細胞生物學06核糖體與核酶.doc

第六章.核糖體與核酶 核糖體(ribosome)，是細胞內一種核糖核蛋白顆粒(ribonucleoprotein particle), 其惟一功能是按照mRNA的指令將氨基酸合成蛋白質多肽鏈,所以核糖體是細胞內蛋白質合成的分子機器。核糖體最早是Albert Claude于20世紀30年代后期發(fā)現(xiàn)的, 其后又證明了其蛋白質合成功能。隨著分子生物學的發(fā)展， 核糖體概念的涵意有了進一步的發(fā)展。細胞內除了從事蛋白質合成的核糖體外， 還有許多其它功能的核糖核蛋白體顆粒， 通常是一些小分子的RNA同蛋白質組成的顆粒， 它們參與RNA的加工、RNA的編輯、基因表達的調控等。發(fā)現(xiàn)核糖體及核糖體功能鑒定的兩個關鍵技術是什么?( 發(fā)現(xiàn)核糖體及核糖體功能鑒定的兩個關鍵技術是什么?（答案） 答: 核糖體最早是Albert Claude于1930s后期用暗視野顯微鏡觀察細胞的勻漿物時發(fā)現(xiàn)的，當時稱為微體(Microsomes)，直到1950s中期，George Palade在電子顯微鏡下觀察到這種顆粒的存在。當時George Palade和他的同事研究了多種生物的細胞，發(fā)現(xiàn)細胞質中有類似的顆粒存在，尤其在進行蛋白質合成的細胞中特別多。后來Philip Siekevitz用亞細胞組份分離技術分離了這種顆粒，并發(fā)現(xiàn)這些顆?？偸前殡S內質網微粒體一起沉積?；瘜W分析揭示，這種微粒富含核苷酸，隨之命名為ribosome，主要成分是核糖體RNA(rRNA)， 約占60%、蛋白質(r蛋白質)約占40%。核糖體的蛋白質合成功能是通過放射性標記實驗發(fā)現(xiàn)的。將細胞與放射性標記的氨基酸短暫接觸后進行勻漿，然后分級分離，發(fā)現(xiàn)在微粒體部分有大量新合成的放射性標記的蛋白質。后將微粒體部分進一步分離，得到核糖體和膜微粒，這一實驗結果表明核糖體與蛋白質合成有關。兩個關鍵技術是亞細胞組份分離技術和放射性標記技術。)6.1 核糖體的形態(tài)結構核糖體是細胞內數(shù)量最多的細胞器，原核細胞和真核細胞都有核糖體，功能也相同，但是結構組成卻有很大差別。6.1.1 核糖體的類型和化學組成 核糖體的類型 按存在的部位:有三種類型核糖體，細胞質核糖體、線粒體核糖體、葉綠體核糖體。 按存在的生物類型: 分為兩種類型，即真核生物核糖體和原核生物核糖體。原核細胞的核糖體較小， 沉降系數(shù)為70S，相對分子質量為2.5x103 kDa，由50S和30S兩個亞基組成(圖6-1)；而真核細胞的核糖體體積較大， 沉降系數(shù)是80S，相對分子質量為3.94.5x103 kDa， 由60S和40S兩個亞基組成。圖6-1 從兩個不同角度觀察的E.coli 核糖體的三維結構 Mg2+ 的濃度對于大小亞基的聚合和解離有很大的影響， 體外實驗表明:70S核糖體在Mg2+的濃度小于1mmol/L的溶液中易解離; 當Mg2+濃度大于10mmol/L， 兩個核糖體通常形成100S的二聚體(圖6-2)。圖6-2 通過區(qū)帶離心鑒定核糖體的亞基在低濃度的Mg2+時，完整的核糖體將分成大小兩個亞基。 在組成上，葉綠體中的核糖體與原核生物核糖體相同，但線粒體中核糖體的大小變化較大(表6-1)。表6-1 不同類型核糖體的大小比較來源完整核糖體核糖體亞基核糖體RNAs細胞質80S60S(大亞基)28S，5.8S，5S(真核生物)40S(小亞基)18S，細胞質70S50S(大亞基)23S，5S(原核生物)30S(小亞基)16S線粒體55-60S45S(大亞基)16S(哺乳動物)35S(小亞基)12S線粒體75S53S(大亞基)21S(酵母)35S(小亞基)14S線粒體78S60S(大亞基)26S，5S(高等植物)45S(小亞基)18S葉綠體70S50S(大亞基)23S，5S30S(小亞基)16S 核糖體的化學組成核糖體的大小兩個亞基都是由核糖體RNAs(rRNAs)和核糖體蛋白(ribosomal proteins)組成的， 原核生物和真核生物細胞質核糖體的大小亞基在蛋白質和RNA的組成上都有較大的差別(圖6-3)圖6-3 典型的原核細胞和真核細胞質核糖體的化學組成6.1.2 核糖體蛋白質與rRNA由于核糖體有著十分重要的生物學功能，所以有關其結構和各種結構域的功能，一直是研究的重點。為了建立一個完整的核糖體分子結構模型，必須了解構成核糖體的每一個蛋白質和rRNA分子在核糖體中的位置。 核糖體蛋白通過電泳和層析等技術，已經鑒定了E.coli核糖體小亞基的21種蛋白質和大亞基的34種蛋白質。小亞基的蛋白分別命名為S1S21，大亞基的核糖體蛋白命名為L1L33。核糖體中的蛋白質除了一種具有四個拷貝外，其余都是一個拷貝。圖6-4是E.coli小亞基21種蛋白質的排列。圖6-4 E.coli小亞基21種蛋白質的排列 核糖體rRNAHarry Holler測定了E.coli 16S rRNA序列，一共有1542個核苷酸。通過計算機分析，發(fā)現(xiàn)不同生物來源的16S rRNA的序列組成具有進化上的保守性。