fā)熒光的物質(zhì)可在紫外燈（365nm）下觀察熒光色譜。 4）有的成分可用試劑的蒸氣（如碘蒸氣、氨蒸氣）熏蒸顯色。 5）某些無色有紫外吸收且不產(chǎn)生熒光的成分可用熒光淬滅法顯色。,即在含有熒光劑的硅膠板（如硅膠GF254板），在紫外光燈（254nm）下觀察板面上該成分形成的熒光淬滅色譜。,如艾附暖宮丸中香附的鑒別，被檢成分香附酮在硅膠GF254板的黃綠色熒光背景下呈深藍(lán)色斑點(diǎn)。,5、記錄可采用攝像設(shè)備或掃描儀記錄相應(yīng)的色譜圖。6、結(jié)果判斷 供試品色譜在與對照品、對照藥材或?qū)φ仗崛∥锷V的相應(yīng)的位置上，顯相同顏色或熒光的斑點(diǎn)，則判為符合規(guī)定。,薄層色譜的掃描定性鑒別,展開后的薄層色譜，在適宜條件下，使用薄層掃描儀掃描。即以各斑點(diǎn)在薄層板上的位置為橫坐標(biāo)，以斑點(diǎn)對光的吸收強(qiáng)度或發(fā)射熒光的強(qiáng)度為縱坐標(biāo)，將各色斑轉(zhuǎn)換成峰形曲線圖譜。經(jīng)對照比較所得供試品、對照品、陽性對照或陰性對照等各溶液所得掃描圖譜中各峰的有無、相對位置和峰高，可以得到可供鑒別的信息和依據(jù)。,表 2010年版中國藥典新增中藥制劑鑒別項(xiàng)目情況,中國藥典(2005)新增中成藥(116種)鑒別方法,五、紫外-可見分光光度法,（一）概述 定義：某些中藥或中成藥經(jīng)適當(dāng)處理后，所得紫外吸收光譜是由其各組分的特征吸收疊加而成的。若將中藥制劑作為一個特定的整體，在一定測試條件