PCR(級研究生).ppt

1,PolymeraseChainReaction（PCR),聚合酶鏈反應,Departmentofbiochemistryandmolecularbiology,DNA，生命的藍圖,引物酶,引物酶,DNA聚合酶,DNA聚合酶,故事發(fā)生在1983年的春夏之交,Mullis開車的時候,瞬間感覺兩排路燈就是DNA的兩條鏈，自己的車和對面開來的車象是DNA聚合酶，面對面地合成著DNA，,Mullis的第一個PCR實驗,1983年9月中旬。Mullis在反應體系中加入DNA聚合酶后在37一直保溫。結果第二天在瓊脂糖電泳上沒有看到任何條帶。于是他認識到有必要用加熱來解鏈，每次解鏈后再加入DNA聚合酶進行反應，依次循環(huán)。1983年12月，他終于看到了被同位素標記的PCR條帶。,KaryB.Mullis,1989年美國Science雜志列PCR為十余項重大科學發(fā)明之首,比喻1989年為PCR爆炸年,Mullis榮獲1993年度諾貝爾化學獎。,由一對引物介導,通過溫度的調(diào)節(jié)，使雙鏈DNA變性為單鏈DNA、單鏈DNA與引物復性（退火）成為引物-DNA單鏈復合物、以及在dNTPs存在下DNA聚合酶使引物延伸而成為雙鏈DNA（引物的延伸）；這種熱變性-復性-延伸的過程，就是一個PCR循環(huán)；一般通過2030個循環(huán)之后，就可獲得大量（106倍）的要擴增的DNA片段。又稱為無細胞分子克隆技術、基因擴增技術或DNA擴增技術。Pg水平至ng水平。,第一節(jié)PCR基本原理,一、PCR的基本原理,DNA體外的快速擴增技術,模板DNA,PCR的基本原理,PCR反應條件PCR過程PCR的特點,引物1,引物2,PCR的基本原理,PCR反應條件PCR過程PCR的特點,引物1,引物2,Taq酶,Taq酶,PCR的基本原理,PCR反應條件PCR過程PCR的特點,第1輪結束,第2輪開始,PCR的基本原理,PCR反應條件PCR過程PCR的特點,Taq,Taq,Taq,Taq,PCR的基本原理,PCR反應條件PCR過程PCR的特點,第2輪結束,PCR的基本原理,PCR反應條件PCR過程PCR的特點,模板DNA,第1輪擴增,第2輪擴增,第3輪擴增,第4輪擴增,第5輪擴增,第6輪擴增,理想拷貝數(shù)=2nn循環(huán)次數(shù)實際拷貝數(shù)=(1+x)nX平均效率,約為0.85n循環(huán)次數(shù),20,第二節(jié)、PCR的過程,（一）DNA模板的解鏈（變性）9095，30s理論上，在90左右能使DNA雙鏈之間的所有氫鍵鏈斷開，完全分離為單鏈；且在中性pH情況下，DNA的完整性仍能很好保存。,（二）DNA單鏈與引物的退火（復性）5565,3045s引物與模板單鏈特異性結合（較高的溫度）；不希望兩條互補的模板單鏈結合在一起（DNA引物的量大大超過模板的量，競爭性結合：引物+模板幾率DNA自身復性幾率）;,（三）引物的延伸（新鏈DNA的合成）7075，3060s（2kb)首次循環(huán)：引物從3端開始延伸，延伸片段的5端為人工合成引物是特定的，3端沒有固定的終止點，長短不一。第二個循環(huán)：引物與新鏈結合，由于后者5端序列是固定的末端，意味著5端的序列就成為此次延伸片段3端的終止點。N個循環(huán)后：由于多數(shù)擴增產(chǎn)物受到所加引物5端的限定，產(chǎn)物的序列是介于兩種引物5端之間的區(qū)域。引物本身也是新生DNA鏈的一部分。