推測16S rRNA結構有四個結構域， 每個結構域都有46%的堿基配對，形成螺旋的柄狀結構(圖6-5)。每一個柄狀結構都很短，不到8 bp，且并不都是完全配對的。16S rRNA的電子顯微照片的形態(tài)與30S核糖體亞基相似，因此認為30S核糖體亞基的形態(tài)主要是由16S rRNA決定的。圖6-5 E.coli中16S rRNA分子折疊的二級結構折疊主要是由序列中互補堿基配對引起的。6.1.3 細菌核糖體的結構模型為了揭示核糖體的空間結構以及核糖體蛋白質和rRNA相互間的關系，分別用物理、化學以及顯微技術進行了大量的研究工作，在這些研究工作的基礎上提出了細菌核糖體的結構模型(圖6-6)。模型中蛋白質的定位是根據不同來源的資料分析綜合后確定的，如S4、S5、S8和S12等四個蛋白定位在核糖體的小亞基上，并且是背向大亞基，就是根據四種不同方法獲得的資料，比較分析后確定的。圖6-6 E.coli 核糖體結構模型圖中分別顯示了小亞基、大亞基中一些核糖體蛋白質的位置，以及蛋白質合成過程中mRNA在核糖體中的位置。 在該模型中確定了一些重要的功能區(qū)和RNA的結合位點(圖6-7)。 圖6-7 核糖體結構及功能位點6.2 核糖體的生物發(fā)生(biogenesis)核糖體的合成和裝配過程相當復雜。真核細胞和原核細胞的核糖體合成和裝配過程各不相同。核糖體的生物發(fā)生包括蛋白質和rRNA的合成、核糖體亞基的組裝等。6.2.1 核糖體rRNA基因的轉錄與加工核糖體的組成成分是蛋白質和rRNA，所以編碼核糖體的基因分為兩類，一類是蛋白質基因，另一類是rRNA基因。在生活細胞中，特別是在活躍進行蛋白質合成的細胞中，需要大量的核糖體，這就意味著需要合成大量的rRNA和核糖體蛋白質。 編碼rRNA基因的過量擴增細胞為了滿足大量需求的rRNA,通過兩種方式擴大rRNA基因的拷貝數(shù)： 在染色體上增加rRNA基因的拷貝數(shù)，如在細菌E.coli的基因組中有七套rRNA基因，而典型的真核生物細胞含有幾百到幾千個28S、18S和5.8S rRNA基因的拷貝，5S rRNA基因的拷貝數(shù)多達50000個。 通過基因擴增(gene amplification)( 細胞內選擇性復制DNA, 產生大量的拷貝。如兩棲類卵母細胞在發(fā)育的早期，rRNA基因的數(shù)量擴增到1000多倍。基因擴增是通過形成幾千個核進行的，每個核里含有幾百拷貝的編碼28S、18S和5.8S的rRNA基因，最后卵母細胞中的這些rRNA基因的拷貝數(shù)幾乎達到50萬個，而在相同生物的其它類型細胞中，這些rRNA基因的拷貝數(shù)只有幾百個。卵母細胞中有如此眾多的rRNA基因拷貝，為卵細胞在受精后的發(fā)育過程中合成大量核糖體創(chuàng)造了條件。至于卵母細胞中rRNA基因擴增的機制，有人認為可能是通過從染色體上分離出來的環(huán)狀DNA分子，這種環(huán)狀DNA中含有rRNA基因，但是第一個含有rRNA基因的環(huán)狀DNA是如何形成的尚不清楚。由于環(huán)狀DNA能夠通過滾環(huán)復制(rolling circle replication)的方式進行復制，因而能夠產生大量的rRNA基因)?？茖W家用兩棲類的卵細胞(卵母細胞)研究在發(fā)育過程中rRNA基因的擴增。發(fā)現(xiàn)兩棲類卵母細胞在發(fā)育的早期，rRNA基因的數(shù)量擴增到1000多倍(圖6-8)。圖6-8 非洲爪蟾卵母細胞中rRNA的合成卵母細胞中含有幾百個核仁，每個核仁都含有擴增的rRNA基因。 真核生物18S、5.8S、28S rRNA和5SrRNA基因編碼rRNA基因的DNA稱為rDNA。真核生物有四種rRNA基因, 其中18S、5.8S和28S rRNA基因是串聯(lián)在一起的,每個基因被間隔區(qū)隔開, 5S rRNA基因則位于不同染色體上。說明人體單倍體染色體組中四種rRNA基因的組成、排列方式和拷貝數(shù)。(說明人體單倍體染色體組中四種rRNA基因的組成、排列方式和拷貝數(shù)。（答案） 答: 在人基因組的四種rRNA基因中， 18S、5.8S和28S rRNA基因是串聯(lián)在一起的，每個基因被間隔區(qū)隔開， 5S的rRNA基因則是編碼在另一條染色體上。前3個基因組成一組， 分布在人的13、14、15、21、22 等5條染色體上。在間期核中， 所有這5條染色體rRNA基因區(qū)域， 轉錄時聚集在一起， 形成一個核仁。在人體單倍體染色體組中， 每組rRNA基因有200個拷貝。每一拷貝為一個rDNA轉錄單位。這3個基因是縱向串聯(lián)排列在核仁組織者的DNA上。真核細胞核糖體的5S rRNA基因則是獨立存在于一個或幾個染色體上， 拷貝數(shù)達幾千個。在人的細胞中， 該基因的拷貝有24000個之多， 它們串聯(lián)排列在1號染色體接近末端處。) 18S、5.8S、28S rRNA基因轉錄與加工 轉錄蛋白與45S的前體18S rRNA、5.8S rRNA和28S rRNA基因首先轉錄成一個45S的前體rRNA(pre-rRNA)，大約是這3 個rRNA總長的2倍。