培養(yǎng)觀察細(xì)菌的簡(jiǎn)易方法.doc

培養(yǎng)觀察細(xì)菌的簡(jiǎn)易方法一、牙垢中的細(xì)菌 用消毒牙簽，在自己牙齒縫里挑下一些碎屑，放在潔凈載玻片上的水滴中，調(diào)勻，制成涂片。待涂片干燥后，在酒精燈火焰上徐徐來(lái)回掠過(guò)34次，細(xì)菌外面的一些膠質(zhì)粘著在載玻片上，使細(xì)菌固定、稍冷，加一滴亞甲基藍(lán)溶液，染色12分鐘后，用清水沖洗，然后蓋上蓋玻片。置顯微鏡下，先用低倍鏡觀察，再換高倍鏡，可觀察到桿菌、弧菌、球菌等。若使用油鏡觀察，效果更清楚明顯。 二、糞池里的細(xì)菌 在糞池用吸管吸取一滴漚過(guò)的糞混合液上層液體，滴在潔凈的載玻片上，蓋上蓋玻片。置顯微鏡下觀察，先用低倍鏡，后用高倍鏡?？梢?jiàn)到活的螺旋菌及桿菌。注意在觀察時(shí)光線應(yīng)暗些，效果好。 三、酸萊、酸奶中的細(xì)菌 取酸菜液上部的白色薄膜或酸奶澄清液，制成臨時(shí)裝片，放在高倍鏡下觀察，可看到乳酸桿菌。 四、根瘤菌的觀察 取豆科植物大豆、蠶豆、花生的根瘤用刀片切開(kāi)，用針挑取一小塊內(nèi)容物，放在載玻片上的水滴中，制成涂片，晾干后，用酒精燈火焰烘烤固定，然后滴一滴亞甲基藍(lán)溶液，染色23分鐘，清水沖洗，蓋上蓋玻片，吸干后，用500倍高倍鏡觀察，可見(jiàn)到短桿狀根瘤菌。 五、枯草桿菌的培養(yǎng)和觀察把25克新鮮干草切成小段，放在盛200毫升清水燒杯中，加熱煮沸15分鐘，待溶液呈暗褐色時(shí)，倒入燒瓶，放在黑暗、2030的溫暖環(huán)境中。23天后，液體混濁，表面形成薄膜。用吸管吸取浮在上層的液體，制成臨時(shí)涂片，放在高倍鏡下觀察，可看到連成線的枯草桿菌。若將培養(yǎng)液放在低溫處12天，再取出制成臨時(shí)涂片，用600倍或更高倍數(shù)的顯微鏡觀察還能看到枯草桿菌的芽孢。微生物學(xué)實(shí)驗(yàn) 細(xì)菌細(xì)胞的生化反應(yīng)實(shí)驗(yàn) 一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?了解并掌握細(xì)菌鑒定中常用生理生化反應(yīng)的原理和方法。 二、實(shí)驗(yàn)原理 各種細(xì)菌由于具有不同的酶系統(tǒng)，致使它們能利用不同的底物，或雖然可以利用相同的底物，卻產(chǎn)生不同的代謝產(chǎn)物，因此可以利用各種生理生化反應(yīng)來(lái)鑒別細(xì)菌。 糖發(fā)酵是最常用的生化反應(yīng)，存在于大多數(shù)細(xì)菌中。不同的細(xì)菌在糖的分解能力上存在很大的差異。有些細(xì)菌能分解某種糖并產(chǎn)生酸性物質(zhì)(如乳酸、丙酸、醋酸等)和氣體(如二氧化碳、氫、甲烷等)，而有些細(xì)菌只產(chǎn)生酸不產(chǎn)生氣體。例如大腸桿菌分解乳糖和葡萄糖產(chǎn)酸并產(chǎn)氣，普通變形桿菌分解葡萄糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣，但不能分解乳糖。酸的產(chǎn)生可利用指示劑來(lái)判斷。在培養(yǎng)基中加入溴甲酚紫(pH52為黃色，pH68為紫色)，當(dāng)發(fā)酵產(chǎn)酸時(shí)，使培養(yǎng)基由紫色變?yōu)辄S色。