,SynthesisbyDNApolymerase-ATGCATGCATGC*,A,C,G,-T,PolymeraseChainReaction-PCR,SpecificshortDNAprimerannealstostrandtobecopied,5,3,SynthesisbyDNApolymerase-ATGCATGCATGC*,A,C,G,T,-T,PolymeraseChainReaction-PCR,5,3,SynthesisbyDNApolymerase-ATGCATGCATGC*,A,C,G,T,-T,A,PolymeraseChainReaction-PCR,5,3,SynthesisbyDNApolymerase-ATGCATGCATGC*,A,C,G,T,-T,A,C,PolymeraseChainReaction-PCR,5,3,SynthesisbyDNApolymerase-ATGCATGCATGC*,A,C,G,T,-T,A,C,G,PolymeraseChainReaction-PCR,5,3,SynthesisbyDNApolymerase-ATGCATGCATGC*,A,C,G,T,-T,A,C,G,T,PolymeraseChainReaction-PCR,5,3,SynthesisbyDNApolymerase-ATGCATGCATGC*,A,C,G,T,-T,A,C,G,T,A,PolymeraseChainReaction-PCR,5,3,高度的特異性：引物的限定，高溫擴增。高度的敏感性：微量樣品（單拷貝基因、單個細胞、一根頭發(fā)等），高效性（X106）。操作簡便快速，易于自動化、程序化，方法穩(wěn)定。對標本的純度要求底：純化或粗制的，新鮮或陳舊的，各種細胞，體液，完整的或降解的DNA。,PCR技術的特點,特異性強,PCR反應的特異性決定因素為：引物與模板DNA特異正確的結合；堿基配對原則；TaqDNA聚合酶合成反應的忠實性；靶基因的特異性與保守性。,靈敏度高PCR產(chǎn)物的生成量是以指數(shù)方式增加的，能將皮克(pg)量級的起始待測模板擴增到微克(g)水平。能從100萬個細胞中檢出一個靶細胞；在病毒的檢測中，PCR的靈敏度可達3個RFU(空斑形成單位)；在細菌學中最小檢出率為3個細菌。,簡便、快速PCR反應用耐高溫的TaqDNA聚合酶，一次性地將反應液加好后，即在DNA擴增液和水浴鍋上進行變性-退火-延伸反應，一般在24小時完成擴增反應。擴增產(chǎn)物一般用電泳分析，不一定要用同位素，無放射性污染、易推廣。,對標本的純度要求低不需要分離病毒或細菌及培養(yǎng)細胞，DNA粗制品及總RNA均可作為擴增模板?？芍苯佑门R床標本如血液、體腔液、洗嗽液、毛發(fā)、細胞、活組織等粗制的DNA擴增檢測。,PCR反應,第三節(jié)、PCR擴增的基本方法,（一）PCR反應體系1.儀器臺式微量離心機基因擴增儀微量塑料離心管：0.5ml或1.5ml（經(jīng)高壓滅菌）微量加樣器（pipetman）：20P、200P、1000P，電泳儀及電泳槽、紫外攝影裝置、乳膠或塑料手套、Tip若干,PCR,Agarosegelelectrophoresis,Thefinalproduct,UVvisualisation,3-4hours,2.試劑與試樣：一般選用50100l體積，模板核酸（template如：人基因組DNA0.1g)擴增引物（primer一對,各0.21mol/L）TaqDNA聚合酶（2.5U）dNTP（四種：各20200mol/L)標準的緩沖液：10Xbuffer（KCl、Tris-HCl、MgCl2、BSA或DDT）無菌雙蒸水或三蒸水石蠟油或礦物油:3050ul（封閉、防止高溫時液體的揮發(fā)）,2.PCR反應試劑,（1）模板單、雙鏈DNA均可。不能混有蛋白酶、核酸酶、DNA聚合酶抑制劑、DNA結合蛋白類。