能夠轉錄這3個rRNA前體的DNA區(qū)域稱為一個轉錄單位(transcription unit)，意指它們有一個共同的轉錄起點和轉錄終點。在轉錄單位中除了這三個rRNA基因外，還包括一些間隔區(qū)。 轉錄酶:真核生物中參與rRNA基因轉錄的酶是RNA聚合酶。 前體加工前體rRNA在核仁中被酶剪切成3個rRNA產物， 轉錄間隔區(qū)則被降解掉。根據3H標記的尿嘧啶和放線菌素D研究人的培養(yǎng)細胞前體rRNA的合成的結果推測了前體rRNA的加工過程(圖6-9)。圖6-9 45SrRNA的加工過程在rRNA聚合酶的作用下，將18S rRNA、5.8S rRNA和28S rRNA轉錄成45S的前體，然后通過一系列的切割加工形成成熟的18S rRNA、5.8S rRNA和28S rRNA。其中5.8S的rRNA通過互補堿基的氫鍵與28S rRNA結合在一起。 雖然所有真核生物的18S、5.8S和28S rRNA基因是相同的， 并且在染色體上組成同一個轉錄單位， 但是不同生物中的18S、5.8S和28S rRNA基因的轉錄起點和間隔區(qū)的長短并不完全相同(圖6-10)。圖6-10 rRNA轉錄單位圖的上半部是正在轉錄的rDNA形成的刷狀rRNA;下半部是一個轉錄單位的轉錄物,并將蛙的rRNA轉錄單位與小鼠的轉錄單位進行比較。從圖中可見:基因間被可轉錄的間隔物隔開;轉錄單位之間有非轉錄區(qū);不同生物的rDNA的轉錄起點可能不同;不同生物的rDNA各基因間的間隔序列長短不同。 由于不同生物的rDNA 轉錄起點不同、間隔區(qū)長短不同，所以 pre-rRNA的長度不都是45S，范圍在34S45S之間(表6-2)。表6-2 不同種生物的前體rRNA生物pre-rRNA的沉降系數(shù)果蠅34S裂殖酵母37S煙草38S蛙40S雞45S小鼠45S人45S 真核生物前體rRNA的修飾 前體rRNA有兩個獨特的特點:一是含有大量的甲基化的核苷,另一個就是具有很多假尿苷(pseudouridine)。在人的前體RNA加工過程中,有100多個甲基添加到前體分子的核糖上,并且有95%的尿嘧啶被轉變成假尿苷。 前體rRNA的甲基化及其意義:前體rRNA分子中的某些堿基進行甲基化修飾，甲基化的主要部位在核糖第二位的羥基上，在甲基化的過程中需要snRNA的參與。甲基化可能對加工起引導作用。實驗證明前體rRNA中被甲基化的部位在加工過程中并未被切除，而是一直保持到成熟的rRNA中。另外還發(fā)現(xiàn)，如果人為地阻斷前體rRNA的甲基化，前體rRNA的成熟加工也被阻斷，因此，推測前體rRNA的甲基化對rRNA的加工具有指導作用。另外，前體rRNA的修飾可能有利于rRNA的正確折疊，以及與別的分子正確的相互作用。 5S rRNA基因的轉錄與加工5S rRNA是核糖體大亞基的一個組份，原核生物和真核生物都有5S rRNA，而且結構相似。 5S rRNA基因: 真核生物的5S rRNA基因與其他三種rRNA基因不在同一條染色體上，它是由核仁以外的染色體基因轉錄的，然后運輸?shù)胶巳蕛葏⑴c核糖體的裝配。非洲爪蟾的5S rRNA基因的一個重復單位含有一個5SrRNA基因、一個不轉錄的假基因(101bp的5S rRNA基因的片段)，每個重復單位間被不轉錄的間隔序列隔開，間隔序列的長度變化不定，最長達400bp(圖6-11)。圖6-11 非洲爪蟾的5SrRNA基因的組織結構 5S rRNA基因轉錄酶: 5S rRNA基因是由RNA聚合酶轉錄的，原初轉錄物的5端與成熟的5S rRNA的5端完全相同。在某些生物中，3端通常含有多余的核苷酸，在加工時要被切除。所以，5S rRNA只需要進行簡單的加工，或者根本不需要進行加工。 內部啟動子RNA聚合酶轉錄5S rRNA基因時使用的是內部啟動子，其他的兩種酶使用的是上游啟動子，實驗也證明這種內部啟動子的存在。如何證明RNA聚合酶進行5SrRNA基因轉錄時使用的是內部啟動子?( 如何證明RNA聚合酶進行5S rRNA基因轉錄時, 使用的是內部啟動子?（答案） 播放動畫 答:可通過基因操作。如將5S rRNA基因的5側的上游序列完全除去，檢測轉錄情況, 然后再切去5S rRNA基因的部分內部序列,再檢測轉錄情況。實驗結果表明: 將5S rRNA基因的5側的上游序列完全除去并不影響5S rRNA基因的轉錄。但是，如果將5S rRNA基因內部缺失一部分序列(從50位到80位缺失)，RNA聚合酶不僅不能轉錄這段DNA，甚至不能結合上去(圖6E-1)。如果將5S rRNA基因的內部啟動子序列插入到基因組的其它部位，會使插入的部位形成一個新的轉錄起點。圖6E-1 RNA聚合酶轉錄5S rRNA基因啟動子的鑒定將圖中5S rRNA基因的A片段或D片段缺失都不影響RNA聚合酶的轉錄,但是將B片段或C片段缺失,都會影響RNA聚合酶的轉錄。表明5S rRNA基因的啟動子位于5S基因內部的控制區(qū)。) 原核生物rRNA基因及轉錄原核生物rRNA基因也是多拷貝的，并且也要被轉錄成一個前體，然后再經加工成成熟的rRNA。 