自身免疫與生殖免疫學習班課件 7 169 李玉葉 子宮內膜免疫組化檢測在不孕不育-Final 李玉葉

1運用免疫組化定量分析子宮內膜免疫細胞譜臨床應用的研究李玉葉liyuye519@163.com

深圳中山泌尿外科醫(yī)院生殖免疫診療中心圍著床期生殖免疫重點實驗室免疫組化在臨床上的應用免疫組化是病理科的常規(guī)輔助技術，如同臨床醫(yī)生依賴B超、CT、MRI一樣，對臨床各類疾病的病理診斷、疾病治療與預后都有非常重要的意義。0102腫瘤診斷感染性疾病腫瘤診斷、鑒別診斷;協(xié)助診斷腫瘤的良惡性;確定轉移性惡性腫瘤的原發(fā)部位;對某類腫瘤進行進一步的病理分型;指導腫瘤的治療和判斷預后。在感染灶中檢測到病原體，進行原位病因診斷。免疫組化檢測子宮內膜免疫細胞譜診斷意義？

子宮內膜免疫微環(huán)境子宮內膜癌Contents目錄P01臨床意義建立參考范圍P03臨床應用研究P04子宮內膜免疫細胞在妊娠過程中的調節(jié)作用建立正常可孕女性種植窗期子宮內膜免疫細胞的參考范圍對于反復生殖失敗患者的子宮內膜免疫細胞的譜臨床應用的探索運用免疫組化定量分析子宮內膜免疫細胞譜的臨床應用研究P02定量分析運用免疫組化定量分析子宮內膜免疫細胞譜Contents目錄P01臨床意義建立參考范圍P03臨床應用研究P04子宮內膜免疫細胞在妊娠過程中的調節(jié)作用建立正?？稍信苑N植窗期子宮內膜免疫細胞的參考范圍對于反復生殖失敗患者的子宮內膜免疫細胞的診療與追蹤運用免疫組化定量分析子宮內膜免疫細胞譜的臨床應用研究P02定量分析運用免疫組化定量分析子宮內膜免疫細胞譜免疫(Immunity)，顧名思義即免除瘟疫（古代的瘟疫指各種疫?。Ｃ庖呤侵笝C體免疫系統(tǒng)識別自身與異己物質，并通過免疫應答排除抗原性異物，以維持機體生理平衡的功能。免疫的概念免疫在妊娠過程中的調節(jié)作用胚胎可在母體的子宮內生長而不被排斥，又要免受感染，母體對其識別和免疫耐受至關重要。懷孕會讓母親機體進入一個獨特的免疫狀態(tài)MorG,AldoP,etal,NatRevImmunol.

2017Aug;17(8):469-482.胚胎植入孕中期孕晚期免疫在妊娠過程中的調節(jié)作用——時間上的動態(tài)平衡9抑炎促炎抑炎促炎分娩第一階段第二階段第三階段正常妊娠抑炎促炎抑炎促炎分娩早產抑炎促炎促炎早期自然流產抑炎抑炎胚胎種植失敗促炎促炎MorG,AldoP,etal,NatRevImmunol.

2017Aug;17(8):469-482.

——時間上的動態(tài)平衡免疫在妊娠過程中的調節(jié)作用妊娠早期子宮內膜免疫細胞在妊娠過程中的調節(jié)作用定位黏附遷移侵襲TregMacrophagesNeutrophilNKcellsTCD8+TH17DC妊娠早期子宮內膜免疫細胞在妊娠過程中的調節(jié)作用Day19(5%)Day24(25%)妊娠早期(70%)1）促進胚胎粘附和植入，誘導免疫耐受2）調控滋養(yǎng)細胞遷移3）血管新生和重塑4）作為先天性免疫的重要組成部分保護子宮免受感染。12妊娠早期子宮內膜NK細胞的免疫調節(jié)作用

