《IDNA的復(fù)制》PPT課件

Chapter4DNAreplication,Keynotes,Semi-conservativemechanismReplicons,originsandterminiSemi-discontinuousreplicationRNApriming,BasiccharactersofDNAreplication(基本特征）TheenzymeofDNAreplication（酶學(xué)）TheprocessofDNAreplication（過程）Reversetranscription（反轉(zhuǎn)錄）,DNA復(fù)制的基本特征,Template,四種dATP,dGTP,dCTP,dTTP為前體，二價金屬離子Mg2+(或Mn2+)，按照堿基互補配對規(guī)則復(fù)制產(chǎn)生子鏈解鏈復(fù)制方式為半保留復(fù)制（semi-conservativereplication）需要引物（primer）復(fù)制方向總是5-3復(fù)制子（replicon)復(fù)制的方向：一般為雙向半不連續(xù)性：岡崎片斷(Okazakifragment)具有高度的忠實性,圖4-1DNA復(fù)制可能的三種方式以及Meselson和Stahl實驗的可能結(jié)果,半保留復(fù)制,1958年，Meselson和Stahl首次用實驗證實了DNA的半保留復(fù)制。用普通培養(yǎng)基（14N）培養(yǎng)15N標記的大腸桿菌。用CsCl密度梯度離心法分析DNA。抽提子一代DNA分子。,圖4-2Meselson和Stahl實驗的實際結(jié)果,HerbertTaylor在植物根尖細胞中使用放射自顯影證明，真核細胞DNA的復(fù)制方式也是半保留。,復(fù)制子（replicon),復(fù)制子:基因組中能單獨進行復(fù)制的單位。每個起始點到終止點的區(qū)域為一個復(fù)制子。起始點（originofreplication,ori):原核生物DNA分子中只有一個，長度200bp左右。大腸桿菌oriC有245bp。真核生物有多個復(fù)制起始點。三個特征：a）由多個短的重復(fù)序列組成；b)富含AT；c)能夠被特定的復(fù)制起始區(qū)結(jié)合蛋白識別。終點（ter）：通常不固定。,圖4-3證明DNA復(fù)制的方向始終是53的末端終止實驗,圖4-10DNA的半不連續(xù)復(fù)制,OkazakifragmentLeadingstrandLaggingstrand,DNA復(fù)制所需要酶和蛋白質(zhì),DNApolymerase(DNApol)DNA解鏈酶(helicase)：水解ATP獲能解開雙鏈DNA單鏈結(jié)合蛋白(single-strandedbindingprotein,SSB),DNA引發(fā)酶(primase)：RNA引物合成DNA拓撲異構(gòu)酶(topoisomerase)：與超螺旋松馳有關(guān)，改變DNA拓撲性質(zhì)，松馳超螺旋，有利于復(fù)制叉的前進，有型和型，原核、真核中均有。DNA連接酶(ligase)端粒酶(telomerase),原核生物DNA聚合酶（DNApolymerase,DNApol),1957年Kornberg首先從大腸桿菌提取DNApol：聚合作用：5335外切酶活性：校對功能53外切酶活性：引物切除、損傷修復(fù)主要功能是切除引物，填補岡崎片段產(chǎn)生的空隙及DNA損傷的修復(fù)DNApolI具有的聚合酶和5-外切酶活性的配合使用可導(dǎo)致本來一條鏈帶有切口的DNA分子發(fā)生切口平移(nicktranslation)。目前已在E.coli中發(fā)現(xiàn)DNApol、和。,DNApolI催化的缺口平移,DNApol是單一肽鏈的大分子,由polA編碼，分子量為109kD,二級結(jié)構(gòu)以-螺旋為主。