原核生物和真核生物的rRNA基因在組織結構的差異 基因的重復次數(shù): 真核生物的rRNA基因重復的次數(shù)相當高，而原核生物的rRNA基因的重復次數(shù)卻很少，例如E.coli，只重復了7次。 真核生物編碼5S rRNA的基因位于不同的染色體上，而細菌的5S rRNA基因與另外兩種rRNA基因組成一個轉錄單位，它們在染色體上的排列順序是16S-23S-5S。 轉錄: 實驗證明原核生物的16S-23S-5S三種rRNA位于同一條轉錄的rRNA分子中, 轉錄后由核酸酶(RNase)切成三個分子。如何證明原核生物的16S-23S-5S三種rRNA位于同一條轉錄的rRNA分子中?( 如何證明原核生物的16S-23S-5S三種rRNA位于同一條轉錄的rRNA分子中.（答案） 答:通過核酸酶(RNase)突變體的研究證明原核生物的三種rRNA位于同一個原初轉錄物中。在這種突變體中，三種rRNA位于同一條rRNA分子中，但是在正常的細胞中這三種rRNA是以三種獨立的小分子存在，這一研究結果也說明RNase是將16S-23S-5S rRNA前體切割成單體的主要核酸酶。 在細菌中RNase不是參與rRNA前體加工的惟一的一種酶，還需要其它一些核酸酶參與，實驗證明如果缺少其它一些酶，得不到正確大小的rRNA。)細菌中的rRNA轉錄單位除了轉錄三種rRNA外，同時也會產生幾種tRNA分子。在16S和23S rRNA 間可產生12個tRNA,在5S rRNA基因的下游也會產生12個tRNA。同真核生物一樣，細菌的rRNA也有甲基化，但比真核生物rRNA甲基化程度低。細菌的rRNA加工過程示于圖6-12。圖6-12 E.coli前體rRNA的轉錄與加工6.2.2 核糖體的裝配核糖體是自我裝配的細胞器，當?shù)鞍踪|和rRNA合成加工成熟之后就要開始裝配核糖體的大小兩個亞基，真核生物核糖體亞基的裝配地點在細胞核的核仁部位，原核生物核糖體亞基的裝配則在細胞質中。 核糖體亞基的自我裝配 自組裝(self-assembly): 1968年， Masayasu Nomura把拆開的大腸桿菌核糖體的30S小亞基的21種蛋白質與16S rRNA在體外混合后重新裝配成30S小亞基， 然后把重建的小亞基同50S大亞基以及其他輔助因子混合后， 進行蛋白質合成實驗，發(fā)現(xiàn)重建的核糖體具有生物活性，能催化氨基酸摻入到蛋白質多肽鏈中。這一實驗表明，核糖體是一種自組裝(self-assembly)的結構，即沒有樣板或親體結構所組成的結構。但是在組裝過程中，某些蛋白質必須首先結合到rRNA上，其他蛋白才能組裝上去，即組裝過程有先后層次(圖6-13)。圖6-13 E.coli 小亞基的裝配圖粗箭頭表示結合力強，細箭頭表示力弱。如S4與16S rRNA之間是粗箭頭，表示S4可直接與16S rRNA結合而不需要其他蛋白的存在。而S7與16S rRNA的結合力很弱，并且需要S4、S8、S9、S19、S20蛋白的存在。 30S亞基蛋白質分類: 在核糖體重裝配過程中，可以通過減去某一種蛋白質來驗證該蛋白質在亞基裝配及亞基中的作用。據此，可將30S亞基上的蛋白質分為三類:開始裝配所必需的蛋白質，它們先和rRNA特定區(qū)段結合，形成核糖體亞基的核心;結合后可為后一批蛋白提供結合位點；非30S亞基形成所必需，但卻是顯示其活性所必需的。 原核生物核糖體重組(ribosome recombination)實驗所謂核糖體重組是指將不同來源的核糖體大小亞基、或不同亞基的rRNA或蛋白質重新組合， 形成雜合的核糖體后研究其功能的實驗方法。有人用核糖體重組實驗得到一些重要的結論, 請說明主要內容(有人用核糖體重組實驗得到一些重要的結論， 你能說出一、二嗎?（答案） 答: 這些結果包括以下幾個方面:30S亞基的蛋白質專同16S rRNA結合; 50S 亞基的蛋白質只同23S rRNA結合，如果把30S亞基rRNA和50S 亞基的蛋白質相混合，則不能裝配成有功能的亞基。從不同種細菌提取30S 亞基的rRNA和蛋白質， 可裝配成有功能的30S 亞基， 這表明不存在種間差異。原核生物核糖體與真核生物核糖體的亞基彼此不同， 由二者的rRNA和蛋白質重組后的核糖體沒有功能。大腸桿菌的核糖體與玉米葉綠體核糖體亞基重組后具有功能。由于不同生物的線粒體核糖體大小不同， 由55S到80S不等， 而原核生物的核糖體基本穩(wěn)定，所以線粒體的核糖體亞基同原核生物核糖體亞基相互交換形成的雜合核糖體沒有功能。) 真核生物核糖體在核仁中裝配 主要過程:圖6-14 是關于人細胞中核糖體裝配過程圖6-14 人細胞中核糖體裝配的主要過程20世紀60年代初期Robert Perry發(fā)現(xiàn)核糖體的合成是在核仁中進行的, 請問是如何發(fā)現(xiàn)的?( 二十世紀六十年代初期Robert Perry發(fā)現(xiàn)核糖體的合成是在核仁中進行的， 請問他是如何發(fā)現(xiàn)的? （答案） 答: 二十世紀六十年代初期Robert Perry用紫外微光束破壞活細胞的核仁，發(fā)現(xiàn)破壞了核仁的細胞喪失合成rRNA的能力，這一發(fā)現(xiàn)提示核仁與核糖體的形成有關。