實驗3植物葉片活細胞和葉綠體的分離提取及觀察ppt課件

實驗四植物葉片活細胞和葉綠體的分離提取及觀察 CollegeofLifeScienceandTechnology XINJIANGUnivercity 一 實驗?zāi)康?初步掌握運用機械法分離活細胞和細胞器的方法 掌握運用差速離心或密度梯度離心分離純化葉肉細胞 細胞核 葉綠體的方法 掌握分離的細胞的活性鑒別方法 熟悉葉肉細胞或原生質(zhì)體 細胞核 葉綠體的形態(tài)大小 二 實驗原理 細胞器的分離是研究細胞器的結(jié)構(gòu) 功能和化學(xué)組成的技術(shù)基礎(chǔ) 保持分離的細胞器的純度 結(jié)構(gòu)完整及其生理 生化活性是本實驗的三大要素 細胞核是植物細胞中最大 最重要的細胞器 使細胞各種生命活動的指揮中心 葉綠體是植物細胞進行光合作用 將光能轉(zhuǎn)變成化學(xué)能的重要細胞器 由于它們的重要功能 所以它們一直是細胞生物學(xué) 遺傳學(xué) 和分子生物學(xué)研究的重要對象 利用離心技術(shù)可分離 純化細胞 細胞核和葉綠體 將組織勻漿后懸浮在等滲介質(zhì)中進行差速離心 是分離各種細胞器的常用方法 顆粒在離心場中的沉降速率取決于顆粒的大小 形狀和密度 也與離心力以及懸浮介質(zhì)的粘度有關(guān) 在一給定的離心場中 一定時間內(nèi) 密度和大小不同的顆粒其沉降速率不同 依次增加離心力和離心時間 能使非均一懸浮液中的顆粒按其大小 密度先后分批沉降在離心管底部 分批收集即可獲得各種亞細胞組分 最先沉淀的是細胞 其次是細胞核 接下來是葉綠體 懸浮介質(zhì)通常用緩沖的等滲溶液 它與細胞質(zhì)的分散相接近 在一定程度上能保持細胞器的真實結(jié)構(gòu)和酶的活性 二 實驗原理 三 實驗用具和試劑 1 儀器 組織搗碎機 高速冷凍離心機 托盤天平 普通光學(xué)顯微鏡 剪刀 培養(yǎng)皿 250ml燒杯 量筒 玻璃漏斗 移液管 離心管 滴管 濾紙 紗布一大塊或400目尼龍網(wǎng) 載玻片 蓋玻片 2 試劑 SNT溶液 0 4M蔗糖 0 01MNaCl 0 05MTris HCL緩沖液 0 2MTris 三羥甲基氨基甲烷 50ml0 1NHCL50 55ml兩液混勻后 加蒸餾水至200ml pH7 6 1 3000中性紅染液 稱取0 5中性紅溶于50mlRinger溶液 稍加熱 30 400C 使之很快溶解 用濾紙過濾 裝入棕色瓶于暗處保存 否則易氧化沉淀 失去染色能力 臨用前 取已配制的1 中性紅溶液1ml 加入29mlRinger溶液混勻 裝入棕色瓶備用 香柏油3 材料 新鮮菠菜 三 實驗用具和試劑 四 實驗內(nèi)容 1 組織勻漿液的制備 組織搗碎法 2 細胞及細胞器 細胞核 葉綠體等 的分離 純化 離心分離法 3 細胞 細胞核 葉綠體的鏡檢 根據(jù)形態(tài) 大小 分布位置 數(shù)量識別法 4 分離細胞活性的鑒別 中性紅活體染色法 五 實驗方法和步驟 1 取材 取新鮮的嫩菠菜葉 洗凈擦干后 除葉梗及粗脈 剪成0 5x0 5cm小塊 2 勻漿 將稱取60g葉片小塊放入組織搗碎機套筒內(nèi) 加入200mlSNT溶液 勻漿20秒 最高速度 制成勻漿液 3 過濾 將勻漿液經(jīng)四層紗布過濾 或400目尼龍網(wǎng)過濾 濾液分裝離心管 平衡 4 離心 濾液 200 g 1000rpm 分 1分 沉淀1上清 平衡 離心 含葉肉細胞 500 g 1500rpm 分 1分 沉淀2 含細胞核 上清 平衡 離心 1000 g 3000rpm 分 5分 沉淀3上清 棄 含大量葉綠體 5 懸浮 分別收集沉淀 用少量的SNT溶液分別將沉淀1 2 3懸浮 6 鏡檢 取懸浮液1 2分別做滴片鏡檢 然后加幾滴中性紅染色5 10min 蓋上蓋玻片鏡檢 取懸浮液3做滴片蓋上蓋玻片 用油鏡觀察 六 實驗結(jié)果 1 在普通光學(xué)顯微鏡下 在懸浮液1滴片中可以看到含細胞核和大量葉綠體的葉肉細胞 形態(tài)為球形或橢圓形的原生質(zhì)體 2 在普通光學(xué)顯微鏡下 在懸浮液2滴片中可以看到細胞核 形態(tài)為球形 3 在普通光學(xué)下 在懸浮液1 2滴片中性紅染色可以鑒別活細胞及細胞核 中性紅是液泡系特殊的活體染色劑 在細胞處于生活狀態(tài)時 中性紅只將液泡染成紅色 而細胞質(zhì)及細胞核不著色 如果細胞死亡 紅色會彌散在整個細胞中 4 在普通光學(xué)顯微鏡下 在懸浮液3滴片中可以看到葉綠體 葉綠體為綠色橢圓形 在高倍鏡下可以看到葉綠體內(nèi)部含有較深的綠色小顆粒 即基粒 七 實驗注意事項 1 細胞和各種細胞器的分離應(yīng)在等滲溶液中進行 以免滲透壓的改變使細胞和細胞器的受到損傷 2 要注意整個實驗的分離過程必須在0 5 的條件下進行 避免酶的失活 如果在室溫下 要迅速分離和觀察 3 離心過程中要注意離心力和離心時間 得到結(jié)構(gòu)真實 完整并具生理 生化活性的細胞器應(yīng)注意的問題 八 實驗作業(yè) 1 繪制出一個完整的葉肉細胞圖 內(nèi)含細胞核 葉綠體 2 得到結(jié)構(gòu)真實 完整并具生理 生化活性的細胞器應(yīng)注意哪些問題 談?wù)凷NT溶液中的各種成分的作用 3 分離各種細胞器所需的相對離心