用特異的蛋白酶（枯草桿菌蛋白酶subtilisin或胰蛋白酶trpsin）處理，可把DNApol水解為兩個片段。小片段：323個氨基酸殘基，53外切酶活性大片段或稱Klenow片段：605個氨基酸殘基，DNA聚合酶活性和35外切酶活性,圖4-13DNApol的聚合和校對,finger,thumb,palm,DNApol：53聚合酶活性及35外切核酸酶活性，90kDa，由polB基因編碼。DNApol:由10個亞基組成，分別為、及。是原核生物體內(nèi)真正起復(fù)制作用的酶，主要有核心酶和全酶兩種形式。全酶由核心酶、滑動鉗(slidingclamp)和鉗載復(fù)合物(clamp-loadingcomplex)組成。核心酶：由、組成。亞基：由polC(也稱dnaE)基因編碼，53聚合酶活性亞基:由dnaQ基因編碼，35外切酶,校對和編輯為裝配必須PolIII：由核心酶和亞基組成。體內(nèi)PolIII形成二聚體，分別負責(zé)前導(dǎo)鏈和后隨鏈的復(fù)制。鉗載復(fù)合物：由、及亞基組成，具有ATP酶活性，負責(zé)滑動鉗的裝載?；瑒鱼Q：由兩個亞基組成，為環(huán)繞DNA模板而成的環(huán)狀六角星結(jié)構(gòu)。,圖4-14E.coliDNApolIII全酶的結(jié)構(gòu)模型,DNApol和1999年被發(fā)現(xiàn)，屬于易錯的聚合酶，參與DNA的修復(fù)合成。DNApol與DNApolII在細菌生長的穩(wěn)定期被誘導(dǎo)表達，一起修復(fù)該階段DNA損傷DNApol在細菌進行SOS反應(yīng)時被誘導(dǎo)合成。由1個UmuC和2個UmuD組成。,真核生物DNA聚合酶,目前發(fā)現(xiàn)超過15種，最重要的是、和五種。、及四種，都有53聚合功能。及、參與核染色體DNA復(fù)制；：鏈合成的引發(fā)，和：鏈的延長，具3-外切酶活性，校對功能。PCNA(proliferatingcellnuclearantigen)為的輔助蛋白，三個亞基組成滑動鉗，以提高的進行性。：兩個結(jié)構(gòu)域，N-端為5-脫氧核糖磷酸酶和與單鏈DNA結(jié)合的活性；C-端具聚合酶活性。參與DNA損傷的修復(fù)，增補DNA鏈上短的空隙。：線粒體DNA復(fù)制和損傷修復(fù)，具聚合酶、3-外切酶和5-脫氧核糖磷酸酶活性。,端粒與端粒酶(telomerase),Telomere:真核生物線性染色體3-末端的一種特殊結(jié)構(gòu)，由蛋白質(zhì)和DNA組成。核苷酸重復(fù)序列富含G，和端粒結(jié)合蛋白組成核蛋白復(fù)合物。人的DNA端粒含有TTAGGG重復(fù)序列，長度515kb。作用：保護染色體末端免于化學(xué)修飾或核酸酶降解以及不正常的融合和重組；解決染色體復(fù)制時末端丟失問題。,Telomerase:由RNA和蛋白質(zhì)組成的酶。兼有模板和逆轉(zhuǎn)錄酶兩方面的作用。1995年，F(xiàn)eng等克隆了人類端粒酶RNA基因，長約450個堿基的RNA序列中有一段長11個核苷酸的區(qū)域（5-CUAACCCUAAC-3）與人的端粒序列（TTAGGG）n互補。端粒酶蛋白質(zhì)的分離：四膜蟲端粒酶兩個多肽成分p80和p95。,圖4-27端粒酶的作用機理,端粒與衰老,實驗：在無端粒酶活性的成纖維細胞中表達端粒酶時，端粒的縮短和細胞的衰老都受到抑制。結(jié)論：細胞的衰老是由端粒驅(qū)動的。體外培養(yǎng)的細胞端粒的長度隨細胞逐代相傳而縮短，丟失到一定程度便失去對染色體的保護作用。細胞隨之發(fā)生衰老和死亡。,可把端粒看成一面鐘，端粒的長度是鐘上的刻度，記載了細胞分裂的次數(shù)，稱為“端粒鐘”，或有絲分裂鐘或“生命的時鐘”，可通過測定端粒的長度預(yù)測細胞的壽命。胚胎細胞和生殖細胞端粒的長度并不隨細胞分裂次數(shù)的增加而縮短，具有無限的分裂能力，原因在于端粒酶的存在，而體細胞則很難檢測到端粒酶的活性，端粒的長度也短得多。