細(xì)菌DNA提取方法.doc

細(xì)菌dna提取方案細(xì)菌DNA提取方案細(xì)菌DNA提取方案：革蘭氏陰性菌，如E.coli，一般有三種可以選擇的方法。一、水煮模板法主要用于PCR反應(yīng)1、接種單菌落于LB或腦心平板，連續(xù)畫(huà)線，37攝氏度培養(yǎng)1824小時(shí)。2、刮取12接種環(huán)菌苔加入150微升三蒸水中，混勻，100攝氏度煮沸10分鐘。3、12000轉(zhuǎn)/分鐘 離心10分鐘，取上清，20攝氏度保存?zhèn)溆?。操作最?jiǎn)便，對(duì)試劑條件要求低。缺點(diǎn)是純度不夠高，可能會(huì)含有RNA、蛋白等雜質(zhì)。但是作為一般檢測(cè)目的的PCR反應(yīng)模板已經(jīng)足夠了。有人稱擴(kuò)增4kb以下片段都可用此種方法制取模版，編者用此類模板PCR可以擴(kuò)增到3500bp的片段。編者建議：此法得到的模版保存時(shí)間短，強(qiáng)烈建議每月重新制作一次。二、CTAB/NaCl 法1、接種一單菌落于5mlLB中,30培養(yǎng)過(guò)夜,2、取1ml種子培養(yǎng)液接入100ml2%LB中,37、220r/min培養(yǎng)16小時(shí);3、5000r/min離心10分鐘,棄去上清。4、加入10mlTE離心洗滌后,用10mlTE溶解菌體,混勻,-20保存?zhèn)溆谩?、取3.5ml菌懸液,加入184l10%SDS,混勻,加入37l10mg/ml蛋白酶K,混勻,37溫育1小時(shí)6、加入740l5mol/LNaCl,再加入512lCTAB/NaCl,混勻,65溫育10分鐘。7、加入等體積的氯仿/異戊醇,混勻,10000r/min離心5分鐘,保留上清。8、上清中加入等體積的酚氯仿異戊醇(25241),混勻,10000r/min離心5分鐘,保留上清。9、加入0.6倍的異丙醇,混勻,10000r/min離心5分鐘,收集DNA沉淀,用70%乙醇離心洗滌DNA沉淀。10、用1mlTE溶解DNA,加入終濃度為20g/mlRNaseA,4保存。CTAB/NaCl法提取的DNA純度較高，蛋白雜質(zhì)較少，保存時(shí)間長(zhǎng)，編者更喜歡把終濃度為20g/ml RnaseA加在第5步溫育的時(shí)候，這樣最后沒(méi)有RnaseA污染。每一步操作細(xì)致一些，得到的DNA可用于Southern blot。編者建議：長(zhǎng)時(shí)間保存DNA可放于-20，但要盡量減少反復(fù)凍融，否則影響DNA質(zhì)量。三、鹽析法1、1.5ml對(duì)數(shù)期菌液2、12000rpm 30 s3、200ul裂解液（同CTAB/NaCl法），37c,1hr4、66ul 5M NaCL,混勻充分，12000rpm 10min5、上清用粗槍頭取至新管6、等體積酚充分混勻，12000rpm 3min，反復(fù)抽提至無(wú)蛋白層7、取水層，等體積氯仿混勻，12000rpm 3min8、上清至新管，2倍體積預(yù)冷無(wú)水乙醇9、-20C，20min，14000rpm， 15min10、400ul 70%冷乙醇洗滌11、干燥，100ul 20ug/ml RNaseA，37C，30min12、2倍體積無(wú)水乙醇沉淀，70%冷乙醇洗滌13、干燥，溶于100ul TE介于方法一和方法二之間，CTAB雖然取出糖分效果較好，但CTAB本身也是有毒的，所以此方法放棄了CTAB。革蘭氏陽(yáng)性菌，由于細(xì)胞壁的結(jié)構(gòu)與陰性菌有差別，裂解比陰性菌稍微麻煩一些，可以采取CTAB/NaCl法稍加修改，在第四步加入終濃度2mg/ml的溶菌酶，37度溫育1h。實(shí)驗(yàn)注意：提基因組最好要將槍頭尖剪掉（剪掉以后在酒精燈上迅速過(guò)一下，使其斷口圓滑）。以免槍頭損傷基因組！抽干時(shí)最好是風(fēng)干！細(xì)菌基因組DNA的提取方法綜述，提供了5種方法。 1 快速微量提取法A.取1.5ml菌體培養(yǎng)物于一滅菌Ep管中，12000rpm離心1min, 丟去上清夜，收集菌體。B.加入400ul裂解液（40mMTris-醋酸，20mM醋酸鈉,1mMEDTA,1%SDS,pH7.8）混勻,置于37oC水浴1hr。C.然后加入200ul5mol/L的氯化鈉溶液，混勻后于13000rpm離心15min。D.取上清液，用苯酚抽提2次，氯仿抽提1次。E.加兩倍體積無(wú)水乙醇，1/10體積醋酸鉀(3M ,pH8.0)，-20度保存1小時(shí)后，13000rpm離心15min，棄上清液，沉淀用70%乙醇洗2次；置于室溫干燥后，溶于50ulTE溶液中，置4保存?zhèn)溆谩? 蛋白酶/SDS法制備先用10ml含適當(dāng)抗生素的GBM過(guò)夜培養(yǎng)Delftia sp.，第二天4000rpm離心10min收集菌體，用Washing TE（50mmol/LTris-HCl pH8.0,10mmol/LEDTA pH8.0）洗菌體2次，之后將菌體充分懸浮在5ml 1TE緩沖液中，先后加入0.5ml 5mg/L的蛋白酶、0.5ml 10% SDS，輕輕混勻后50放置3h5h，接著用等體積的Tris飽和苯酚抽提2次，苯酚/氯仿/異戊醇抽提一次，氯仿抽提一次后，乙醇沉淀DNA，用自動(dòng)移液器吸管頭將絮狀DNA沉淀塊吸附到Ep管中，70%乙醇洗2次，干燥后溶于適當(dāng)1TE或ddH2O中。31) 細(xì)菌培養(yǎng)：細(xì)菌接種于5ml液體培養(yǎng)基中，37搖床（300rpm）培養(yǎng)過(guò)液。