養(yǎng)肝柔肝中藥對膽囊膽固醇結(jié)石豚鼠膽囊細胞鈣離子濃度的影響.doc

養(yǎng)肝柔肝中藥對膽囊膽固醇結(jié)石豚鼠膽囊細胞鈣離子濃度的影響來源：中國論文下載中心 07-09-11 16:38:00 編輯：studa20 作者：沈平，方邦江，朱培庭，張靜，裴新軍 【摘要】 通過觀察實驗豚鼠膽囊細胞鈣離子濃度（Ca 2+i）的變化，探討膽固醇結(jié)石形成與養(yǎng)肝柔肝中藥防治膽結(jié)石的作用機制。方法:將80只受試豚鼠隨機分為正常對照組、模型組、養(yǎng)肝柔肝中藥組和熊去氧膽酸組，每組20只。后三組采用高膽固醇致石食餌誘發(fā)法建立豚鼠膽結(jié)石動物模型，其中養(yǎng)肝柔肝中藥組、熊去氧膽酸組分別給予相應(yīng)藥物進行防治實驗，連續(xù)用藥7周后，分別對實驗豚鼠大體情況、膽結(jié)石生成情況以及膽囊細胞Ca2+i的變化進行觀察。結(jié)果:模型組動物膽囊細胞Ca 2+i明顯降低，養(yǎng)肝柔肝中藥不僅能明顯改善豚鼠行為學體征，降低膽結(jié)石的成石率，而且可提高膽囊細胞Ca2+i。結(jié)論:膽囊細胞Ca2+i降低是導致膽囊的收縮功能降低，膽固醇結(jié)石形成的重要因素。提高膽囊細胞Ca2+i，增強膽囊平滑肌細胞的收縮功能，減輕膽汁淤滯，可能是養(yǎng)肝柔肝中藥防治膽石病的作用機制之一。 【關(guān)鍵詞】 膽固醇我國膽石病呈較快的上升趨勢，部分地區(qū)患病率已達10%1，接近世界發(fā)達國家膽石病10%15%的發(fā)病水平2。膽石病仍是我國良性膽道疾患中致死、致殘的重要原因。我們的前期研究工作表明，養(yǎng)肝柔肝中藥對膽石病具有一定的臨床療效3，4。本實驗以高膽固醇飲食誘發(fā)豚鼠膽結(jié)石，采用流式細胞術(shù)（flow cytometry， FCM）測定實驗豚鼠膽囊細胞鈣離子濃度Ca2+i，以探討?zhàn)B肝柔肝中藥防治膽囊結(jié)石形成的作用機制。1 材料與方法1.1 實驗動物 選用白色、紅目豚鼠，雌雄各半，清潔級，體質(zhì)量（22020）g，共80只，由上海中醫(yī)藥大學實驗動物中心提供。1.2 主要試劑、藥物與儀器1.2.1 實驗試劑和藥物 Fluo-3，AM熒光染料，美國Molecular Probes公司產(chǎn)品;養(yǎng)肝柔肝中藥采用養(yǎng)肝利膽顆粒（何首烏、枸杞子、白芍藥、陳皮、甘草），8 g/包，每克相當于含原藥材4.5 g，由上海中醫(yī)藥大學龍華醫(yī)院制劑室提供;熊去氧膽酸 （ursodeoxycholic acid， UDCA），上海三維長江生化制藥廠產(chǎn)品，批號為200304005，10 mg/片。1.2.2 主要儀器 Mgna FTIR-750型紅外光譜儀，美國Thermo Nicolet公司產(chǎn)品;LG-10低溫高速離心機，北京醫(yī)用離心機廠產(chǎn)品;Facscalibour流式細胞儀，美國Becton Dickinson公司產(chǎn)品。1.3 動物分組、造模及藥物處理 所有豚鼠飼養(yǎng)于上海中醫(yī)藥大學實驗動物中心動物室，室溫（2310），適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，無懷孕及不良反應(yīng)，飲食、飲水正常者，即納入實驗。實驗豚鼠隨機分為正常對照組、模型組、熊去氧膽酸組和養(yǎng)肝柔肝中藥組，每組各20只。采用高膽固醇致石食餌誘發(fā)法建立豚鼠膽囊膽固醇結(jié)石動物模型5，正常對照組喂正常飼料及青菜適量，模型組喂以致石飼料及少量青菜，各治療組在喂以相當于模型組的致石飼料及青菜的同時給以藥物灌胃。