基因修飾在人源化肝臟小鼠建模中的應用

基因修飾技術在人源化肝臟小鼠模型中的應用 早在17世紀動物試驗就已經(jīng)出現(xiàn)了 目前試驗動物廣泛應用于生理學 醫(yī)學 藥學等學科的教學與研究 以及食品 化妝品 生物制品 工業(yè)產(chǎn)品等的安全性 毒性和效力等方面的試驗和檢測 具有重要價值和作用 試驗用動物 種屬差異 動物基因組 人類基因組 代謝 免疫相關人類毒性 肝臟是人體最重要的代謝器官 也是出現(xiàn)受試人員中毒時最常見 表現(xiàn)最明顯 影響最嚴重的毒性靶器官 另據(jù)報導 每年臨床發(fā)生肝毒性損傷的病例亦非常多 藥物引發(fā)肝損傷占全部中毒事件20 50 暴發(fā)性肝衰竭可達15 30 藥物性肝損害 非阿尿苷事件回顧 非阿尿苷是抗乙肝病毒核苷類似物 其前期試驗藥效顯著 結果良好 而1993年15名受試者加大劑量 0 1or0 25mg kg d 的二期臨床試驗中 前8周療效明顯 而13周時7名受試者出現(xiàn)肝衰竭 脾衰竭 乳酸中毒 其中5名不治身亡 動物試驗非阿尿苷最大耐受劑量 小鼠50mg kg d90d 大鼠500mg kg d30d 比格犬3mg kd d90d 食蟹猴25mg kg d30d 小鼠給藥劑量達到250mg kg d 人類劑量1000倍 時 50只小鼠僅有4只死于腎衰竭 大鼠劑量達510mg kg d 人類劑量2000倍 持續(xù)給藥70d 所有大鼠ALT AST均正常 試驗動物作為預測工具如不能完全準確預測人體可能會出現(xiàn)的情況 就如同戰(zhàn)地掃雷 一旦出現(xiàn)誤判 代價很有可能將是巨大的 危險 安全 那么能不能構建一種臨床前更貼近人肝代謝 預測性更一致性的試驗動物模型 將可能發(fā)生的人類肝毒性提前篩查出來 降低無謂成本 減少臨床損失呢 這將具有極其重大的意義和價值 人源化肝臟小鼠模型由此成為研究熱點 現(xiàn)代生物醫(yī)藥領域研究模式 基因修飾技術ES打靶基因修飾技術TALEN基因修飾技術CRISPR Cas9基因修飾技術TetraOneTM基因修飾技術 基因修飾動物建模 免疫缺陷小鼠模型的構建 人源化肝臟小鼠模型的構建 工程基因片段uPA基因片段Fah基因片段HSVtk GCV自殺系統(tǒng)Tet on uPA自殺系統(tǒng)其他 移植用人類細胞肝細胞造血干細胞胸腺細胞其他 1 uPA Rag2小鼠 Dandri 2001年 德國 uPA全稱尿激酶纖維蛋白溶酶原活化子 Urokinase typePlasminogenActivator 當白蛋白啟動的uPA基因片段在小鼠肝細胞內表達時 纖維蛋白溶酶原會激活纖維蛋白酶 誘發(fā)粗面內質網(wǎng)發(fā)生裂解損傷 最后肝細胞損傷并逐漸消亡 Rag2全稱重組激活基因2 Recombination ActivatingGene2 在VDJ基因重排和淋巴細胞發(fā)育中起關鍵性作用 Rag2 小鼠為C57BL 6J品系背景 T B淋巴細胞早期發(fā)育嚴重停滯 外周血沒有成熟的循環(huán)T B淋巴細胞 非特異性免疫收影響小 Rag2小鼠 uPA基因 肝細胞人源化率僅有15 適合病毒學研究 但無法滿足代謝研究需求 2 uPA SCID小鼠 Tateno 2004年 日本 SCID小鼠全名聯(lián)合缺陷免疫小鼠 severecombinedimmunedeficiency 其第16對染色體隱性基因突變 純合子的淋巴細胞抗原受體基因VDJ區(qū)域的重組酶活性異常 基因重排無法正常進行 影響B(tài) T細胞的正常分化 外周血白細胞總數(shù)減少 