2) 細(xì)菌收集：取1ml培養(yǎng)物于1.5ml EP管中，室溫8000rpm離心5min，棄上清，沉淀重新懸浮于1ml TE（pH8.0）中（用ddH2O也行)。3) 菌體裂解：加入6l 50mg/ml的溶菌酶，37作用2h。再加2mol/LNaCl50l，10%SDS 110l，20mg/ml的蛋白酶K 3l，50作用3h或37過(guò)夜。（此時(shí)菌液應(yīng)為透明粘稠液體）4) 抽提：菌液均分到兩個(gè)1.5ml EP管，加等體積的酚氯仿異戊醇(25241)，混勻，室溫放置5-10min。12000rpm離心10min。抽提兩次。（上清很粘稠，吸取時(shí)應(yīng)小心，最好槍頭尖應(yīng)剪去）5) 沉淀：加0.6倍體積的異丙醇，混勻，室溫放置10min。1 2000rpm離心10min。6)洗滌：沉淀用75%的乙醇洗滌。7) 抽（涼）干后，溶于50l ddH2O中，取2-5l電泳。作PCR模板用。4. DNA EXTRACTION PROCEDURE - GENERAL1) Grow cells overnight in 500 ml broth medium.2) Pellet cells by centrifugation, and resuspend in 5 ml 50 mM Tris (pH 8.0), 50 mM EDTA.3) Freeze cell suspension at -20C4) Add 0.5 ml 250 mM Tris (pH 8.0), 10 mg/ml lysozyme to frozen suspension, and let thaw at room temperature. When thawed, place on ice for 45 min.5) Add 1 ml 0.5% SDS, 50 mM Tris (pH 7.5), 0.4 M EDTA, 1 mg/ml proteinase K. Place in 50C water bath for 60 min.6) Extract with 6 ml Tris-equilibrated phenol and centrifuge at 10,000X g for 15 min. Transfer top layer to new tube (avoid interface). Re-do this step if necessary.7) Add 0.1 vol 3M Na acetate (mix gently), then add 2 vol 95% ethanol (mix by inverting).Spool out DNA and transfer to 5 ml 50 mM Tris (pH 7.5), 1 mM EDTA, 200 g/ml RNase. Dissolve overnight by rocking at 4C.8) Extract with equal volume chloroform (mix by inverting) and centrifuge at 10,000X g for 5 min. Transfer top layer to a new tube.9) Add 0.1 vol 3M Na acetate (mix gently), then add 2 vol 95% ethanol (mix by inverting).10) Spool out DNA and dissolve in 2 ml 50 mM Tris (pH 7.5), 1 mM EDTA.11) Check purity of DNA by electrophoresis and spectrophotometric analysis.51) 100ml 細(xì)菌過(guò)夜培養(yǎng)液, 5000rpm離心10分鐘, 去上清液。2) 加9.5ml TE懸浮沉淀, 并加0.5ml 10% SDS, 50l 20mg/ml(或1mg干粉)蛋白酶 K, 混勻, 37保溫1小時(shí)。3) 加1.5ml 5mol/L NaCl, 混勻。4) 加1.5ml CTAB/NaCl溶液, 混勻, 65保溫20分鐘。5) 用等體積酚:氯仿:異戊醇(25:24:1)抽提, 5000rpm離心10分鐘, 將上清液移至干凈離心管。6) 用等體積氯仿:異戊醇(24:1)抽提, 取上清液移至干凈管中。7) 加1倍體積異丙醇, 顛倒混合, 室溫下靜止10分鐘，沉淀DNA。8) 用玻棒撈出DNA沉淀, 70%乙醇漂洗后, 吸干,溶解于1ml TE, -20保存。如DNA沉淀無(wú)法撈出,可5000rpm離心, 使DNA沉淀。9) 如要除去其中的RNA, 可以按本章第三節(jié)中操作步驟處理。注：1)CTAB/NaCl溶液：4.1g NaCl溶解于80ml H2O,緩慢加入10g CTAB,加水至100ml。2)氯仿:異戊醇(24:1)，酚:氯仿:異戊醇(25:24:1)，異丙醇，70% 乙醇，TE，10% SDS，蛋白酶 K (20mg/ml或粉劑)，5mol/L NaCl。本方法通過(guò)SDS裂解細(xì)胞，蛋白酶降解蛋白，CTAB去除多糖成分一：儀器：同方法一 二：試劑：TE、TAE緩沖液；10%SDS；NaCL；20mg/ml蛋白酶；CTAB/NaCL溶液(10% CTAB，0.7M NaCL 4.1gNaCL 溶于80ml水中，緩慢加入10gCTAB，加熱溶解)；25/24/1,酚/氯仿/異戊醇; 24/1,氯仿/異戊醇；異丙醇；及100%乙醇三：操作 1.5ml 對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)菌細(xì)胞 離心，5000rpm,1min 沉淀 溶于500l TE緩沖液中混勻 30l 10%SDS,3L蛋白酶，混勻，37,1