藥物以成人用藥劑量（ 60 kg 體質(zhì)量，養(yǎng)肝利膽顆粒18 g/d、UDCA 300 mg/d） 按體型系數(shù)換算6，養(yǎng)肝柔肝中藥組給以養(yǎng)肝利膽顆粒1.81 g/（kgd），熊去氧膽酸組給以UDCA 30.12 mg/（kgd），模型組和正常對照組豚鼠灌胃等容量的生理鹽水，連續(xù)7周。1.4 標本采集與處理1.4.1 標本采集 各組動物均于第7周末取材。 以15%烏拉坦腹腔注射麻醉，活體下肉眼觀察膽汁中成石情況，然后完整切除膽囊后，再仔細觀察膽囊內(nèi)成石情況，收集膽石。完整切除膽囊后冷凍保存標本。1.4.2 標本處理 取豚鼠膽囊修剪成米粒大小，用醫(yī)用剪刀剪碎，同時不斷用PBS沖洗，獲得細胞懸液后用40 m的尼龍網(wǎng)過濾，再用PBS沖洗兩遍， 1 500 r/min離心5 min，棄去上清液，調(diào)節(jié)細胞數(shù)至每管106個細胞，分別加入A、B管中，在A管中加入PBS，B管中加入Fluo-3熒光素，混勻后放在暗處，室溫下靜止45 min，PBS沖洗一遍上機待測。1.5 膽石紅外光譜定性 采用溴化鉀壓片法測定膽結(jié)石樣品。1.6 膽囊細胞Ca2+i的測定 參考文獻7，使用Facscalibour流式細胞儀檢測，利用CELL-Quelt功能軟件進行參數(shù)的獲取和數(shù)據(jù)分析。1.7 統(tǒng)計學方法 計量資料用 x s 表示，組間均數(shù)比較采用方差分析。計數(shù)資料采用率或構(gòu)成比表示，采用2檢驗方法。所有運算程序均在計算機上運用SPSS 11.0統(tǒng)計軟件包進行。2 結(jié)果2.1 豚鼠大體情況 正常對照組豚鼠表現(xiàn)為體質(zhì)量自然增加，反應(yīng)靈活，活動敏捷，被毛密集而有光澤、緊貼皮膚，鼻、唇濕潤清潔，眼睛明亮，大便正常，在飼養(yǎng)過程中無死亡。模型組動物表現(xiàn)飲食減少，生長緩慢，被毛干枯、蓬松且易脫落，活動遲緩，反應(yīng)遲鈍，眼睛、鼻、唇、耳、尾部色淡少澤。熊去氧膽酸組和養(yǎng)肝柔肝中藥組豚鼠行為學表現(xiàn)、體質(zhì)量和營養(yǎng)狀況等方面與模型組比較有明顯改善，但不能恢復到正常對照組水平。模型組豚鼠在造模30 d后有3只動物死亡，經(jīng)解剖膽囊發(fā)現(xiàn)有2只豚鼠膽囊發(fā)生結(jié)石。養(yǎng)肝柔肝中藥組、熊去氧膽酸組各有 2只 動物死亡，這兩組死亡豚鼠經(jīng)解剖膽囊均未發(fā)現(xiàn)明顯結(jié)石生成。由于上述三組共計7只豚鼠死時未達造模的時間要求，所以沒有計入成石率的結(jié)果，也未作為標本采集的來源。2.2 膽石定性 肉眼所見膽囊結(jié)石呈膽石泥砂或絮狀沉淀。經(jīng)紅外光譜檢測分析為膽固醇結(jié)石。2.3 豚鼠膽囊結(jié)石生成情況 以肉眼觀察可見膽囊內(nèi)有塊狀及絮狀沉淀物并經(jīng)紅外光譜鑒定為膽固醇結(jié)石。正常對照組中1只動物無膽囊而沒有計入成石率的統(tǒng)計，其余19只動物中有1只發(fā)生膽石，成石率為5.26%。模型組動物中除3只死亡外，其余17只動物中有14只出現(xiàn)膽石，成石率為 82.35% ，明顯高于正常對照組（ P 0.01）。養(yǎng)肝柔肝中藥組18只動物中有5只出現(xiàn)膽石，熊去氧膽酸組18只動物中有7只出現(xiàn)膽石，養(yǎng)肝柔肝中藥組和熊去氧膽酸組成石率分別為27.78%和38.89%，均明顯低于模型組膽石生成率（ P 0.05）。2.4 膽囊細胞Ca2+i測定結(jié)果 隨機抽取保存的豚鼠膽囊組織，上述4組每組各8份，測定各組膽囊細胞Ca2+i。