一般100ngDNA模板/100L。模板濃度過高會導致反應的非特異性增加。,（2）引物濃度0.2-1mol/L濃度過高易導致模板與引物錯配,反應特異性下降。（3）TaqDNA聚合酶（thermusaquaticus)0.5-2.5U/50l酶量增加使反應特異性下降;酶量過少影響反應產(chǎn)量。,（4）dNTPdNTP濃度取決于擴增片段的長度四種dNTP濃度應相等濃度過高易產(chǎn)生錯誤堿基的摻入，濃度過低則降低反應產(chǎn)量dNTP可與Mg2+結合，使游離的Mg2+濃度下降，影響DNA聚合酶的活性。,（5）Mg2+,Mg2+是DNA聚合酶的激活劑。0.5mmol/L-2.5mmol/L反應體系。Mg2+濃度過低會使Taq酶活性喪失、PCR產(chǎn)量下降；Mg2+過高影響反應特異性。Mg2+可與負離子結合，所以反應體系中dNTP、EDTA等的濃度影響反應中游離的Mg2+濃度。,PCR反應體系,1、10PCRbuffer10l2、dNTPmix各200mol/L3、引物11mol/L4、引物21mol/L5、DNA模板50ng-1g6、Taq酶2U7、加雙蒸水至總體積為100l,（二）常規(guī)PCR的反應條件預變性：94300s（高溫起動:充分變性，防止非特異性擴增）變性：90-95，30s-60s退火：55-6530s-45s延伸：70-7230-60s（5ng溴化乙錠太多，凝膠染色過深，核酸電泳帶看不清時，可將凝膠放入蒸餾水浸泡30min后再觀察,酶切分析,根據(jù)PCR產(chǎn)物中限制性內(nèi)切酶的位點，用相應的酶進行酶切酶切產(chǎn)物電泳分離后，獲得符合理論的片段此法既能進行產(chǎn)物的鑒定，又能對靶基因分型，還能進行變異性研究,PCR-RFLP,分子雜交,檢測PCR產(chǎn)物特異性的有力證據(jù)檢測PCR產(chǎn)物堿基突變的有效方法主要的雜交Southern印跡雜交斑點雜交,Southern印跡雜交：,在兩引物之間另合成一條寡核苷酸鏈并作標記（探針）與PCR產(chǎn)物雜交此法既可作特異性鑒定，又可以提高檢測PCR產(chǎn)物的靈敏度。,斑點雜交：,將PCR產(chǎn)物點在硝酸纖維素膜或尼龍膜薄膜上寡核苷酸探針雜交觀察有無著色斑點主要用于PCR產(chǎn)物特異性鑒定及變異分析,RDB檢測-地中海貧血突變基因,-29（AG）-28（AG）17（AT，AAGTAG）E（CD26GAGAAG）IVS-I-1（GT）IVS-I-5（GC）27-28（+C）41-42（-CTTT）43（GT）71-72（+A或+T）654（CT）,微孔板夾心雜交法,通過一固定于微孔板的捕獲探針與PCR產(chǎn)物的某一區(qū)域特異性雜交，使PCR產(chǎn)物間接地固定于微孔板上，然后，再用一生物素等非放射性標記物標記的檢測探針與產(chǎn)物的另一區(qū)域特異性雜交，漂洗后顯色即可判斷結果該法使用了兩個雜交過程來檢測一個產(chǎn)物，其特異性較一次雜交的檢測法高,Principle,：NOS（11014/cm2）N-羥化琥珀酰亞胺酯,Principle,-CCCCCC,CaptureProbe:,：NH2,DetectionProbe:,：Biotin,：NH2標記的探針,：Biotin標記的探針,Avidin-HRP顯色系統(tǒng),：NOS基團,Principle,PCR-ELISA法：,本法避免了電泳和雜交的步驟，適于常規(guī)ELISA記數(shù)儀檢測5端修飾后仍可進行常規(guī)PCR擴增特異靶序列，因此，可以通過修飾其中一個引物的5端使其攜帶便于PCR產(chǎn)物固定的功能基團，而通過另一引物5端的修飾使產(chǎn)物便于檢測,