,端粒酶與腫瘤,人體內(nèi)除了生殖細胞和少數(shù)一些體細胞如淋巴細胞等細胞外，絕大多數(shù)體細胞中無法檢測到端粒酶的活性，而在多數(shù)腫瘤細胞中能檢測到端粒酶的活性。體細胞的端粒長度很短，其繼續(xù)縮短導(dǎo)致染色體融合、細胞死亡，而腫瘤端粒酶的激活可以維持端粒的長度，維持腫瘤的繼續(xù)分裂、增殖。端粒酶的表達可能是腫瘤形成和發(fā)展的共同途徑。,端粒酶與惡性腫瘤之間有相關(guān)性使之在腫瘤的診斷和治療上有望成為新的靶目標?？梢酝ㄟ^各種途徑抑制端粒酶的活性有效抑制大多數(shù)腫瘤的生長，而對正常細胞沒有影響。人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶(humantelomerasereversetranscription)：具有腫瘤特異性，因此hTERT啟動子可以用于靶向治療基因的表達。,Figure1Schematicdiagramofadeno-associatedvirus(AAV).(a)Thestructureofthewild-typeAAV.(b)Thegene-deliveryvectorbasedonAAV.Theviralgenomeisreplacedbyanexpressioncassette,whichusuallyconsistsofapromoter,transgeneandpolyA(pA)tail.(c)DiagramofAAV-hTERT-hIFN-.(d)DiagramofthetwoORFrepandcap.CapencodesthreecapsidproteinsVP1,VP2andVP3.Thearrowsmarksitesofthespecificligandsinsertion(numbersaretheaminoacidpositionsN-terminaloftheinsertion).,ChinSciBulletin,2007,52:1590-1599.,Oncogene(2004)23,457-464,DNA的復(fù)制的過程,DNA復(fù)制過程的三個階段DNA復(fù)制的起始階段，包括起始點，復(fù)制方向以及引發(fā)體的形成。DNA鏈的延長，包括前導(dǎo)鏈及隨從鏈的形成和切除RNA引物后填補空缺及連接岡崎片段。DNA復(fù)制的終止階段。,（一）DNA復(fù)制的起始階段復(fù)制是從DNA分子上的特定部位開始的，即復(fù)制起始點(originofreplication)常用ori或o表示，復(fù)制的基本單位為復(fù)制子或復(fù)制單元(replicon)。在原核細胞中只有一個復(fù)制起始點，一個復(fù)制子。在真核生物中復(fù)制是從許多起始點同時開始的，即有多個復(fù)制子。,DNA復(fù)制起始點的結(jié)構(gòu)特性大腸桿菌Ori由422個核苷酸組成，是一系列對稱排列的反向重復(fù)序列，即回文結(jié)構(gòu)(palindrome)。有些生物復(fù)制起始點Ori是富含AT的區(qū)段。這些特殊的結(jié)構(gòu)對于在DNA復(fù)制起始過程中參與的酶和許多蛋白質(zhì)分子的識別和結(jié)合都是必須的。,圖4-28E.coli的OriC結(jié)構(gòu),(一)DNA復(fù)制的起始E.ColiDNA復(fù)制起始包括對其復(fù)制起始區(qū)OriC的識別，以及引發(fā)體(primosome)的形成。DNA雙螺旋的解旋由多種酶來完成的DNA解鏈酶：水解ATP獲能解開雙鏈DNA單鏈結(jié)合蛋白（SSB蛋白）：保持單鏈結(jié)構(gòu)引發(fā)酶(RNA聚合酶)：合成RNA引物隨從鏈是由引發(fā)體來完成的,圖4-29E.coliDNA復(fù)制過程中引發(fā)體的形成,（二）DNA鏈的延長復(fù)制的延伸在復(fù)制體(replisome)內(nèi)進行。