醫(yī)學(xué)真菌生物膜研究進展.ppt

醫(yī)學(xué)真菌生物膜的研究進展biofilms : anewperspectivenfungalinfection，醫(yī)學(xué)真菌學(xué)是研究病原真菌和條件病原真菌對人類致病機制、診斷、治療和預(yù)防的重要學(xué)科，是交叉、邊緣學(xué)科。 真菌、酵母、絲狀真菌、念珠菌、隱球菌、念珠菌、微絲狀真菌(霉菌)、巨絲狀真菌(香菇等)、真菌按其菌落形態(tài)劃分，特征：有多細(xì)胞、菌絲和孢子，基本形態(tài)為菌絲，特征：在感染組織內(nèi)寄生或在37高營養(yǎng)培養(yǎng)基培養(yǎng)時為酵母相體外腐生和27培養(yǎng)時菌絲相、皮癬菌、真菌病原形態(tài)、真菌毒素中毒癥：曲霉毒素、鐮刀菌毒素。 過敏性疾病：多形性紅斑，外源性過敏性肺泡炎。 淺部真菌?。浩つw及附屬器官感染。 深部真菌?。旱木窒扌耘c系統(tǒng)性。 由于各種原因真菌感染患者增加，美國的流行病學(xué)研究顯示，從1980年到1982年從1992年到1993年，念珠菌病的發(fā)病率從2.6/100萬/年上升到72.8/100萬/年的隱球菌病從4.0/100萬上升到65.5/100萬/年北京協(xié)和醫(yī)院1953年至1993年尸檢結(jié)果顯示，后20年深部真菌感染率從1.5%增加到5.6%。 由于這些原因，發(fā)生真菌感染的病例大幅增加，很多感染很難恢復(fù)。 在相當(dāng)多的病例中證實了其中與真菌的生物膜形成有關(guān)系。 1 .生物膜的形成和結(jié)構(gòu)，生物膜(biofilmfilm )的定義：附著在活著的組織或沒有活力的組織表面，其自身產(chǎn)生的被細(xì)胞外多基質(zhì)(extracellularmaxtrix，ECM )包裹的結(jié)構(gòu)的菌細(xì)胞群，由ECM和與其粘連的菌細(xì)胞構(gòu)成。 這是另一種微生物對游離狀態(tài)菌細(xì)胞的存在方式。 它能保護菌細(xì)胞，顯著降低隱球菌等病原真菌對真菌藥物的敏感性，甚至降低耐藥性。 近年來，發(fā)現(xiàn)了包括主要人類病原真菌在內(nèi)的多種真菌能夠形成生物膜。 念珠菌可以形成生物膜，念珠菌形成的生物膜具有對抗宿主防御機制的作用，念珠菌對臨床常規(guī)抗真菌藥物具有明顯的耐藥性。 Walsh等首先報告了隱球菌生物膜形成的病例，該患者在心室心房旁路術(shù)后培養(yǎng)心導(dǎo)管表面生長的微生物膜確定為新生隱球菌，薄膜的超微結(jié)構(gòu)符合生物膜的結(jié)構(gòu)特征，首次證明新生隱球菌也能產(chǎn)生生物膜。 Reynolds發(fā)現(xiàn)釀造酵母生物膜的存在。 菌體和支持體表面的附著。 形成微小菌落。 微菌落融合，釋放基質(zhì)形成生物膜底層。 基質(zhì)大量釋放的同時，隨著菌絲體和假菌絲體的形成，結(jié)構(gòu)變得復(fù)雜起來。 細(xì)菌和真菌細(xì)胞從生物膜中釋放出來，形成新的生物膜，早期，中期，成熟期，生物膜的形成過程，(c )成熟期，白色念珠菌生物膜(生長在聚甲基丙烯酸甲酯上，在熒光顯微鏡下)，(a )早期，(b )中期，生物膜的結(jié)構(gòu)以白色念珠菌生物膜為例。 前2h :念珠菌細(xì)胞主要以芽生孢子形式附著于載體表面。 4h后：開始形成芽管，出現(xiàn)分散的微小菌落，逐漸融合。 中期開始階段(1214h ) :主要以細(xì)胞外基質(zhì)的出現(xiàn)為特征，細(xì)胞外基質(zhì)與真菌微菌落表面發(fā)生碰撞，隨著時間的推移增加，直至完全包裹細(xì)胞。 成熟期：由胞外基質(zhì)包裹的孢子、菌絲和假菌絲形成致密網(wǎng)狀系統(tǒng)，呈有機三維結(jié)構(gòu)。 