Sequence,ThespecificmethodshouldbeROBUSTRe-optimiseforeachsetofprimers,第四節(jié)PCR的優(yōu)化OPTIMISEPCRCONDITIONS,X,OptimisingthePCRReaction,Startingnucleicacid-DNA/RNATissue,cells,blood,hairroot,saliva,semenThermo-stableDNApolymeraseOligonucleotidesprimersTheconcentrationofMg2+inthereactionTheannealingtemperature,（一）DNA聚合酶(最關鍵因素之一)1、Taq-DNA聚合酶的熱穩(wěn)定性及最適延伸溫度在7080具有最高聚合活性，高溫時仍比較穩(wěn)定。所以7080為其最適延伸溫度，則退火和延伸反應溫度可提高，限制了非特異性擴增產(chǎn)物的出現(xiàn)，增加了PCR的特異性。,2、Taq-DNA聚合酶的功能有53聚合酶活性有53外切酶活性無35外切酶活性Taq-DNA聚合酶TaqDNA酶的聚合出錯率較高（2.1X10-4），然而通過優(yōu)化反應條件，可使Taq酶的聚合出錯率降低到原來的1/3。若要細胞克隆PCR擴增的產(chǎn)物，進行表達，擴增后必須測序證實才可使用。,3、激活劑與抑制劑Taq-DNA聚合酶：其活性需要Mg2+。Mg2+的精確濃度主要取決dNTP濃度Mg2+濃度過高導致非特異擴增。一般常用1.5mmol/L,4、其他耐熱DNA聚合酶TthDNA聚合酶（Thermusthermophilus）：在較高的溫度下仍具有逆轉錄酶活性，因此能很好地克服RNA鏈中普遍存在二級結構的難題。VentDNA聚合酶：具有校讀功能，具有相對較好的高保真性。SacDNA聚合酶：FDDNA聚合酶：,（二）引物（寡核苷酸引物）引物：引物是PCR特異性反應的關鍵，PCR產(chǎn)物的特異性取決于引物與模板DNA互補的程度。理論上，只要知道任何一段模板DNA序列，就能按其設計互補的寡核苷酸鏈做引物，利用PCR就可將模板DNA在體外大量擴增。引物的作用：決定PCR擴增產(chǎn)物的特異性與長度，決定PCR反應的成敗。,PCR引物的設計一般原則,引物長度一般以1830bp為宜，過短則降低特異性，過長則會引起引物間的退火而影響有效擴增，同時也增加引物合成的成本。引物間退火溫度相差不要超過5。避免引物內(nèi)部出現(xiàn)二級結構，避免序列內(nèi)有較長的回文結構，使引物自身不能形成發(fā)夾結構。G/C和A/T堿基均勻分布，G+C含量在4060%之間，引物堿基序列盡可能選擇堿基隨機分布，避免出現(xiàn)嘌呤或嘧啶連續(xù)排列。,Avoidrepeatsequences,5,5,3,3,notargetPCRproduct,PCR,hairpinloopformation,5-NNNNNNNNNNNGCATGC-35-NNNNNNNNNNNNNNNNN-3,5-NNNNNNNNNNNGCA3-CGT,5,3,要避免兩個引物間特別是3末端堿基序列互補以及同一引物自身3末端堿基序列互補的，使它們不能形成引物二聚體或發(fā)卡結構。引物3末端堿基一般應與模板DNA嚴格配對，并且3末端為G、C或T時引發(fā)效率較高。引物5末端堿基可不與模板DNA匹配，可添加與模板無關的序列(如限制性核酸內(nèi)切酶的識別序列、ATG起始密碼子或啟動子序列等)，便于克隆和表達，但其保護堿基有一定的要求。引物的堿基順序不能與非擴增區(qū)有同源性。