《熒光分光光度法》PPT課件

第六章熒光分光光度法,基本要求：了解熒光光譜法的基本原理和應(yīng)用特點。了解熒光分光光度計的組成以及特點。掌握熒光光譜法的定量分析方法。了解影響熒光強度的因素。,第一節(jié)概論,回顧：,四大類,一、應(yīng)用：,1.定量分析能產(chǎn)生熒光或能形成熒光配合物的物質(zhì)。2.簡單定性回答“是不是”。,二、特點：,靈敏度高，比吸收光譜法高10104倍。ppb選擇性比吸收光譜法好。,第二節(jié)基本原理,一、分子熒光的產(chǎn)生物質(zhì)吸收光輻射價電子從基態(tài)躍到激發(fā)態(tài)，然后再回到基態(tài)釋放能量以熱能的形式。以光輻射的形式。以光輻射形式釋放能量時，發(fā)射熒光。這種現(xiàn)象稱為光致發(fā)光。,最常見的光致發(fā)光：熒光和磷光。兩者發(fā)光機理不同，壽命不同。熒光壽命10-910-6秒，磷光壽命10-310秒。熒光可由激發(fā)態(tài)的分子產(chǎn)生，也可由激發(fā)態(tài)的原子產(chǎn)生，本章介紹分子熒光。由于熒光的產(chǎn)生由價電子引起，所以，熒光光譜屬于電子光譜，其波長范圍位于：紫外光區(qū)和可見光區(qū)。,二、激發(fā)光譜和發(fā)射光譜,激發(fā)光譜固定熒光波長，以激發(fā)光波長對熒光強度(F)所作的光譜曲線。,發(fā)射光譜固定激發(fā)光波長，以熒光波長對熒光強度F所作的光譜曲線。,三、分子熒光與分子結(jié)構(gòu)的關(guān)系,分子要產(chǎn)生熒光，首先要能吸收紫外光或可見光。,能產(chǎn)生熒光的分子具有的結(jié)構(gòu)特點：,【例】,芴具有剛性平面，產(chǎn)生的熒光比聯(lián)二苯強。,四、熒光強度與濃度的關(guān)系,：量子效率，發(fā)射光量子與吸收光量子之比。I0：入射光強度：摩爾吸光系數(shù)b：光程c：濃度,F=2.303I0bc,公式成立前提條件：bc=A0.05即：當(dāng)試樣濃度較低時（c0.05/b），C與F方成線性。（如果濃度過高，分子碰撞機會增大，而產(chǎn)生無輻射去激活，造成線性偏離。）,第三節(jié)熒光分光光度計,一、基本結(jié)構(gòu)示意圖,特點：1光源方向與檢測方向成直角；2二個單色器。,二、主要部件及功能,1光源高壓汞蒸氣燈，氙燈。能提供紫外光和可見光，光強度比紫外-可見光分光光度計光源大得多。2激發(fā)光單色器作用：提供單波長的激發(fā)光。色散元件：棱鏡或光柵。出射狹縫寬度可調(diào)。,3樣品池須用石英材料制成。4熒光單色器將樣品池中的散射光、反射光、雜質(zhì)熒光等濾掉，只讓熒光通過。出射狹縫寬度可調(diào)。5檢測器光電轉(zhuǎn)換元件，測定熒光的強度。檢測方向與激發(fā)光方向垂直：在垂直方向上沒有透過光的干擾。由于熒光的強度較弱，一般以光電倍增管作檢測器。,第四節(jié)定量分析,一、定量方法一般采用工作直線法。作CF直線。,配制一系列待測成分的標(biāo)準(zhǔn)溶液C1C2C3C4C5測出相應(yīng)的熒光強度F1F2F3F4F5建立工作直線（FC）作圖法回歸法測量待測樣品，得F樣從工作直線上找到待測成分的濃度C樣由回歸方程計算出C樣,二、影響熒光強度測定的因素,1激發(fā)光照射有一些熒光物質(zhì)若受到強光照射，會發(fā)生分解而導(dǎo)致F。所以，熒光分光光度計通常在激發(fā)光單色器后裝配有光閘，在測定時才打開光閘讓激發(fā)光照射樣品池。2溫度溫度，熒光效率下降，F(xiàn)。（因為，溫度，增加分子間碰撞機會而使能量消耗掉。）,4溶劑有些溶劑會使熒光效率下降，也可能帶來干擾熒光。,所以，有時需要pH緩沖液控制pH值在適當(dāng)范圍內(nèi)。,3pH值pH值能改變某些熒光物質(zhì)的電子構(gòu)型從而影響熒光強度。,靈敏度高?？筛哌_(dá)ppb級（10-9），甚至ppt級（10-12）。選擇性好，與能產(chǎn)生熒光的物質(zhì)少有關(guān)。,三、定量分析的特點及應(yīng)用,思考題,一、概念（熒光）激發(fā)光譜（熒光）發(fā)射光譜,二、問答題試述分子熒光產(chǎn)生的過程。試述分子熒光強度與濃度的關(guān)系式，并說明公式成立的前提條件及原因。分別說明熒光分光光度計兩個單色器的作用，以及將光路設(shè)計成直角方向的原因。為什么可見光分光光度計的光路是直線方向，而熒光分光光度計的光路是直角方向？,熒光分析的激發(fā)光譜和