氣體的產(chǎn)生可由發(fā)酵試管中倒置的德漢氏小管中有無(wú)氣泡的出現(xiàn)來(lái)驗(yàn)證 三、試劑與器材1.材料大腸桿菌、普通變性桿菌、產(chǎn)氣桿菌、糖發(fā)酵培養(yǎng)基、蛋白胨水培養(yǎng)基、葡萄糖蛋白胨水培養(yǎng)基。2.試劑甲基紅試劑、40KOH、5a一萘酚、乙醚、吲哚試劑。3.實(shí)驗(yàn)器材德漢氏小管、試管、接種環(huán)、恒溫培養(yǎng)箱。 四、實(shí)驗(yàn)內(nèi)容培養(yǎng)基配制編號(hào)試管接種培養(yǎng)觀察結(jié)果 五、關(guān)鍵步驟及注意事項(xiàng)1.要嚴(yán)格按照培養(yǎng)基配方配制培養(yǎng)基。2.觀察結(jié)果時(shí)要注意滴加藥量及反應(yīng)時(shí)間。 六、思考題1.哪些生理生化試驗(yàn)可用于區(qū)別大腸桿菌和產(chǎn)生腸桿菌?結(jié)果如何?2.做糖發(fā)酵試驗(yàn)時(shí)應(yīng)注意哪些問(wèn)題?3.甲基紅試驗(yàn)和伏一普試驗(yàn)的最終產(chǎn)物如何?為什么會(huì)出現(xiàn)不同的最終產(chǎn)物?微生物學(xué)實(shí)驗(yàn) 微生物直接計(jì)數(shù)法及測(cè)微技術(shù) 一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?.了解血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)原理，并掌握計(jì)數(shù)方法。2.掌握用測(cè)微尺測(cè)定微生物大小的方法。 二、實(shí)驗(yàn)原理 顯微鏡直接計(jì)數(shù)法是將一定稀釋的菌體或孢子懸液注入血球計(jì)數(shù)板的計(jì)數(shù)室中，于顯微鏡下直接計(jì)數(shù)的一種簡(jiǎn)便、快速、直觀的方法。因?yàn)橛?jì)數(shù)板是一塊特別的載玻片。其上由四條槽構(gòu)成三個(gè)平臺(tái)；中間較寬的平臺(tái)又被一短橫槽隔成兩半，每一邊的平臺(tái)上各刻有一個(gè)方格網(wǎng)，每個(gè)方格網(wǎng)共分為九個(gè)大方格，一種是一個(gè)大方格分成25個(gè)中方格，而每個(gè)中方格又分成16個(gè)小方格(見(jiàn)圖2344)；另一種是一個(gè)大方格分成16個(gè)中方格，每個(gè)中方格又分成25個(gè)小方格，無(wú)論哪種每個(gè)大方格中的小方格都是400個(gè)。每一個(gè)大方格邊長(zhǎng)為01mm，所以計(jì)數(shù)室的容積為01mm3。計(jì)數(shù)時(shí)，通常只用5個(gè)中格內(nèi)的菌體(孢子)數(shù)即可。然后求出每個(gè)中方格的平均值，再乘上25或16，得出一個(gè)大方格中的總茵數(shù)，再換算成lml菌液中的總菌數(shù)。若設(shè)5個(gè)中方格中總菌數(shù)為N，菌液稀釋倍數(shù)為M，如果是25個(gè)中方格計(jì)數(shù)板，則計(jì)算方法為：lml菌液中的總菌數(shù)=平均每個(gè)中格中菌的個(gè)數(shù)25104M=50000NM(個(gè))微生物細(xì)胞的大小是微生物基本的形態(tài)特征，也是分類鑒定的依據(jù)之一。