促進滋養(yǎng)層細胞遷移和血管新生

誘導免疫耐受uNK細胞妊娠早期子宮內膜NK細胞的免疫調節(jié)作用

巨噬細胞是（macrophage）是蛻膜中最主要的APC，約占蛻膜淋巴細胞的20-25%。按功能不同，巨噬細胞可分為M1和M2兩種亞型AmericanJournalofReproductiveImmunology63(2010)460–471M1

促炎M2

抑炎14功能：1.免疫防御2.調節(jié)滋養(yǎng)細胞入侵3.血管生成調控4.誘導免疫耐受妊娠早期子宮內膜巨噬細胞的免疫調節(jié)作用CD68+和CD163+巨噬細胞在首次IVF患者的失敗妊娠組中顯著增加。對Total、RM、RIF和不符合診斷人群，CD68+和CD163+巨噬細胞沒有顯著差異。15妊娠早期子宮內膜巨噬細胞的免疫調節(jié)作用Treg細胞1,VignaliDA.etal,NatRevImmunol,2008;2,Aluvihare,V.R.,etal.,20043,Jasper,M.J.,etal.2006;4,Shima,T.,etal.2010妊娠早期子宮內膜Treg細胞的免疫調節(jié)作用種植窗期妊娠早期妊娠晚期Shima,T.,etal.(2010).√Anti-CD25mAbCD25+Treg在種植窗期和妊娠早期起重要作用17ShigeruSaitogroup動物實驗妊娠早期子宮內膜Treg細胞的免疫調節(jié)作用樹突狀細胞（DC）僅占外周血單個核細胞的0.1-0.5%，占蛻膜細胞的1-2%按功能不同，DC細胞可分為兩種亞群：非成熟DC（imDC，CD1a）抑炎，誘導免疫耐受成熟DC（mDC，CD83）

促炎，免疫防御，誘導免疫排斥

功能：1.抗原遞呈2.誘導免疫耐受3.血管新生

JournalofReproductiveImmunology88(2011)86–9218妊娠早期子宮內膜樹突狀細胞的免疫調節(jié)作用PercentageofpositivecellsCD1aCD83ControlRMRIFControlRMRIFPercentageofpositivecellsunpublisheddata子宮內膜成熟型DC增加可能與反復流產和種植失敗的發(fā)病機制有關19妊娠早期子宮內膜樹突狀細胞的免疫調節(jié)作用促/抑炎因子偏向于抑炎胚胎侵入子宮內膜能力降低子宮內膜粘附分子、整合素表達降低血管生成降低妊娠失敗母胎界面免疫細胞活化攻擊和殺傷滋養(yǎng)細胞絨毛血管血栓形成促/抑炎因子偏向于促炎TheLancet

351.9117(1998):1670-1672.Seminarsinimmunopathology.Vol.38.No.6.SpringerBerlinHeidelberg,2016.妊娠早期子宮內膜免疫細胞的作用NK細胞，巨噬細胞，CD8+T細胞，DC細胞NK細胞，巨噬細胞，CD8+T細胞，Treg細胞在妊娠早期，子宮內膜免疫細胞主要發(fā)揮以下作用：免疫耐受；避免胎兒感染；滋養(yǎng)層侵襲；血管生長；組織修復等。子宮內膜免疫細胞在胚胎種植及早期發(fā)育過程中發(fā)揮重要作用。若數量發(fā)生異常，則會導致母體對胎兒的免疫排斥，胎兒的感染或新生血管不足，胎兒發(fā)育停止等，最終導致不良妊娠結局的發(fā)生。因此評估子宮內膜免疫細胞譜可以充分了解種植窗期子宮內膜免疫微環(huán)境的平衡及穩(wěn)定狀態(tài)，臨床醫(yī)生可以及時通過藥物糾正患者的異常免疫反應。小結Contents目錄P01臨床意義建立參考范圍P03臨床應用研究P04子宮內膜免疫細胞在妊娠過程中的調節(jié)作用建立正?？稍信苑N植窗期子宮內膜免疫細胞的參考范圍對于反復生殖失敗患者的子宮內膜免疫細胞的診療與追蹤運用免疫組化定量分析種子宮內膜免疫細胞譜的臨床應用研究P02定量分析運用免疫組化定量分析子宮內膜免疫細胞譜Part2運用免疫組化定量分析子宮內膜免疫細胞譜2.1