DNA的復(fù)制實際上就是以DNA為模板在DNA聚合酶作用下，將四種dNTP聚合成DNA的過程。過程：復(fù)制體的形成前導(dǎo)鏈合成后隨鏈合成后隨鏈合成與前導(dǎo)鏈合成之間的協(xié)調(diào)。,圖4-30E.coliDNA復(fù)制過程中復(fù)制體的形成,圖4-31E.coliDNA復(fù)制的延伸,（三）DNA復(fù)制的終止階段E.coliDNA具有復(fù)制終止位點Ter位點，此處可以結(jié)合一種特異的蛋白質(zhì)分子叫做Tus(terminatorutilizationsubstance)，通過阻止DnaB解鏈酶(Helicase)的解鏈活性而終止復(fù)制。,圖4-32E.coliDNA復(fù)制終止區(qū)的結(jié)構(gòu),其它環(huán)狀DNA分子的復(fù)制,1、復(fù)制:首先由J.Carins從大腸桿菌中觀察到,又稱為Carins復(fù)制。2、滾環(huán)復(fù)制（rollingcirclereplication)：噬菌體(X174和M13)和一些小質(zhì)粒；真核生物如兩棲卵母細胞的rDNA和哺乳動物的DHFR(二氫葉酸還原酶)基因。3、D環(huán)復(fù)制（Dloopreplication)：線粒體和葉綠體DNA和少數(shù)病毒如腺病毒DNA的復(fù)制,滾環(huán)復(fù)制,D環(huán)復(fù)制圖,真核與原核生物DNA復(fù)制的特點(差別)染色質(zhì)和核小體結(jié)構(gòu)對DNA復(fù)制的影響復(fù)制叉移動的速度遠遠低于原核細胞真核生物是多點復(fù)制，具多個復(fù)制起始區(qū)，原核生物是單點復(fù)制。岡崎片段的長度短于原核細胞復(fù)制嚴格限制在細胞周期的S期真核生物在完成全部復(fù)制之前，各個起始點上DNA的復(fù)制不能再開始；原核生物起始點上可連續(xù)開始新的DNA復(fù)制。真核生物線性DNA末端具有端粒結(jié)構(gòu)。,逆轉(zhuǎn)錄（reversetranscription),逆轉(zhuǎn)錄：以RNA為模板合成DNA，存在于逆轉(zhuǎn)錄病毒以及原核生物和真核生物如端粒酶的延長等。逆轉(zhuǎn)錄酶（reversetranscription)逆轉(zhuǎn)錄病毒的基因組復(fù)制過程乙肝病毒基因組的復(fù)制,圖4-40（1）逆轉(zhuǎn)錄病毒的結(jié)構(gòu),圖4-40（2）逆轉(zhuǎn)錄病毒的詳細結(jié)構(gòu),圖4-41逆轉(zhuǎn)錄病毒基因組的結(jié)構(gòu),圖4-42HIV的生活史,圖4-43HIV與宿主細胞的附著,圖4-44逆轉(zhuǎn)錄病毒基因組逆轉(zhuǎn)錄的詳細過程,圖4-45逆轉(zhuǎn)錄病毒基因組的逆轉(zhuǎn)錄結(jié)果,圖4-46原病毒DNA進入細胞核的機理,逆轉(zhuǎn)錄酶（reversetranscription),1964年，Temin發(fā)現(xiàn)Rous肉瘤病毒等RNA病毒所造成的感染可被DNA合成抑制劑遏制。表明：RNA腫瘤病毒的RNA復(fù)制過程中要合成DNA。Temin又發(fā)現(xiàn)放線菌素D能抑制致癌RNA病毒的復(fù)制，但不能抑制一般RNA病毒的復(fù)制。表明：轉(zhuǎn)錄對于RNA病毒增殖是必需的。,Temin提出前病毒假說：原病毒DNA是RNA腫瘤病毒在復(fù)制和致癌中的中間物。1970年，Temin在Rouse肉瘤病毒、Baltimore在白血病病毒中發(fā)現(xiàn)逆轉(zhuǎn)錄酶。,逆轉(zhuǎn)錄酶是一種多功能酶：1、RNA指導(dǎo)的DNA聚合酶活性2、RNA酶H（RNaseH）活性：水解RNA-DNA雜交體上的RNA3、DNA指導(dǎo)的DNA聚合酶活性：合成互補DNA。4、沒有35外切酶活性。,特點：含有Zn2+DNA合成反應(yīng)要求有模板和引物。需適