正常對照組膽囊細胞Ca2+i為（82.7712.45）nmol/L，模型組為（18.52 11.97）nmol/L ，熊去氧膽酸組為（44.79 8.94）nmol/L ，養(yǎng)肝柔肝中藥組為（72.86 10.68）nmol/L 。結(jié)果顯示，模型組膽囊細胞Ca 2+i較正常對照組明顯降低（ P 0.01）;養(yǎng)肝柔肝中藥組和熊去氧膽酸組均可升高膽囊細胞Ca2+i，與模型組相比，差異均有統(tǒng)計學意義（ P 0.05 ），熊去氧膽酸組與正常對照組相比，差異有統(tǒng)計學意義（ P 0.01）;養(yǎng)肝柔肝中藥組與熊去氧膽酸組相比，差異有統(tǒng)計學意義（ P 0.01）。3 討論隨著人口的老齡化與飲食結(jié)構(gòu)的改變，我國膽結(jié)石的患病種類發(fā)生了很大的變化，尤其是近20年來，膽囊結(jié)石約占膽石病發(fā)病的80%8，以膽固醇為主要成分的膽囊結(jié)石已成為我國膽結(jié)石的主要類型1，9。因此，我們在本研究中選擇了高膽固醇致石食餌誘發(fā)法建立豚鼠膽固醇結(jié)石的動物模型。朱培庭教授3在總結(jié)我院著名中醫(yī)外科專家顧伯華教授和中西醫(yī)結(jié)合專家徐長生教授治療膽石病經(jīng)驗的基礎(chǔ)上，對274例慢性膽道感染、膽石病病人進行辨證分析發(fā)現(xiàn)，肝陰不足證型占66.66%，并且50歲以上年齡者高達72.37%，這與內(nèi)經(jīng)“年四十而陰氣自半也，起居衰矣”（素問陰陽應(yīng)象大論）的理論及朱丹溪“陽常有余，陰常不足”之論相吻合。對肝陰不足證型膽石病患者予驗方養(yǎng)肝利膽方藥治療顯示了良好的效果，有效率達84.13%3，4。養(yǎng)肝利膽顆粒劑由何首烏、枸杞子、白芍、陳皮、甘草等組成。方以何首烏、枸杞子、白芍滋養(yǎng)肝陰。其中何首烏補肝腎、益精血;枸杞子味甘平而潤，性滋而補，能生精益氣;白芍苦酸微寒，能養(yǎng)血斂陰，柔肝止痛;陳皮苦辛溫，能理氣健脾，且能防滋陰藥過于滋膩之弊?？v覽全方切合疏肝利膽的治療大法，體現(xiàn)了“膽病從肝論治”之學術(shù)思想。在平滑肌收縮與舒張的信號轉(zhuǎn)導機制中，細胞 內(nèi)游離鈣作為一種重要的第二信使廣泛地參與細胞的運動、分泌、代謝和分化等多種細胞功能活動的調(diào)節(jié)。Ca2+i的降低是平滑肌細胞舒張的關(guān)鍵因素之一，調(diào)節(jié)平滑肌收縮的主要蛋白有肌球蛋白輕鏈、原肌球蛋白和調(diào)鈣蛋白的結(jié)合蛋白等。平滑肌細胞中收縮相關(guān)蛋白參與平滑肌細胞收縮、收縮的調(diào)節(jié)及細胞骨架的構(gòu)成，這些蛋白的活性在一定程度上均受到Ca2+i的調(diào)節(jié)10，11。已有研究表明，膽囊平滑肌細胞Ca2+i的降低，是導致平滑肌收縮功能障礙的重要原因。本研究表明，模型組豚鼠膽囊細胞Ca2+i明顯降低，養(yǎng)肝柔肝中藥不僅能有效降低膽結(jié)石的生成，而且可明顯提高膽囊細胞Ca2+i。膽囊細胞Ca2+i通過與相關(guān)鈣結(jié)合蛋白結(jié)合，間接調(diào)節(jié)蛋白的磷酸化，對細胞外信號作出應(yīng)答，以增強膽囊平滑肌細胞的收縮，減輕膽汁淤滯，這可能是養(yǎng)肝柔肝中藥治療膽石病作用的重要機制之一?！緟⒖嘉墨I】 1Chen XG， Liu JQ， Peng MH， et al. Intrahepatic chole-lithiasis in Guangxi area， an analysis of 8 585 cases. Zhonghua Pu Tong Wai Ke Za Zhi. 2002; 17（2）: 99-101. Chinese with abstract in English.