白色念珠菌生物膜(生長于假牙樹脂表面，共焦點掃描激光鏡下):0(a )、8(b )、11(c )、48(d )小時，刻度均為10m，白色念珠菌生物膜(長于玻璃蓋，24h，掃描電子顯微鏡下)注：掃描電子顯微鏡操作前處理大部分基質(zhì)被除去， 新生隱球菌生物膜早期：酵母細(xì)胞和胞子形成單層結(jié)構(gòu)的中期：逐漸形成菌落的成熟期：產(chǎn)生大量莢膜多糖和胞外物質(zhì)，使大量酵母細(xì)胞形成三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。早期： a、b出芽，單層生長中期： c、d微菌落形成成熟期： e、f莢膜多糖釋放，胞外基質(zhì)形成和多層酵母細(xì)胞包復(fù)，c.neformaensb3501生物膜(聚苯乙烯96孔，光鏡下生長)，成熟的c.neformaensb3501生物膜(復(fù)蓋物二、生物膜形成的影響因素，生物膜形成受多種因素的影響：組織類型、血清成分等附著，體外培養(yǎng)也受培養(yǎng)基類型的影響。 如下所示。 血清和組織液成分，血清和組織液的某些成分促進生物膜的形成。 相同材質(zhì)的載體，體內(nèi)生物膜的細(xì)胞外基質(zhì)比體外生物膜厚，而且體內(nèi)生物膜完全成熟所需的時間短。 電容敏感(Quorum-sensing )近年來的研究表明，電容敏感分子在生物膜形成中起著重要作用，生物膜不再是懸浮細(xì)胞的簡單聚集。 白色念珠菌的容量敏感分子有苯甲醚和羥甲基。 其中苯乙醇與生物膜形成有關(guān)，也能抑制念珠菌的菌絲化。 實驗證明，白念珠菌處理后的黏附細(xì)胞群落可以抑制其生物膜的形成和生長，其作用取決于濃度和法尼科處理時的黏附時間。 在經(jīng)苯胺醇處理的念珠菌形成的生物膜中，菌絲形成相關(guān)基因、細(xì)胞壁維持相關(guān)基因、細(xì)胞表面疏水性相關(guān)基因、離子輸送相關(guān)基因等274個基因的表達(dá)發(fā)生了變化。 苯甲醇是否通過抑制菌絲化來抑制生物膜的形成還不清楚。 目前，敲除組氨酸激酶基因，僅有少量證據(jù)表明被苯妥英抑制的念珠菌能夠同時恢復(fù)菌絲的生長和生物膜的形成。 細(xì)胞表面成分，隱球菌生物膜由多糖基質(zhì)和分布在其中的酵母細(xì)胞組成。 隱球菌生物膜的形成取決于莢膜多糖的釋放和對支持物的附著能力。 具有阿爾法放射源的抗莢膜多糖抗體(IgG1)能透過隱球菌生物膜，降低生物膜代謝活性50%，不是特異的單抗。 人外周血單核細(xì)胞(pbmcos )、pbmcos的存在促進了白色念珠菌生物膜的形成。 而且，并不像吞噬游離真菌細(xì)胞那樣吞噬生物膜內(nèi)的真菌細(xì)胞。 只有活化的pbmcos影響生物膜的形成，其作用介于pbmcos釋放出的可溶性因子，具體成分尚不清楚。 乙醛還原酶(ADH )、ADH可抑制念珠菌生物膜。 但是，在很多細(xì)菌(如金葡萄菌)的生物膜中，ADH的作用恰恰相反。 細(xì)菌生物膜中ADH的表達(dá)增加，活性增高，產(chǎn)生的乙醇增加。 因此，細(xì)菌生物膜有可能通過調(diào)節(jié)ADH表達(dá)來抑制真菌生物膜的形成和發(fā)展。 這將成為細(xì)菌與真菌的競爭手段。 其他相關(guān)基因以念珠菌為例，有很多基因可作用于生物膜的形成和發(fā)展。 三、生物膜形成對真菌耐藥性的影響，生物膜形成后，真菌對氟康唑、異煙唑、酮康唑、兩性霉素b、氟西汀等臨床常用抗真菌藥物和氯己定等消毒劑的敏感性大幅度下降。 特點：1.耐藥濃度超過游離細(xì)胞MIC的30-2000倍。 2 .耐藥性早期出現(xiàn)在生物膜形成中。 3 .隨著生物膜的成熟而增強。 生物膜耐受機制尚不清楚，許多學(xué)者認(rèn)為生物膜耐受是由多種因素決定的。 生物膜細(xì)胞的低生長速率被認(rèn)為是生物膜中細(xì)胞生長速率影響藥物敏感性的重要調(diào)節(jié)因素。 事實上，所有抗生素對快速生長的細(xì)胞都更有殺傷力。 由于營養(yǎng)獲得的限制，生物膜細(xì)胞處于緩慢生長的狀態(tài)，真菌的代謝降低，特別是處于生物膜末端，表明細(xì)胞對抗菌藥物不敏感。 但這顯然無法完全說明生物膜抵抗正常MIC數(shù)十倍至一千倍以上濃度的耐藥性。 