但粒細胞 巨噬細胞 NK細胞 LAK細胞正常 uPA SCID小鼠相比uPA Rag2小鼠具有更高的人源化比率 其肝細胞替換可達50 運用免疫抑制劑后可提升至70 基本滿足代謝和毒性研究需求 許多學者利用該模型進行了多種藥物研究 SCID小鼠 uPA基因 持續(xù)性自發(fā)肝損 出血性疾病導致死亡 高血補體濃度 C3 腎病 生殖障礙 移植窗較小 出生后2W內移植 存在非特異性免疫 需藥物抑制免疫 2 uPA SCID小鼠 Tateno 2004年 日本 3 Fah小鼠 Grompe 1993年 波蘭 Fah全稱延胡索酰乙酰乙酸水解酶基因 fumarylacetoacetatehydrolase Fah 小鼠酪氨酸代謝受阻 出現(xiàn) 型酪氨酸血癥 毒性產(chǎn)物損傷肝 腎 2 硝基 4 三氟甲苯 1 3環(huán)乙烷碘 NTBC 可以抑制酪氨酸降解通路中4 對羥基苯丙酮酸雙氧化酶 4 HPPD 活性 減少毒性代謝產(chǎn)物積聚 起到治療作用 NTBC治療維持 具有免疫系統(tǒng) 不適合人源化組織和細胞移植 Fah nude Fah Rag1 Fah Nod Scid ll2rg基因是白細胞介素2受體的gamma鏈 Il 2R c 又稱CD132 是具有免疫功能的細胞因子Il 2 Il 4 Il 7 Il 9 Il 15和I 21的共同受體亞基 L2rg 小鼠機體免疫功能嚴重降低 尤其是NK細胞的活性幾乎喪失 4 FRG小鼠 Azuma 2007年 波蘭 持續(xù)性的自發(fā)肝臟 自發(fā)性 型酪氨酸血癥突出 易誘發(fā)肝癌 需要藥物NTBC控制肝損傷程度 易對試驗結果造成影響 小鼠存活率不高 飼養(yǎng)時易死亡 4 FRG小鼠 Azuma 2007年 波蘭 FRG小鼠在性狀和效果上都優(yōu)于Fah 小鼠 其肝細胞替換率達80 以上 后經(jīng)其他學者改進探索 可達95 左右 該模型應用于代謝和病毒等多個領域研究 有重要意義 5 NOG NSG小鼠 Ito 2002年 日本 NOG小鼠由日本實驗動物研究所的Ito培育而成 通過雜交NOD Scid和Il2rg 小鼠而來 其T B細胞皆缺失 NK細胞功能缺陷 與NOD Scid小鼠相比 NOG小鼠的人體細胞和組織移植存活率顯著提高 同時能夠植入更高比例的正常或癌變人類細胞和組織 NOG NSG是類似的并行品系 源于日本為NOG NOD Shi scid Il 2R cnull 源于美國為NSG NOD scid C SzJ NOG小鼠在免疫缺陷模型 腫瘤模型 異種移植模型 傳染病模型領域有大量應用 6 TK NOG小鼠 Hasegawa 2011年 日本 單純皰疹病毒胸苷激酶 更昔洛韋 HSVtk GCV 系統(tǒng)是分子生物學基因修飾技術中運用十分廣泛的自殺系統(tǒng) GCV本身無毒 但是在轉染了HSVtk基因的細胞中可被磷酸化 成為單磷酸鹽 再經(jīng)內源性細胞激酶作用可轉化為二磷酸和三磷酸鹽 對細胞有高毒性 NOG TK NOG 具有人肝等效的酶表達及生物功能 具有較高立體組織結構 人源化程度高 90 生存率高 移植時段寬裕 可重復利用 無需外源性藥物維持性狀 可生殖傳代 雌性可與NOG小鼠生育 在代謝 毒性 病毒 微生物方面大量應用2011 2017 美日有諸多研究和數(shù)據(jù) 無商業(yè)化成品供應 國內來源受限 6 TK NOG小鼠 Hasegawa 2011年 日本 7 uPA NOG小鼠 Gutti 2014年 美國 uPA NOG小鼠是在NOG小鼠基礎上通過基因修飾加入uPA基因培育而來 目前應用相對較少 有報導