CR與DNA提取一般方法.ppt

PCR原理+流程,烏桕DNA提取方法國(guó)內(nèi)外相關(guān)文章,PCR原理,聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)簡(jiǎn)稱PCR（英文全稱：PolymeraseChainReaction）(又稱：多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)），聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，其英文PolymeraseChainReaction(PCR)是體外酶促合成特異DNA片段的一種方法,由高溫變性、低溫退火（復(fù)性）及適溫延伸等幾步反應(yīng)組成一個(gè)周期,循環(huán)進(jìn)行,使目的DNA得以迅速擴(kuò)增。又稱無細(xì)胞分子克隆或特異性DNA序列體外引物定向酶促擴(kuò)增技術(shù)。,特點(diǎn),具有特異性強(qiáng)靈敏度高操作簡(jiǎn)便省時(shí)等特點(diǎn)。,用途,可用于基因分離克隆和核酸序列分析等基礎(chǔ)研究還可用于疾病的診斷或任何有DNA,RNA的地方,(1)擴(kuò)增各種蛋白的基因：(2)PCR后的測(cè)序：可以很快地測(cè)出常規(guī)的PCR產(chǎn)物或單鏈的DNA序列(3)用于分子進(jìn)化和種系發(fā)育的研究，研究其分子進(jìn)化及種系發(fā)育是很有用的4)分析和診斷遺傳性疾病(5)對(duì)人類HLA基因的多肽性分析，對(duì)于某些基因突變，如腫瘤發(fā)生的研究等均很有用。,主要過程,PCR由變性退火延伸三個(gè)基本反應(yīng)步驟構(gòu)成,模板DNA的變性,模板DNA經(jīng)加熱至92左右一定時(shí)間后，使模板DNA雙鏈或經(jīng)PCR擴(kuò)增形成的雙鏈DNA解離，使之成為單鏈，以便它與引物結(jié)合，為下輪反應(yīng)作準(zhǔn)備；,模板DNA與引物的退火(復(fù)性),模板DNA經(jīng)加熱變性成單鏈后，溫度降至55左右，引物與模板DNA單鏈的互補(bǔ)序列配對(duì)結(jié)合；,引物的延伸,DNA模板-引物結(jié)合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP為反應(yīng)原料，靶序列為模板，按堿基配對(duì)與半保留復(fù)制原理，合成一條新的與模板DNA鏈互補(bǔ)的半保留復(fù)制鏈，重復(fù)循環(huán)變性-退火-延伸三過程，就可獲得更多的“半保留復(fù)制鏈”，而且這種新鏈又可成為下次循環(huán)的模板。每完成一個(gè)循環(huán)需24分鐘，23小時(shí)就能將待擴(kuò)目的基因擴(kuò)增放大幾百萬倍。到達(dá)平臺(tái)期(Plateau)所需循環(huán)次數(shù)取決于樣品中模板的拷貝。,PCR的反應(yīng)動(dòng)力學(xué)PCR的三個(gè)反應(yīng)步驟反復(fù)進(jìn)行，使DNA擴(kuò)增量呈指數(shù)上升。反應(yīng)最終的DNA擴(kuò)增量可用Y=(1+X)n計(jì)算。Y代表DNA片段擴(kuò)增后的拷貝數(shù)，X表示平(Y)均每次的擴(kuò)增效率，n代表循環(huán)次數(shù)。平均擴(kuò)增效率的理論值為100%，但在實(shí)際反應(yīng)中平均效率達(dá)不到理論值。反應(yīng)初期，靶序列DNA片段的增加呈指數(shù)形式，隨著PCR產(chǎn)物的逐漸積累，被擴(kuò)增的DNA片段不再呈指數(shù)增加，而進(jìn)入線性增長(zhǎng)期或靜止期，即出現(xiàn)“停滯效應(yīng)”，這種效應(yīng)稱平臺(tái)期數(shù)、PCR擴(kuò)增效率及DNA聚合酶PCR的種類和活性及非特異性產(chǎn)物的竟?fàn)幍纫蛩?。大多?shù)情況下，平臺(tái)期的到來是不可避免的。,PCR擴(kuò)增物,PCR擴(kuò)增產(chǎn)物可分為長(zhǎng)產(chǎn)物片段和短產(chǎn)物片段兩部分。短產(chǎn)物片段的長(zhǎng)度嚴(yán)格地限定在兩個(gè)引物鏈5端之間，是需要擴(kuò)增的特定片段。