,Avoidrepeatsequences,5,5,3,3,5,5,3,3,primerdimer,PCR,3repeat,5-NNNNNNNNNNNNNTATA-35-NNNNNNNNNNNNNTATA-3,5-NNNNNNNNTATA-33-ATATNNNNNNNN-5,Avoidrepeatsequences,5,5,3,3,noextension,PCR,5repeat,5-TATANNNNNNNNNNNNN-35-TATANNNNNNNNNNNNN-3,5-TATANNNNNNNN-33-NNNNNNNNATAT-5,5,5,3,3,其他：簡并引物：多種寡核苷酸組成的混合物，彼此之間僅有一個或數(shù)個核苷酸的差異。嵌套引物（巢式PCR）：使DNA序列得到有效的選擇性擴增。,86,NestedPCR:toincreasespecificity,Firstroundprimers,FirstroundPCR,Secondroundprimers,SecondroundPCR,Geneofinterest,（三）模板,模板核酸的量與純化程度，是PCR成敗與否的關鍵環(huán)節(jié)之一。,PCR模板制備與純化,上述粗樣品含有大量的PCR反應抑制物質(zhì)，因此如何去除這些種類繁多的抑制劑或者添加必要的PCR反應增強劑顯得十分重要。,PCR模板制備與純化,從各種粗樣品中去除PCR反應抑制劑的程序不盡相同，但常用的手段包括：,（四）脫氧三磷酸核苷酸（dNTPs）,(五）Mg2+Taq酶活性所必需，游離的,Mg2+的標準使用范圍：0.5-10mM,特異性的改進：降低Mg2+濃度，但要注意過低的Mg2+濃度又會影響擴增產(chǎn)物的產(chǎn)量。,有效性的改進：提高Mg2+濃度，但過量Mg2+將導致非特異性擴增,Mg2+的濃度影響擴增產(chǎn)物的特異性、引物退火、引物二聚體的形成、熔點溫度、酶的活性和準確性。因此，PCR反應系統(tǒng)的主要優(yōu)化參數(shù)是Mg2+的濃度。,(六）PCR的熱循環(huán)計劃,PCR反應條件的選擇,PCR反應條件為溫度、時間和循環(huán)次數(shù)。溫度與時間的設置：基于PCR原理三步驟（DNA變性、引物退火和反應延伸）而設置變性-退火-延伸三個溫度點。雙鏈DNA在9095變性，再迅速冷卻至4060，引物退火并結合到靶序列上，然后升溫至7075，在TaqDNA聚合酶的作用下，使引物鏈沿模板延伸。,退火雜交溫度和時間,退火溫度是影響PCR特異性的較重要因素,特異性的改進：提高退火溫度（比建議退火溫度提高2-5）；減少退火時間。過長的退火時間在正常情況下并不能提高產(chǎn)量，只會增加非特異性引物雜交的可能性。,退火溫度與時間，取決于引物的長度、堿基組成及其濃度，還有模板的長度。,OptimisingtheAnnealingTemperature,Primershaveacalculatedannealingtemperature(e.g.54C)TemperaturemustbeconfirmedpracticallyTemperaturestepsof2CaboveandbelowUsegradientcycler,循環(huán)次數(shù),決定PCR擴增程度主要取決于模板DNA的濃度選在2540次之間,影響的主要因素包括,擴增底物（引物和dNTPs）有效濃度的下降,非特異性產(chǎn)物或引物二聚體對反應試劑的競爭作用,反應試劑的穩(wěn)定性,擴增產(chǎn)物抑制作用,高濃度產(chǎn)物的退活作用以及不完全變性,第五節(jié)PCR中應注意的事項,（一）防止污染試劑小量分裝吸頭及EP管一次性使用器皿及工作區(qū)域要分開，無菌操作（二）設立對照：陽性對照：陽性模板陰性對照：陰性模板,第六節(jié)PCR技術類型,反向PCR錨定PCR不對稱PCR原位PCRRT-PCR重組PCR差異顯示PCR免疫PCR實時定量PCR多重PCR,1)反向PCR(reversePCR),是用反向的互補引物來擴增兩引物以外的DNA片段對某個已知DNA片段兩側的未知序列進行擴增。