微生物大小的測(cè)定，需要在顯微鏡下，借助于特殊的測(cè)量工具測(cè)微尺，包括目鏡測(cè)微尺和鏡臺(tái)測(cè)微尺。鏡臺(tái)測(cè)微尺是中央部分刻有精確等分線的載玻片，一般是將1mm等分為100格，每格長(zhǎng)001mm(即10pm)。鏡臺(tái)測(cè)微尺并不直接用來(lái)測(cè)量細(xì)胞的大小，而是用于校正目鏡測(cè)微尺每格的相對(duì)長(zhǎng)度。 三、試劑與器材1.材料 釀酒酵母、藤黃微球菌和大腸桿菌的染色標(biāo)本片、釀酒酵母24h馬鈴薯斜面培養(yǎng)物。2.實(shí)驗(yàn)器材 細(xì)胞計(jì)數(shù)板、顯微鏡、蓋玻片、無(wú)菌毛細(xì)滴管、目鏡測(cè)微尺、鏡臺(tái)測(cè)微尺、載玻片、蓋玻片、顯微鏡等。 四、實(shí)驗(yàn)內(nèi)容1.微生物直接計(jì)數(shù)法 菌懸液制備鏡檢計(jì)數(shù)室加樣品顯微鏡計(jì)數(shù)清洗血細(xì)胞計(jì)數(shù)板2.微生物測(cè)微技術(shù) 裝目鏡測(cè)微尺校正菌體大小測(cè)定 五、關(guān)鍵步驟及注意事項(xiàng)1.防止加樣空氣泡產(chǎn)生。2.調(diào)節(jié)顯微鏡光線的強(qiáng)弱適當(dāng)。 六、思考題1.根據(jù)你的體會(huì)，說(shuō)明用血細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)的誤差主要來(lái)自哪些方面?應(yīng)如何盡量減少誤差、力求準(zhǔn)確?2.某單位要求知道一種干酵母粉中的活菌存活率，請(qǐng)?jiān)O(shè)計(jì)12種可行的檢測(cè)方法。3.為什么更換不同放大倍數(shù)的目鏡或物鏡時(shí)，必須用鏡臺(tái)測(cè)微尺重新對(duì)目鏡測(cè)微尺進(jìn)行校正?微生物學(xué)實(shí)驗(yàn) 酵母菌的形態(tài)觀察及死活細(xì)胞的鑒定 一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?.觀察酵母菌的形態(tài)特征、出芽生殖方式，并掌握酵母菌與細(xì)菌形態(tài)特征的區(qū)別。2.學(xué)習(xí)鑒別死活細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)方法。 二、實(shí)驗(yàn)原理 酵母菌是單細(xì)胞的真核微生物，菌體比細(xì)菌大而且不運(yùn)動(dòng)。酵母菌的繁殖方式分為無(wú)性繁殖和有性繁殖兩種，以無(wú)性繁殖為主。芽殖是酵母菌普遍的無(wú)性繁殖方式，少數(shù)為裂殖；有性繁殖是產(chǎn)生子囊和子囊孢子。本實(shí)驗(yàn)是通過(guò)美藍(lán)染液水浸片和水一碘液水浸片來(lái)觀察酵母的形態(tài)和芽殖方式。 美藍(lán)是一種無(wú)毒性的染料，它的氧化型呈藍(lán)色，還原型無(wú)色。