后來Perry又發(fā)現(xiàn)低濃度的放線菌素D能夠抑制3H-尿嘧啶摻入rRNA中，而不影響其他種類的RNA合成。顯微放射自顯影也顯示放線菌素D能夠選擇性阻止核仁RNA的合成，表明核仁與rRNA的合成有關。)6.3 核糖體的功能-蛋白質的合成核糖體的功能是進行蛋白質的合成。在核糖體上合成的是蛋白質的一級結構，即多肽鏈。合成是從多肽鏈的N端開始，到C末端結束。對于mRNA來說，合成的方向則是53。蛋白質的合成涉及核糖體的一些功能位點和RNA的作用。 6.3.1 核糖體的功能位點原核生物核糖體中有四種與RNA分子結合的位點，其中一個是與mRNA結合的位點，另三個是與tRNA結合的位點(圖6-15)。圖6-15 原核生物核糖體中與RNA結合的位點 A位點(A site) (即氨?；稽c，是與新?lián)饺氲陌滨RNA(aminoacyl-tRNA )結合的位點, 又叫受位(entry site)，主要位于大亞基，是接受氨酰tRNA的部位) P位點(P site)( 即肽酰tRNA位點(peptidyl-tRNA site), 又叫供位(donor site), 或肽?；稽c, 主要位于大亞基, 是肽基tRNA移交肽鏈后肽酰tRNA所占據的位置, 即與延伸中的肽酰tRNA結合位點) E 位點(exit site ，E site)( E位點是脫氨酰tRNA(deaminoacyl-tRNA)離開A位點到完全從核糖體釋放出來的一個中間?？奎c,只是作暫時的停留。當E位點被占據之后,A位點同氨酰tRNA的親和力降低,防止了氨酰tRNA的結合,直到核糖體準備就緒,E位點騰空,才會接受下一個氨酰tRNA) mRNA結合位點 真核生物的mRNA同核糖體的結合主要靠5端的帽子結構， 有時也通過IRES同核糖體結合(圖6-16);圖6-16 真核生物蛋白質合成的起始， IRES是內部核糖體進入位點(internal ribosome entry site)。原核生物mRNA中與核糖體16S rRNA結合的序列稱為SD序列(SD sequence) (圖6-17)。圖6-17 典型的細菌核糖體與mRNA的結合位點mRNA中的SD序列與核糖體16S rRNA3端互補。在SD序列的下游510個堿基處是起始密碼AUG或GUG。6.3.2 蛋白質合成的基本過程蛋白質合成，或稱mRNA翻譯是細胞中最復雜的合成活動。蛋白質的合成需要攜帶氨基酸的各種tRNA、核糖體、mRNA、不同功能的蛋白質、陽離子、GTP等的參與。蛋白質合成過程之所以復雜，是因為構成蛋白質的20種氨基酸要按照密碼精確地摻入到多肽中，不能有絲毫的差錯。蛋白質的合成，是三種不同類型的RNA通力合作的結果(圖6-18)。圖6-18 RNA在蛋白質合成中的三種作用 在核糖體上合成多肽鏈，分為三個完全不同的過程: 鏈的起始、鏈的延伸、鏈的終止(圖6-19)。圖6-19 蛋白質合成的三個主要過程 蛋白質合成的起始(initiation)蛋白質合成的起始涉及到mRNA、起始tRNA和核糖體小亞基之間的相互作用，最后裝配成完整的核糖體，起始過程分三步完成(圖6-20)。圖6-20 原核生物蛋白質合成的起始起始過程涉及多步反應，在原核生物中需要三個起始因子，在真核生物中涉及多個起始因子。原核生物蛋白質合成起始復合物形成包括哪些過程?需要哪些因子參與?( 原核生物蛋白質合成起始復合物形成包括哪些過程?需要哪些因子參與?（答案） 答: 主要分為三步， 參與的因子包括起始因子1-3，以及mRNA、轉運tRNA、GTP等。 30S亞基與mRNA的結合 mRNA不能與完整的核糖體結合，但是能夠同獨立存在的30S核糖體小亞基結合。在原核生物中，30S核糖體小亞基通過16S rRNA與mRNA起始密碼子AUG上游的SD序列的互補，從而與mRNA結合。核糖體小亞基與mRNA的結合還需要起始因子(initiation factor. IF)的幫助，原核生物的起始因子命名為IFs，真核生物的起始因子命名為eIFs。原核生物有三種起始因子，其中有兩種(IF1、IF3)通過與30S核糖體亞基的結合幫助30S亞基與mRNA的識別與結合。 第一個aa-tRNA進入核糖體 當mRNA與核糖體小亞基結合后，攜帶甲酰甲硫氨酸的tRNA通過反密碼子與mRNA中AUG的識別從而進入核糖體。起始tRNA在與mRNA形成mRNA-30S亞基復合物之前，必須同GTP、起始因子IF2結合，形成GTP-IF2-tRNAfMet復合物。起始tRNA復合物與mRNA的AUG密碼子結合后，釋放IF3。 完整起始復合物的裝配 一旦起始tRNA與AUG密碼子結合，核糖體大亞基就加入到復合物中形成完整的核糖體-mRNA起始復合物。該過程伴隨GTP的水解、IF1和IF2的釋放。其中GTP的水解可能引起核糖體構型的變化，而改變了的構型正是蛋白質合成所必需的。) 多肽鏈的延伸(elongation)一旦起始復合物形成，蛋白質的合成隨即開始，此過程稱為蛋白質合成的延伸。延伸涉及四個重復的步驟氨酰tRNA進入核糖體的A位點；肽鍵形成；轉位;脫氨酰tRNA釋放。