陳希綱， 劉家奇， 彭民浩， 等. 膽石病臨床流行病學調(diào)查 附8 585例分析. 中華普通外科雜志. 2002; 17（2）: 99-101. 2 Glass CK， Witztum JL. Atherosclerosis. The road ahead. Cell. 2001; 104（4）: 503-516.3 Zhu PT， Zhang JZ， Cao ZP， et al. Summary of the treatment of 274 patients with cholelithiasis and chronic biliary tract infection. Shanghai Zhong Yi Yao Za Zhi. 1986; （9）: 15-17. Chinese.朱培庭，張靜 ， 曹中平， 等. 治療慢性膽道感染、膽石病274例的總結(jié). 上海中醫(yī)藥雜志. 1986; （9）: 15-17. 4 Fang BJ， Zhou S， Gu HG， et al. Pei-ting Zhus experi-ence of treating cholelithiasis with the theory of liver. Zhong Yi Za Zhi. 2004; 45（5）: 334. Chinese.方邦江， 周爽， 顧宏剛， 等. 朱培庭從肝論治膽石病經(jīng)驗. 中醫(yī)雜志. 2004; 45（5）: 334. 5 Zhu PT， Zhu SM. Practical book of cholic diseases in traditional Chinese medicine. Beijing: Peoples Medical Publishing House. 1999: 272. Chinese.朱培庭， 朱世敏. 實用中醫(yī)膽病學. 北京: 人民衛(wèi)生出版社. 1999: 272. 6 Chen Q. The experimental methods of traditional Chi-nese medicinal pharmacology. Beijing: Peoples Medi-cal Publishing House. 1993: 206. Chinese.陳奇. 中藥藥理實驗方法學. 北京: 人民衛(wèi)生出版社. 1993: 206. 7 Fang BJ， Zhu PT， Zhang JZ， et al. Change of Ca2+i in gallbladder cells of guinea pigs with gallstone and its releasing by Chinese drugs and recipe for dispersing stagnated liver qi and promoting bile secretion. Zhong-guo Zhong Yi Ji Chu Yi Xue Za Zhi. 2006; 12（7）: 519-521.方邦江， 朱培庭， 張靜 ， 等. 膽結(jié)石豚鼠膽囊細胞Ca2+i的變化與疏肝利膽方藥對其的促釋放作用. 中國中醫(yī)基礎(chǔ)醫(yī)學雜志. 2006; 12（7）: 519-521. 8 Huang ZQ. Status quo and future prospects of biliary tract surgery. Zhongguo Shi Yong Wai Ke Za Zhi. 1999; 19（1）: 17-18. Chinese.黃志強. 膽道外科的現(xiàn)狀與未來. 中國實用外科雜志， 1999;