用美藍(lán)對(duì)酵母活細(xì)胞染色時(shí)，由于細(xì)胞的新陳代謝作用，細(xì)胞內(nèi)具有較強(qiáng)的還原能力，能使美藍(lán)由藍(lán)色的氧化型變?yōu)闊o(wú)色的還原型，而對(duì)代謝作用微弱或死細(xì)胞，無(wú)此還原能力或還原能力極弱，而被美藍(lán)染成藍(lán)色或淡藍(lán)色。因此，不僅用此法可觀察酵母細(xì)胞形態(tài)，也可用來(lái)鑒別酵母菌的死細(xì)胞和活細(xì)胞。 三、試劑與器材1.材料 釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)或卡爾酵母(Saccharomyces calsbergensis)培養(yǎng)2天左右的麥芽汁(或豆芽汁)液體培養(yǎng)物。2.試劑 0.05和O.1呂氏堿性美藍(lán)染色液、革蘭氏染色用的碘液。3.器材 顯微鏡、載玻片、蓋玻片、接種環(huán)、灑精燈等。 四、實(shí)驗(yàn)內(nèi)容1.美藍(lán)浸片觀察 酵母培養(yǎng)制片染色鏡檢30分鐘后再鏡檢2.水-碘浸片觀察 五、關(guān)鍵步驟及注意事項(xiàng)1.染液不宜過(guò)多或過(guò)少，否則，在蓋上蓋玻片時(shí)，菌液溢出或出現(xiàn)大量氣泡。2.用鑷子取一塊蓋玻片，先將一側(cè)與菌液接觸，然后慢慢將蓋玻片放下，使其蓋在菌液上，蓋玻片不宜平著放下，避免氣泡產(chǎn)生。 六、思考題1.呂氏堿性美藍(lán)染液濃度和作用時(shí)間的不同，對(duì)酵母菌死細(xì)胞數(shù)量有何影響?試分析其原因。2.在顯微鏡下，酵母菌有哪些突出的特征區(qū)別于一般細(xì)菌?微生物學(xué)實(shí)驗(yàn) 常用培養(yǎng)基的制備、滅菌與消毒 一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康牧私馀囵B(yǎng)基的配制原理；掌握配制培養(yǎng)基的一般方法和步驟；了解常見(jiàn)滅菌、清毒基本原理及方法；掌握干熱天菌、高壓蒸汽滅菌及過(guò)濾除菌的操作方法。 二、實(shí)驗(yàn)原理培養(yǎng)基是人工按一定比例配制的供微生物生長(zhǎng)繁殖和合成代謝產(chǎn)物所需要的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的混合物。培養(yǎng)基的原材料可分為碳源、氮源、無(wú)機(jī)鹽、生長(zhǎng)因素和水。根據(jù)微生物的種類和實(shí)驗(yàn)?zāi)康牟煌?，培養(yǎng)基也有不同的種類和配制方法。牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基是一種應(yīng)用最廣泛和最普通的細(xì)菌基礎(chǔ)培養(yǎng)基，有時(shí)又稱為普通培養(yǎng)基。由于這種培養(yǎng)基中含有一般細(xì)胞生長(zhǎng)繁殖所需要的最基本的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，所以可供微生物生長(zhǎng)繁殖之用。干熱天菌、高壓蒸汽滅菌方法主要是通過(guò)升溫使蛋白質(zhì)變性從而達(dá)到殺死微生物的效果。 三、試劑與器材1.