短產(chǎn)物片段和長(zhǎng)產(chǎn)物片段是由于引物所結(jié)合的模板不一樣而形成的，以一個(gè)原始模板為例，在第一個(gè)反應(yīng)周期中，以兩條互補(bǔ)的DNA為模板，引物是從3端開始延伸，其5端是固定的，3端則沒有固定的止點(diǎn)，長(zhǎng)短不一，這就是“長(zhǎng)產(chǎn)物片段”。進(jìn)入第二周期后，引物除與原始模板結(jié)合外，還要同新合成的鏈(即“長(zhǎng)產(chǎn)物片段”)結(jié)合。引物在與新鏈結(jié)合時(shí)，由于新鏈模板的5端序列是固定的，這就等于這次延伸的片段3端被固定了止點(diǎn)，保證了新片段的起點(diǎn)和止點(diǎn)都限定于引物擴(kuò)增序列以內(nèi)、形成長(zhǎng)短一致的“短產(chǎn)物片段”。不難看出“短產(chǎn)物片段”是按指數(shù)倍數(shù)增加，而“長(zhǎng)產(chǎn)物片段”則以算術(shù)倍數(shù)增加，幾乎可以忽略不計(jì)，這使得PCR的反應(yīng)產(chǎn)物不需要再純化，就能保證足夠純DNA片段供分析與檢測(cè)用。,所需材料,1.試劑和溶液(1)10PCR緩沖液500mM氯化鉀100mMTris-Cl(室溫時(shí)pH8.3)15mM氯化鎂(2)10mM脫氧三磷酸核苷(dNTPs)溶液含有所有四種dNTPs(pH8.0),3)耐熱的DNA聚合酶：TaqDNA聚合酶是從表達(dá)克隆嗜熱水生菌的DNA聚合酶基因的大腸桿菌提純而來。此酶有53DNA聚合酶和53外切酶活性，但是缺乏35外切酶活性。rTthDNA聚合酶是Thermusthermophilus(Tth)和Thermococcuslitoralis(Tli)兩種菌中耐熱DNA聚合酶的混合。這種混合酶特別具有53DNA聚合酶和35外切酶(校正)的雙重活性。當(dāng)按推薦量使用時(shí)，此酶可提高保真度及長(zhǎng)鏈PCR的產(chǎn)量。,(4)瓊脂糖凝膠(5)10M的上游和下游引物(6)DNA模板(7)對(duì)照DNA(含有靶序列的DNA)(8)DNA長(zhǎng)度標(biāo)準(zhǔn)參照物,2.設(shè)備,(1)0.2mlPCR擴(kuò)增管,(2)可預(yù)先設(shè)定擴(kuò)增方案的溫度循環(huán)器(PCR儀),實(shí)驗(yàn)操作,1、按以下次序，將各成分加入0.2ml滅菌擴(kuò)增管中：成分體積終濃度10PCR緩沖液5l110mMdNTP溶液(pH8.0)1l每種0.2mM10M上游引物2.5l0.5M10M下游引物2.5l0.5M5單位/l耐熱DNA聚合酶0.5l2.5單位DNA模板1-10l1pg-1g消毒的蒸餾水至50l,2將小管中的混合物混勻并加入50l礦物油或硅化油覆蓋小管中的混合物。3蓋緊小管，短暫離心，以使PCR混合物沉于管底。,4小管在溫度循環(huán)器(PCR儀)中94C溫育3分鐘，以使模板DNA完全變性。,5.按以下方法進(jìn)行25-35個(gè)循環(huán)的PCR擴(kuò)增：變性94C30秒退火55C30秒延伸72C1分鐘/1kb,672C溫育PCR樣本10分鐘，可于4C維持。樣本可貯存于-20C直至使用。7采用瓊脂糖凝膠電泳分析PCR反應(yīng)產(chǎn)物，溴化乙錠染色顯影DNA，用合適分子量標(biāo)準(zhǔn)的DNA作參照。,電泳,PCR熒光定量,結(jié)果,植物DNA提取方法,1.CTAB法2.SDS法3.高鹽法,烏桕DNA提取方法,1.CTAB法2.SDS法,CTAB法提取植物基因組DNA,這種方法是由Murray和Thompson（1980）修改而成的簡(jiǎn)便方法。CTAB(十六烷基三乙基溴化銨)是一種去污劑，可溶解細(xì)胞膜，它能與核酸形成復(fù)合物，在高鹽溶液中（0.7mol/LNaCl）是可溶的，當(dāng)降低溶液鹽濃度到一定程度（0.3mol/LNaCl）時(shí)，從溶液中沉淀，通過離心就可將CTAB-核酸的復(fù)合物與蛋白，多糖類物質(zhì)分開。最后通過乙醇或異丙醇沉淀DNA，而CTAB溶于乙醇或異丙醇而除去。,一材料、試劑和儀器,1材料新鮮的組織材料或-80凍存的材料葉子和種子的胚乳為材料,2試劑,(1)2CTAB溶液CTAB(W/V)2%Tris-HCL100MMOL/LPH8EDTA20MMOLPH8NACL1.4MOL/LPVP1%滅菌備用,(2)氯仿/異戊醇（24:1）(3)RNaseA10mg/ml(4)乙醇或異丙醇(5)-巰基乙醇（6）氯仿/異戊醇（25/24/1）（7）70%乙醇,3.