為什么做子宮內膜免疫細胞譜的定量分析？2.2如何通過免疫組化實現(xiàn)子宮內膜免疫細胞譜的定量分析？2.3

如何進行免疫組化定量分析的質量控制？腫瘤組織---有或無

CD56+NK細胞定性分析

健康人子宮內膜和妊娠失敗子宮內膜CD138+

漿細胞定性分析定量分析2.1為什么做子宮內膜免疫細胞譜的定量分析？在健康人群中，胚胎種植窗期，子宮內膜聚集了大量的免疫細胞以幫助胚胎種植與生長。而研究證明在復發(fā)性流產及反復種植失敗患者中，子宮內膜免疫細胞如NK細胞，CD8+T細胞，M1型巨噬細胞等顯著增加，Treg細胞，耐受型樹突狀細胞明顯減少。由此可看出妊娠失敗患者子宮內膜免疫細胞并不是有或無的關系，無法靠定性去判斷患者的子宮內膜免疫細胞異常情況。CD56CD68Foxp3CD8CD1aCD83子宮內膜免疫細胞譜的定量分析為臨床醫(yī)生提供更加準確的診斷！2.1為什么做子宮內膜免疫細胞譜的定量分析？檢測方法優(yōu)點缺點流式細胞術可以較客觀的計算出陽性細胞的百分率在細胞懸液的制作過程中，會丟失部分細胞，并且酶消化處理等步驟可能會影響目標分子的水平免疫組化保留了原始樣本，不僅可以觀察表達情況，還可以觀察陽性信號的分布情況。并且更易于臨床應用。結果分析較主觀，并且目前結果展示方法各異。其中包括？個陽性細胞/mm2、？個陽性細胞/視野、陽性細胞百分比等定量分析方法的選擇2.2如何通過免疫組化實現(xiàn)子宮內膜免疫細胞譜的定量分析？27免疫組化定量分析臨床檢測應用難點引進PE多光譜數字化病理分析系統(tǒng)Leica自動染色儀免疫組化自動化檢測與分析平臺多光譜數字化病理分析系統(tǒng)分析前分析后陽性細胞數：45總細胞數：2344陽性細胞率：1.92%多光譜數字化病理分析系統(tǒng)圖

2.隨機選擇不同的30個視野分析的結果比較31/50臨床問題：檢測平臺的穩(wěn)定性圖

1.30個視野與全片掃描的結果比較分析前01分析后03分析中02所有的標本固定取樣時間（黃體中期取樣）、大?。ㄍ粡S家子宮內膜取樣管，所有操作統(tǒng)一培訓）自動化檢測與分析（自動免疫組化染色儀，自動數字化病理分析系統(tǒng)）、標準操作流程、質控片、根據WHO推薦公式制定人員質控標準、設備定期維護及不同批次試劑間的驗證分析患者疾病狀態(tài)與檢測數據的相關性，如BMI，內異癥，內膜炎等。異常報告追蹤患者病史，與臨床醫(yī)生討論2.3

如何進行免疫組化定量分析的質量控制？每批次質控指標每月質控指標

每年質控指標1.1.利用既往數據繪制質控片與初診患者均值L-J質控圖，患者異常率折線圖。1.2每批次質控片檢測值、初診均值、患者異常率，列出患者數據明細，對于異常患者特別匯報及討論。2.1利用既往數據繪制質控片與初診患者均值L-J質控圖，患者異常率折線圖。2.2每月質控片檢測值、初診均值、患者異常率。3.1繪制近3年的初診患者均值L-J質控圖，患者異常率折線圖3.2與上一年度比較，看全年的初診患者均值，患者異常率，通過不同年份的數據分析比較尋找數據波動的原因，總結上年度新計劃、新改動的實施效果等。2.3如何進行免疫組化定量分析的質量控制？免疫組化定量分析種植窗期子宮內膜免疫細胞數量可應用于臨床檢測。免疫組化定量分析質量控制尤為重要，自動化的免疫組化實驗與分析平臺為質量控制提供了基礎，子宮內膜免疫細胞數量特有的質控分析體系為檢測的穩(wěn)定性提供保障。