上述四步的循環(huán)，使肽鏈不斷延長。在整個過程中，需要GTP和一些延長因子的參與(圖6-21)。圖6-21 蛋白質合成的延伸請詳細說明多肽鏈延伸的過程(請詳細說明多肽鏈延伸的過程。（答案） 答: 蛋白質合成的肽鏈延伸涉及四個重復的步驟氨酰tRNA進入核糖體的A位點；肽鍵形成；轉位;脫氨酰tRNA釋放。上述四步的循環(huán)，使肽鏈不斷延長。在整個過程中，需要GTP和一些延長因子的參與。氨酰-tRNA進入A位 由于起始tRNA占據P位點，核糖體開始接受第二個氨酰-tRNA進入A位點，此即為延伸的第一步。第二個氨酰-tRNA在進入A位點之前，必須與結合有GTP的蛋白延伸因子結合(原核細胞中延伸因子是Tu，真核生物則是eEF1)。Tu起傳遞作用，即將氨酰-tRNA傳遞給核糖體。雖然任何氨酰-tRNA-Tu-GTP都有可能進入A位，但只有反密碼子與A位點密碼子相匹配的tRNA才允許進入A位。一旦合適的氨酰-tRNA-Tu-GTP同A位點的密碼子結合，GTP水解，Tu-GDP被釋放。肽鍵形成 當核糖體的P位和A位都有tRNA占據時，進入核糖體的兩個氨基酸是分開的，所以延伸反應的第二步是兩個氨基酸相互作用，通過肽鍵的形成將兩個氨基酸結合起來。即由A位的aa-tRNA 上氨基酸的氨基與P位aa-tRNA 上氨基酸的羧基間形成肽鍵， 使P位的tRNA卸去氨基酸，而A位上的tRNA形成了二肽。肽鍵的形成是自動發(fā)生的，不需要額外的能量。這一反應是由肽酰轉移酶(peptidyl transferase)催化的，該酶是核糖體大亞基的組成成份。多年來一直認為肽酰轉移酶是組成50S亞基的一種蛋白，現(xiàn)在已經清楚，它是構成核糖體的RNA，是核酶。轉位(translocation) 當形成了第一個肽鍵時，A位點上的tRNA分子的一端仍然與mRNA的密碼子結合，而另一端與肽結合.此時P位點上的tRNA沒有氨基酸的結合。接下來進入延伸反應的第三步:轉位，即核糖體沿著mRNA從53方向移動三個核苷酸(一個密碼子)，在此過程中，A位的tRNA-二肽移到P位，而P位的tRNA則進入E位點。轉位需要另一個GTP結合的延伸因子的參與(原核生物是延伸因子G，真核生物是延伸因子eEF2)。GTP水解釋放的能量轉變成機械能，將核糖體沿著mRNA移動大約1 nm。脫氨酰tRNA的釋放 延伸反應的最后一步是脫氨酰tRNA離開核糖體的E位點。一旦肽酰tRNA轉位到P位，A位點再次開放，接受下一個aa-tRNA。在這種情況下，進入的氨酰-tRNA的反密碼子必須與第三個密碼子互補， 開始下一個循環(huán)。在蛋白質合成的延伸反應中，每一次循環(huán)至少水解兩分子的GTP， 耗時二十分之一秒，速度之快是驚人的。)在肽鏈延伸過程中tRNA的轉位是如何進行的?( 在肽鏈延伸過程中tRNA的轉位是是如何進行的?（答案） 答: 通過足跡法(footprinting)分析，揭示在蛋白質合成的延伸循環(huán)中，tRNA的轉位是分兩步進行的，并且相互獨立(圖Q6-1)。肽鍵的形成引起新形成的肽酰tRNA大亞基的受體部分從A位向P位偏移，而它的小亞基的反密碼子部分仍然與A位的密碼子相連(此時的狀態(tài)稱為A/P結合狀態(tài))。新形成脫氨酰tRNA的受體從大亞基的P位向E位偏移，而它的反密碼子部分仍然在小亞基的P位，此時的狀態(tài)稱為P/E結合狀態(tài)。核糖體與EF-G-tRNA復合物結合，引起這些tRNA的反密碼子的末端與它們結合的mRNA一起相對于小亞基移動，使得肽酰-tRNA完全占據大、小亞基的P位點(P/P結合狀態(tài))，而脫氨酰tRNA則完全移到大亞基的E位點。) 終止(termination)蛋白質合成的終止是指核糖體沿著mRNA移動，如果進入A位的是終止密碼子，由于沒有與之匹配的反密碼子，而終止蛋白質的合成。一共有三種終止密碼子:UAA、UAG、UGA，其中任何一種進入A位都會終止蛋白質的合成，并導致多肽鏈從核糖體釋放出來(圖6-22)。圖6-22 蛋白質合成的終止原核細胞使用幾種不同的釋放因子與終止密碼子作用，而真核細胞中所有的終止密碼子都是與相同的釋放因子作用。6.3.3 多聚核糖體(polyribosomes)在蛋白質合成過程中，同一條mRNA分子能夠同多個核糖體結合，同時合成若干條蛋白質多肽鏈，結合在同一條mRNA上的核糖體就稱為多聚核糖體(polysome 或polyribosomes，圖6-23)。 圖6-23 電子顯微鏡觀察的多聚核糖體圖中所示是蠶的絲心蛋白mRNA3端多聚核糖體，箭頭所示是絲心蛋白多肽。 多聚核糖體的發(fā)現(xiàn)20世紀60年代，有幾個實驗室先后發(fā)現(xiàn)了多聚核糖體。如Richs實驗室是用未成熟的紅細胞研究蛋白質合成時發(fā)現(xiàn)了多聚核糖體。他們將未成熟的紅細胞與放射性物質進行短暫培養(yǎng)，以標記新合成的蛋白質。然后溫和地破碎細胞，離心除去細胞核和線粒體，收集上清液，在上清液中含有核糖體。然后通過移動區(qū)帶離心，發(fā)現(xiàn)除了80S的核糖體之外，還有170S的核糖體，而放射性的標記物主要存在于170S的核糖體上，因此推斷在蛋白質合成時，核糖體可能是成串存在的。