器材 試管、三角瓶、燒杯、量筒、玻璃棒、培養(yǎng)基、分裝器、天平、牛角匙、高壓蒸汽滅菌鍋、pH度紙、棉花、牛皮紙、記號(hào)筆、麻繩、紗布、吸管、培養(yǎng)皿、電烘箱、注射器、微孔濾膜過(guò)濾器、鑷子等。2.試劑 牛肉膏、蛋白胨、NaCl、瓊脂 四、實(shí)驗(yàn)內(nèi)容1.稱量溶化調(diào)pH過(guò)濾分裝加塞包扎滅菌無(wú)菌檢查2.干熱滅菌：裝入待滅菌物品升溫恒溫降溫開(kāi)箱取物3.高壓蒸汽滅菌：加水裝物品加蓋加熱排冷空氣加壓恒壓降壓回零排汽取物無(wú)菌檢查4.過(guò)濾除菌：組裝滅菌連接壓濾無(wú)菌檢查清洗滅菌 五、關(guān)鍵步驟及注意事項(xiàng)1.要嚴(yán)格按配方配制。2.調(diào)pH不要過(guò)頭。3.干熱滅菌要注意物品不要堆放過(guò)緊，注意溫度的時(shí)間控制，70C以下放物、取物。4.高壓滅菌要注意物品不要過(guò)多，加熱后排除冷空氣，到時(shí)降壓回零取物。5.過(guò)濾除菌要注意各部件滅菌，壓濾時(shí)，壓力要適當(dāng)，不可太猛太快，濾膜要注意清洗保存。 六、思考題1.培養(yǎng)基配好后，為什么必須立即滅菌?如何檢查滅菌后的培養(yǎng)基是無(wú)菌的?2.在配制培養(yǎng)基的操作過(guò)程中應(yīng)注意些什么問(wèn)題?為什么?3.培養(yǎng)微生物的培養(yǎng)基應(yīng)具備哪些條件?為什么?4.培養(yǎng)基的配制原則是什么?如何做好鞭毛染色細(xì)菌鞭毛染色制片技術(shù)是微生物學(xué)的重要實(shí)驗(yàn)。鞭毛著生的位置和數(shù)目是種的特征，對(duì)細(xì)菌分類具有重要意義。鞭毛是細(xì)菌的運(yùn)動(dòng)“器官”。細(xì)菌的鞭毛極為纖細(xì)，一般直徑只有1020m，只有用特殊的鞭毛染色法進(jìn)行染色，才能在光學(xué)顯微鏡下觀察；鞭毛染色法的原理是借助媒染劑和染色劑的沉淀作用，使染料沉淀在鞭毛上，使鞭毛直徑增加并著色。 鞭毛染色前幾年多用利夫森（Leifson）氏鞭毛染色法，近年來(lái)多用硝酸銀染色法。不論用哪種方法都具有實(shí)驗(yàn)技術(shù)要求高、過(guò)程復(fù)雜、難度較大的特點(diǎn)，故鞭毛染色常常效果不太理想。下面就如何做好鞭毛染色談幾點(diǎn)意見(jiàn)供參考。 1要選好菌種。一般用周生鞭毛菌（如普通變形桿菌Proteus vulgaris）較好，這類菌的鞭毛多而長(zhǎng)易于觀察。 2要注意培養(yǎng)條件和培養(yǎng)時(shí)間：用點(diǎn)接法在新配制的牛肉膏蛋白胨半固體平板上接種。一般一個(gè)平板點(diǎn)接34處。經(jīng)比較用半固體培養(yǎng)基培養(yǎng)出來(lái)的菌體活動(dòng)度大，鞭毛長(zhǎng)且多，易于染色，這可能與半固體培養(yǎng)基更適于菌體運(yùn)動(dòng)、鞭毛生長(zhǎng)較好有關(guān)。用點(diǎn)接種法在平板上接種更易于挑取邊緣幼齡的菌體。培養(yǎng)時(shí)間要嚴(yán)格掌握，一般培養(yǎng)912h較好，菌齡超過(guò)15h，鞭毛染色效果較差，這可能與老齡菌體活動(dòng)度降低、鞭毛易脫落有關(guān)。冰箱長(zhǎng)期保存的菌種不宜直接用于鞭毛染色，需用新制備的斜面連續(xù)轉(zhuǎn)接23次后再染色。 