小結Contents目錄P01臨床意義建立參考范圍P03臨床應用研究P04子宮內膜免疫細胞在妊娠過程中的調節(jié)作用建立正?？稍信苑N植窗期子宮內膜免疫細胞的參考范圍對于反復生殖失敗患者的子宮內膜免疫細胞的譜臨床應用的探索運用免疫組化定量分析子宮內膜免疫細胞譜的臨床應用研究P02定量分析運用免疫組化定量分析子宮內膜免疫細胞譜CLSI(美國臨床實驗室標準化委員會)最新制定的指南C28-A3中指出建立參考區(qū)間的基本過程為：(1)選擇參考人群；----第一周期行IVF成功并繼續(xù)妊娠的患者(2)篩選參考個體；----排除影響內膜免疫狀態(tài)的疾病(3)形成參考樣本組；----將符合條件的患者納入對照組(4)獲得參考值；(5)得到參考分布、參考限和參考區(qū)間。Part3建立正常可孕女性種植窗期子宮內膜免疫細胞的參考范圍（一）入選標準1.來生殖中心行IVF初診的育齡女性，患者年齡：≤40歲；2.HE染色結果顯示：子宮內膜腺體與間質反應一致，黃體中期；4.子宮內膜厚度＞7mm；5.移植胚胎時間距離活檢子宮內膜組織＜3個月；4.簽署手術知情同意書行IVF第一周期滿3個月繼續(xù)妊娠。（二）排除標準1.≥2次人流或藥流；2.≥2次生化妊娠丟失；3.外院IVF移植未孕；4.影響宮腔環(huán)境的因素：輸卵管炎，子宮內膜炎，巧克力囊腫，子宮內膜異位癥或做過子宮內膜異位癥相關手術，子宮息肉或做過息肉相關手術，腺肌癥，多囊卵巢綜合癥，疤痕子宮（有憩室或月經拖尾），促排卵時發(fā)現(xiàn)有積水包括宮腔積水和輸卵管積水等。入選不少于120例正?？稍信缘娜脒x標準及排除標準可孕女性CD56CD68Foxp3CD83CD1aCD8子宮內膜免疫細胞在可孕女性中的表達情況子宮內膜免疫細胞譜參考范圍取正?？稍信缘腜5-P95區(qū)間，為子宮內膜各免疫細胞的參考范圍。反復流產患者RM患者對于每個患者而言，其異常的免疫細胞類別是各不相同的子宮內膜免疫細胞譜參考范圍反復種植失敗患者RIF患者對于每個患者而言，其異常的免疫細胞類別是各不相同的子宮內膜免疫細胞譜參考范圍42子宮內膜各種免疫細胞異常率Part4對于反復生殖失敗患者的子宮內膜免疫細胞的譜臨床應用的探索治療目標：子宮內膜免疫細胞回歸穩(wěn)態(tài)妊娠失敗的一種表現(xiàn)：內膜免疫細胞失衡按照百分位分數計算CD56與妊娠結局的關系N=112生化妊娠率臨床妊娠率<P25<2.430/00/0P25-P502.43-4.782/1020%1/1010%P50-P754.78-10.6724/4949%19/4939%P75-P9510.67-21.1627/4363%25/4358%>P95>21.163/1030%2/1020%

根據患者妊娠結局再次確認參考范圍的有效性，以CD56為例51.9%患者服用糖皮質激素后uNK顯著下降。QuenbyS,etal.FertilityandSterility.2005(84),4Data