電子顯微鏡觀察證實：80S的核糖體是單個存在的，而170S的核糖體是由46個核糖體組成的多聚核糖體。 多聚核糖體的形成 在mRNA的起始密碼子部位，核糖體亞基裝配成完整的起始復合物，然后向mRNA的3端移動，直到到達終止密碼子處。當?shù)谝粋€核糖體離開起始密碼子后，空出的起始密碼子的位置足夠與另一個核糖體結合時，第二個核糖體的小亞基就會結合上來，并裝配成完整的起始復合物，開始蛋白質的合成。同樣，第三個核糖體、第四個核糖體、依次結合到mRNA上(圖6-24)。根據電子顯微照片推算，多聚核糖體中，每個核糖體間相隔約80個核苷酸。圖6-24 多聚核糖體的形成與蛋白質合成多聚核糖體形成的意義何在?( 多聚核糖體形成的意義何在?（答案） 答: 同一條mRNA被多個核糖體同時翻譯成蛋白質，大大提高了蛋白質合成的速率， 更重要的是減輕了細胞核的負荷， 減少了基因的拷貝數(shù)， 也也減輕了細胞核進行基因轉錄和加工的壓力。)6.3.4 蛋白質合成抑制劑不同的蛋白質合成抑制劑具有不同的作用方式，是研究蛋白質合成機制的有用工具。 抗生素抗生素(antibiotics)是主要的蛋白質合成抑制劑，如氯霉素、鏈霉素等。不同抗生素的作用機制不同。如鏈霉素主要是抑制起始tRNA和非起始tRNA與核糖體的結合,導致肽鏈合成的提前終止。有些抗生素抑制50S大亞基肽酰轉移酶的活性,如氯霉素。表6-3是某些常用抗生素的作用。表6-3 某些常用的蛋白質合成抑制劑名稱作用對象阻斷過程影響效果作用的細胞類型氯霉素50S延伸肽鍵形成原核生物大腸桿菌素E330S起始、延伸與mRNA結合原核生物與氨酰tRNA結合 放線菌酮60S起始，延伸結合起始tRNA轉位 (tRNA從P位釋放)真核生物白喉毒素eEF-2 延伸轉位 真核生物紅霉素50S 起始起始復合物形成 原核生物梭鏈孢酸EF-G/ eFE-2延伸轉位原核/真核生物春日霉素 30S 起始起始tRNA的結合原核生物嘌呤霉素 50S/60S 延伸肽鍵形成 (觸發(fā)鏈釋放)原核/真核生物壯觀霉素30S 延伸轉位原核生物鏈霉素30S 起始，延伸起始tRNA結合氨酰tRNA結合 (誘發(fā)錯讀)原核生物 四環(huán)素30S 延伸，終止 氨酰tRNA的結合 RF-1和RF-2的結合原核生物 紫霉素 50S/30S 阻斷P位點轉位原核生物圖6-25 是一些幾種抑制蛋白質合成的抗生素的結構。圖6-25 幾種常見的抑制蛋白質合成的抗生素 嘌呤霉素 結構 嘌呤霉素(puromycin)是一種蛋白質合成抑制劑,它具有與tRNA分子末端類似的結構(圖6-26), 能夠同氨基酸結合，代替氨?；膖RNA同核糖體的A位點結合，并摻入到生長的肽鏈中。圖6-26 嘌呤霉素與苯丙氨酰tRNA3末端結構的比較 對核糖體功能位點的研究 通過嘌呤霉素對蛋白質合成的抑制實驗發(fā)現(xiàn)核糖體的A位點和P位點是兩個獨立的位點。實驗分兩組進行，在第一組實驗中，將P位點結合有起始tRNA的核糖體與嘌呤霉素一起溫育，發(fā)現(xiàn)嘌呤霉素與核糖體結合，并且能夠同起始tRNA相互作用。在第二組實驗中，將P位點結合有起始tRNA的核糖體先與氨酰-tRNA一起溫育，使之形成肽鍵后再加入嘌呤霉素，此時加入的嘌呤霉素既不能同核糖體結合也不能與二肽酰tRNA相互作用。但是在反應體系中加入GTP和延長因子EF-G后，嘌呤霉素則又能與核糖體結合(圖6-27)。圖6-27 用嘌呤霉素證明核糖體的A、P是兩個獨立存在的位點根據這兩組實驗結果如何判斷核糖體中的A、P是兩個分開的獨立位點?( 如何根據嘌呤霉素實驗的結果判斷核糖體中的A、P是兩個分開的獨立位點?（答案） 答: 可以這樣分析:在第一組實驗中，只有起始tRNA占據P位，如果A位點是一個獨立位點的話，此時的A位點就是空閑的，嘌呤霉素當然能夠結合上去，如果A位點與P位點是同一位點，那么嘌呤霉素就不能與核糖體結合，實驗結果是嘌呤霉素能夠結合。在第二組實驗中，由于A位點已經被二肽酰tRNA占據，所以嘌呤霉素無法與A位點結合，只有加入延伸因子和GTP后，使A位點騰空，嘌呤霉素才能結合到核糖體上。因此兩根據這兩組實驗結果可以斷定A、P是兩個獨立的功能位點。)6.3.5 蛋白質的壽命與降解蛋白質合成是細胞中最重要的合成事件。但是，細胞內蛋白質的種類和數(shù)量的控制不僅和蛋白質合成的速度有關，而且與蛋白質的壽命相關。 蛋白質的壽命信號N-端規(guī)則(N-end rule): 每一種蛋白質都有壽命特征， 稱為半衰期(half-life)。研究發(fā)現(xiàn)多肽鏈N-端特異的氨基酸與半衰期相關，稱為N-端規(guī)則。表6-4總結了酵母中的N-端規(guī)則。 