可對未知序列擴增后進行分析,如探索鄰接已知DNA片段的序列；用于僅知部分序列的全長cDNA的克隆,擴增基因文庫的插入DNA；建立基因組步移文庫。,已知序列,未知序列,未知序列,已知序列,未知序列,未知序列,限制酶,限制酶,連接酶,2）不對稱PCR目的：擴增產(chǎn)生特異長度的單鏈DNA。方法：采用兩種不同濃度的引物。分別稱為限制性引物和非限制性引物,其最佳比例一般是0.010.5M,關鍵是限制性引物的絕對量。用途：制備核酸序列測定的模板制備雜交探針基因組DNA結構功能的研究,高濃度引物,低濃度引物,3）RTPCR:是以反轉錄的cDNA作模板所進行的PCR反應,用于測定基因表達的強度和鑒定已轉錄序列是否發(fā)生突變,呈現(xiàn)mRNA多態(tài)性,克隆mRNA的5和3末端序列,以及從非常少量的mRNA樣品構建大容量的cDNA文庫。,標準的RT-PCR程序包括：,mRNA的分離,cDNA反應的引物退火,mRNA反轉錄為cDNA,cDNA的PCR擴增,引物選擇有三種戰(zhàn)略：,基因特異性引物化，最精確靈敏,寡聚dT引物化,隨機六聚體引物化,RDDP（反轉錄酶）引物、4種dNTP,RNase（核酸酶H活性),DDDP（DNA聚合酶活性）4種dNTP,RNA-DNA雜化分子,雙鏈DNA（cDNA第二鏈）,反轉錄為cDNA,原位PCR（1990）,以組織固定處理細胞內(nèi)的DNA或RNA為靶序列，進行PCR反應，不必分離模板DNA或RNA,探針原位雜交,蛋白酶處理,多重PCR（MultiPCR）,加入多對引物，對同一模板的若干區(qū)域進行同時擴增。適用于繪制真核生物龐大基因或基因組中的缺失圖譜，如分子病的臨床輔助診斷。,P1,P2,P3,P4,P1,P2,P3,P4,正常人擴增物,病人擴增物,多對引物的組合必須滿足二個條件：將反應條件較為接近的引物組合在一起，以使反應條件盡量適合所有被擴增片段；同一反應內(nèi)各擴增片段的大小應不同，以便檢測時能通過電泳將各片段分離開。,錨定PCR（AnchoredPCR）,AAAAA3,3GGGGGGGG,錨定引物,錨定PCR又稱為cDNA末端快速擴增PCR，主要用于5端序列未知的cDNA的擴增和克隆。,5,5,5CCCCCCCC,5CCCCCCCC,5,特異性引物,免疫PCR,免疫PCR：結合了PCR擴增體系和以免疫反應原理為基礎的技術，對擴增產(chǎn)物進行特異鑒定和定量分析的反應。（一）寡核苷酸探針檢測系統(tǒng)（二）RNA探針-抗體捕獲系統(tǒng),寡核苷酸探針檢測系統(tǒng),此種系統(tǒng)十分靈敏，它能檢測微板中約10pg的生物素化PCR產(chǎn)物，并且適合應用于任何靶序列。,RNA探針-抗體捕獲系統(tǒng),PCR-RFLP：根據(jù)突變序列是否位于限制性內(nèi)切酶的酶切位點內(nèi)而設計的對PCR產(chǎn)物作限制性片段長度多態(tài)性分析的技術。RFLP：在同種生物不同個體出現(xiàn)不同長度限制性片段類型的現(xiàn)象。,PCR-限制片段長度多態(tài)性,114,PCRmutagenesis(誘變),PCRcanbeusedtointroducedeletionandpointmutations,TwoseparatePCRreactionsareperformed.OnePCRamplifyingthe5