儀器:,a、離心機(jī),b、恒溫水浴,c、電泳裝置,實(shí)驗(yàn)步驟,1.在2mL離心管中，加入500l的2CTAB和20l-巰基乙醇,65預(yù)熱。2、嫩的組織材料1-2g,用蒸餾水沖洗干凈，再用滅菌ddH2O沖洗2次，放入經(jīng)液氮預(yù)冷的研缽中，加入液氮研磨至粉末狀，用干凈的滅菌不銹鋼勺轉(zhuǎn)移粉末到預(yù)熱的離心管中，總體積達(dá)到1mL混勻后置65水浴中保溫45-60min，并不時(shí)輕輕轉(zhuǎn)動(dòng)試管。注：凍存材料直接研磨，絕對(duì)不能化凍。而且粉末應(yīng)在化凍前轉(zhuǎn)移否則內(nèi)源性Dnase有可能降解基因組DNA。,3.加等體積的氯仿/異戊醇，輕輕地顛倒混勻，室溫下10000rpm離心10min，移上清至另一新管中。4.向管中加入1/100體積的RNaseA溶液，置3720-30min。5.加入2倍體積的100%乙醇或0.7倍體積異丙醇，會(huì)出現(xiàn)絮狀沉淀，-20放置30min或-80放置10min，12000rpm離心10-15min回收DNA沉淀。6.用70%乙醇清洗沉淀兩次，吹干后溶于適量的滅菌ddH2O中。7.0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)基因組DNA的完整性。,SDS法,原理：SDS（十二烷基苯磺酸鈉）是一種陰離子去垢劑，在高溫條件下能裂解細(xì)胞，使染色體離析、蛋白變性，同時(shí)SDS與蛋白質(zhì)和多糖結(jié)合成復(fù)合物，釋放出核酸；通過提高鹽濃度并降低溫度，使SDS-蛋白質(zhì)復(fù)合物的溶解度變得更小，從而使蛋白質(zhì)及多糖雜質(zhì)沉淀更加完全，離心后除去沉淀；上清液中的DNA用酚/氯仿抽提，反復(fù)抽提后用乙醇沉淀水相中的DNA。,試劑,(1)提取緩沖液Tris-HCl100mmol/L（pH8.0）EDTA50mmol/L（pH8.0）NaCl500mmol/L滅菌后加-巰基乙醇至10mmol/L,(2)裂解液20%SDS(3)高鹽溶液5mol/LKAc(4)RNaseA10mg/ml(5)異丙醇(6)滅菌ddH2O或TE,實(shí)驗(yàn)程序,1、取幼嫩的組織材料1-2g,用蒸餾水沖洗干凈，再用滅菌ddH2O沖洗2次，放入經(jīng)液氮預(yù)冷的研缽中，加入液氮研磨至粉末狀，用干凈的滅菌不銹鋼勺轉(zhuǎn)移粉末到加有500L提取液的離心管中,輕輕混勻。2、向管中加入50L20%SDS溶液，混勻，不可過于強(qiáng)烈震蕩以防基因組DNA斷裂，65保溫10min，并不時(shí)搖動(dòng)。3、加入150L5mol/LKAc，混勻，置冰上20-30min。,4、4,15000rpm離心15min,轉(zhuǎn)移上清到另一離心管中，加入0.7V的異丙醇，混勻，-20沉淀30min。5、12000rpm離心10min回收基因組DNA沉淀，吹干后加入適量的滅菌ddH2O或TE溶解DNA。6、加入1/10體積的RNaseA，37保溫20min，除去RNA7、CI抽提后，加2V乙醇，-20沉淀30min。12000rpm離心10min回收基因組DNA沉淀。8、用400L70%乙醇洗一次后，吹干，加入適量的滅菌ddH2O或TE溶解DNA。,9、電泳檢測(cè)完整性。,采用瓊脂糖凝膠電泳方法，觀察電泳圖來判斷DNA完整性若：電泳圖呈現(xiàn)干凈、光滑的單一一條帶，沒有拖尾現(xiàn)象，則說明DNA的完整性很好。可用于后續(xù)PCR分子生物學(xué)操作。若：電泳圖有拖尾現(xiàn)象，不止單一一條帶，則DNA完整性不是很好，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)操作效果較差。,DNA完整性良好,國(guó)內(nèi)外相關(guān)文章,烏桕基因組DNA提取方法研究,張帥王曉光鄧先珍羅治建程軍勇盧小三【摘要】：以改良CTAB法和SDS法提取烏桕基因組DNA,對(duì)提取條件進(jìn)行了正交試驗(yàn),優(yōu)化出烏桕基因組DNA提取的適宜條件,采用紫外分光光度檢測(cè)、瓊脂糖凝膠電泳分析及限制性內(nèi)切酶進(jìn)行了檢測(cè)。結(jié)果表明:改良CTAB法的A1、B2、C2、D2組合提取的基因組DNA純度高,無拖尾現(xiàn)象,OD260/280值在1.82.0,OD260/230在2.0。,【作者單位】：華中農(nóng)業(yè)大學(xué);湖北省林業(yè)科學(xué)研究院;【分