3所用玻片的準(zhǔn)備：用過(guò)的舊載片要選擇光滑無(wú)劃痕的，放入已加入洗衣粉的蒸餾水中煮沸（如能預(yù)先過(guò)濾去渣更好），煮畢冷卻后，清水洗凈，放入濃洗液中浸泡24h，取出用清水沖洗殘酸，最后用蒸餾水洗凈，瀝干水并放于95乙醇中脫水，取出后燒去酒精，即可使用。新的載片雖沒(méi)有油污、劃痕，但含游離堿較多，所以要用2鹽酸浸泡幾小時(shí)，用自來(lái)水沖洗干凈，然后再用蒸餾水洗凈，瀝干后再用效果較好。 4染色液一定要新鮮，特別是硝酸銀染色法中更是如此，A染液和B染液最好都現(xiàn)用現(xiàn)配，A液一般不能放置。 5染色過(guò)程中的細(xì)節(jié)也應(yīng)充分注意：取菌要取菌落邊緣的幼齡菌體。取菌后的接種環(huán)在載片上的蒸餾水中輕輕沾幾下即可，不要用力太猛，更不能用接種環(huán)大幅度涂開(kāi)；將載片稍傾斜，使菌液散開(kāi)即可，否則鞭毛易脫落，造成染色失敗。鞭毛染色的玻片只能自然干燥，不能用熱風(fēng)吹干，不能熱固定，這是由于加熱后菌體易變形，鞭毛易脫落，影響觀察。A染液染35min，其后用蒸餾水（自來(lái)水效果差）沖洗時(shí)一定要充分，否則加B染液后，背景很臟，鞭毛不易被觀察到，影響實(shí)驗(yàn)效果。加B染液后，將玻片稍加熱（但不能太熱，更不能沸騰或蒸干）使其微冒蒸汽，3060s，染色效果較不加熱為好。B染液染完后，用蒸餾水沖洗比用自來(lái)水沖洗效果好。微生物實(shí)驗(yàn) 霉菌的形態(tài)觀察 一、目的要求 掌握觀察霉菌形態(tài)的基本方法，并觀察其形態(tài)特征。 二、基本原理 霉菌菌絲較粗大，細(xì)胞易收縮變形，而且孢子很容易飛散，所以制標(biāo)本時(shí)常用乳酸石炭酸棉藍(lán)染色液。此染色液制成的霉菌標(biāo)本片其特點(diǎn)是：(a)細(xì)胞不變形；(b)具有殺菌防腐作用，且不易干燥，能保持較長(zhǎng)時(shí)間；(c)溶液本身呈藍(lán)色，有一定染色效果。 霉菌自然生長(zhǎng)狀態(tài)下的形態(tài)，常用載玻片觀察，此法是接種霉菌孢子于載玻片上的適宜培養(yǎng)基上，培養(yǎng)后用顯微鏡觀察。此外，為了得到清晰、完整、保持自然狀態(tài)的霉菌形態(tài)還可利用玻璃紙透析培養(yǎng)法進(jìn)行觀察。此法是利用玻璃紙的半透膜特性及透光性，將霉菌生長(zhǎng)在覆蓋于瓊脂培養(yǎng)基表面的玻璃紙上，然后將長(zhǎng)菌的玻璃紙剪取一小片，貼放在載玻片上用顯微鏡觀察。 三、器材 曲霉（Aspergillussp），青霉（Penicillium sp），根霉（Rhizopus sp），毛霉（Mucor sp）； 乳酸石炭酸棉藍(lán)染色液，20甘油，查氏培養(yǎng)基平板，馬鈴薯培養(yǎng)基；無(wú)菌吸管，載玻片，蓋玻片，U形棒，解剖刀，玻璃紙，濾紙等。 四、操作步驟 1一般觀察法 于潔凈載玻片上，滴一滴乳酸石炭酸棉藍(lán)染色液，用解剖針從霉菌菌落的邊緣處取小量帶有孢子的菌絲置染色液中，再細(xì)心地將菌絲挑散開(kāi)，然后小心地蓋上蓋玻片，注意不要產(chǎn)生氣泡。置顯微鏡下先用低倍鏡觀察，必要時(shí)再換高倍鏡。 2載玻片觀察法 (1)將略小于培養(yǎng)皿底內(nèi)徑