表6-4 裂殖酵母中N-端氨基酸對蛋白質半衰期的影響末端氨基酸殘基半衰期末端氨基端殘基半衰期Arg2 minIle30 min Lys3 minGlu30 min Phe3 minPro5 hr Leu3 minCys30 hr Trp3 minAla30 hr His3 minSer30 hr Asp3 min Thr30 hr Asn3 minGly30 hrTyr10 minVal30 hr Gln10 minMet30 hr 蛋白酶體對蛋白質的降解 蛋白酶體(proteasomes)( 蛋白酶體既存在于細胞核中,又存在于胞質溶膠中, 是溶酶體外的蛋白水解體系, 由1020個不同的亞基組成中空的圓桶形的結構,顯示多種肽酶的活性，能夠從堿性、酸性和中性氨基酸的羧基側水解多種與遍在蛋白連接的蛋白質底物。蛋白酶體對蛋白質的降解是與環(huán)境隔離的。主要降解兩種類型的蛋白質:一類是錯誤折疊的蛋白質,另一類就是需要進行數(shù)量調控的蛋白質。蛋白酶體對蛋白質的降解通過泛素(ubiquitin)介導,所以又稱為泛素降解途徑。泛素是由76個氨基酸殘基組成的小肽,它的作用主要是識別要被降解的蛋白質,然后將這種蛋白質送入蛋白酶體的圓桶中進行降解。蛋白酶體對蛋白質的降解作用分為兩個過程:一是對被降解的蛋白質進行標記,由泛素完成;二是蛋白酶解作用,由蛋白酶體催化。蛋白酶體存在于所有真核細胞中，其活性受干擾素的調節(jié))蛋白酶體既存在于細胞核中,又存在于胞質溶膠中, 是溶酶體外的蛋白水解體系。蛋白酶體對蛋白質的降解通過泛素(ubiquitin)介導,故稱為泛素降解途徑。蛋白酶體對蛋白質的降解作用分為兩個過程:一是對被降解的蛋白質進行標記,由泛素完成;二是蛋白酶解作用,由蛋白酶體催化(圖 6-28)。圖6-28 蛋白酶體對蛋白質的降解作用被降解的蛋白質與多個泛素分子共價結合，從而被標記;蛋白質-泛素共價結合的復合物與蛋白酶體頂部的帽子結合; 泛素被切除，未折疊的蛋白質被送入蛋白酶體的腔;-:蛋白質在蛋白酶體中被降解。6.4 反義RNA與核酶(ribozyme)在研究真核生物核糖體rRNA加工時發(fā)現(xiàn)了某些rRNA具有酶的功能，能夠自我剪接，同時還發(fā)現(xiàn)一些小分子的反義RNA參與核糖體RNA的修飾。另外還發(fā)現(xiàn)50S核糖體中的23S rRNA具有肽酰轉移酶的功能。將具有酶功能的RNA稱為核酶。 6.4.1 小分子RNA與反義RNA真核生物中， 除了mRNA，rRNA和tRNA外， 細胞核和細胞質中含有許多其它類型的小分子RNA(small RNA)， 雖然它們的相對分子質量很小， 但卻有非常重要的作用。 小分子RNA的類型主要有兩種類型的小分子RNA:一類是snRNA(small nuclear RNA),存在于細胞核中；另一類是scRNA(small cytoplasmic RNA)，存在于細胞質中。由于snRNA富含尿嘧啶核苷，分類時把它分為U1、U2、等，常見的snRNA的類型和功能列于表6-5。表6-5 某些snRNA的特性RNA功能豐度(拷貝數(shù)/細胞)RNA聚合酶存在于核質中U1前體mRNA的剪接1106U2同上5105U4同上2105U5同上2105 U6同上4105U7組蛋白前體mRNA剪接5103U11 功能未知1104U12功能未知51037SK功能未知21058-2前體tRNA的加工(RNase)1105存在于核仁U3前體rRNA的加工2105(植物中則為)U8功能未知4104 U13功能未知11047-2功能未知1105 反義RNA與蛋白質合成的抑制 概念: 反義RNA(antisense RNA)是指與mRNA互補的RNA分子, 也包括與其它RNA互補的RNA分子。最早是在E.coli 的產腸桿菌素的Col E1質粒中發(fā)現(xiàn)反義RNA,許多實驗證明在真核生物中也存在反義RNA。近幾年來通過人工合成反義RNA的基因, 并將其導入細胞內轉錄成反義RNA, 即能抑制某特定基因的表達,阻斷該基因的功能, 有助于了解該基因對細胞生長和分化的作用。 類型原核細胞中發(fā)現(xiàn)的反義RNA， 根據其作用方式分為三類: I類、類、類。根據原核細胞中反義RNA作用方式的不同分為三類， 請推測它們的作用方式有什么不同?( 根據原核細胞中反義RNA作用方式的不同分為三類， 請推測它們的作用方式有什么不同?（答案） 答: 這三類反義RNA的作用特點分別是:I類反義RNA直接作用于其靶mRNA的SD序列和/或編碼區(qū)， 引起翻譯的直接抑制(1A類); 或與靶mRNA結合后引起該雙鏈RNA分子對RNA酶的敏感性增加， 使其降解(1B類)。類反義RNA 與mRNA的SD序列的上游非編碼區(qū)結合， 從而抑制靶mRNA的翻譯功能，其作用機理尚不清楚，可能是反義RNA與靶mRNA上游序列結合后， 會引起核糖體結合位點區(qū)域的二級結構發(fā)生改變， 從而抑制了與核糖體的結合。類反義RNA可直接抑制靶mRNA的轉錄。如tic RNA(transcriptioninhibitory complementary RNA)是大腸桿菌中CAP蛋白(cAMP結合蛋白)的mRNA的反義RNA。ticRNA基因的啟動子可被cAMP-CAP復合物所激活， 從CAP mRNA的轉錄起始位點上游3個核苷酸處開始， 以CAP mRNA的模板DNA鏈的互補鏈為模板， 合成ticRNA。ticRNA的具體長度不清楚， 但是它的5端一