藥物滲透率，生物膜確實有延緩藥物滲透的作用。但在念珠菌各菌種的生物膜實驗中，給藥后，生物膜周邊的藥物濃度達(dá)到或超過MIC，不能殺死生物膜細(xì)胞。 含有念珠菌和表皮葡萄球菌的混合生物膜，藥物滲透更慢。 但是，盡管如此，生物膜邊緣的藥物濃度還是經(jīng)常超過MIC。 因此，藥物滲透不足不是念珠菌生物膜的主要耐藥機制。 流出泵，游離條件下念珠菌抵抗唑類藥物的主要機制之一是ABC載體*和主要輔助因子#介導(dǎo)的藥物流出泵，cdr1、cdr2和mdr1。 研究表明，生物膜中有兩種流出泵基因過量表達(dá)。* atpbindingcassettetransporters、CDR基因編碼#majorfacilitator、MF、MDR基因編碼、流出泵貧乏菌株形成的早期生物膜對氟康唑的敏感性大幅增加。 但生物膜成熟后，藥物流產(chǎn)泵菌株耐藥不足。 因此，藥物流出泵只能在生物膜形成的早期起作用。 在羅丹明(Rh123 )流出檢測中分析了流出泵的功能，在早期階段，生物膜和游離細(xì)胞的Rh123保持量有很大的差異，但確認(rèn)不是后期(12h，48h )。 有學(xué)者認(rèn)為，耐藥菌株的存在是生物膜中存在耐藥亞群，其生物學(xué)特性與普通菌細(xì)胞不同，耐藥亞群的存在無法完全去除生物膜。 證據(jù)表明，早期念珠菌生物膜中的真菌細(xì)胞存在兩種亞群，它們對氯己定的敏感性不同，菌絲或假菌絲細(xì)胞比酵母細(xì)胞敏感。 這一現(xiàn)象需要進一步研究和證實。 發(fā)現(xiàn)附著面的粗糙度與植入物(鈦)上念珠菌生物膜對兩性霉素b的耐藥性和植入物的表面粗糙度有關(guān)。 過于粗糙或過于光滑會降低生物膜的耐藥性。 那個機制還不清楚。 MAP激酶mkc1p、有絲分裂原活性蛋白(mitogen-activatedprotein，MAP )激酶mkc1p活性低的念珠菌株能正常產(chǎn)生生物膜，游離細(xì)胞對氟康唑的敏感性也不變，但生物膜對氟康唑的敏感性與野生株相比非常高也就是說，MK1只增加生物膜的耐藥性，不影響游離細(xì)胞。 這是目前已知的唯一生物膜特異性耐藥基因。 4 .生物膜抵抗免疫系統(tǒng)的作用，有證據(jù)表明新生隱球菌生物膜能有效抵抗巨噬細(xì)胞產(chǎn)生的氧化性抗微生物分子。 另外，體外研究表明，念珠菌生物膜中存在的人PBMCs (包括單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞)不僅不吞噬念珠菌細(xì)胞，而且對其生物膜的生長有促進作用。 這些現(xiàn)象表明生物膜抵抗宿主免疫，生物膜的形成可能是隱球菌長期感染的原因之一。 5 .生物膜形成的可行措施是預(yù)防生物膜形成，抗莢膜多糖抗體抑制生物膜的體液免疫對抑制莢膜某些微生物膜形成有一定作用的相關(guān)疫苗和微生物多糖抗體可用于防止心臟起搏器等植入物的生物膜形成。 已經(jīng)證明植入物表面粗糙度影響真菌生物膜的耐藥性，植入物材料的研究和改進也可能在未來減少真菌生物膜的形成。 已經(jīng)形成的生物膜用藥策略是：1.聯(lián)用藥物無論是抗真菌藥物的聯(lián)用，還是抗真菌藥物和抗細(xì)菌藥物的聯(lián)用，都可以有效地對抗生物膜的耐藥性。 我們對20株新生隱球菌的臨床分離株進行過M27-A藥敏檢查，證明異康唑聯(lián)合阿奇霉素b的真菌MIC值明顯偏低(見表)。 另外，大多數(shù)受試者作為協(xié)同作用或加法作用沒有觀察到拮抗作用。 異康唑和阿奇霉素b對20株新生隱球菌MIC值的平均值(g/mL )采用異康唑0.27300.1195阿奇霉素B0.68300.2102聯(lián)合抗菌藥物，大大提高阿奇霉素b的念珠菌生物膜效果，注2、新型抗真菌藥物的應(yīng)用新一代抗真菌藥物如棘白抗生素類(卡波芬、米卡芬、安托芬)和兩性霉素b脂質(zhì)體對真菌生物膜有效。鏈霉抗生物素主要抑制真菌細(xì)胞壁1，3- d葡萄糖苷的生物合成。 已經(jīng)證實了白色念珠菌、新生隱球菌等真菌生物膜具有滅絕的能力。 尋找新的治療靶點，可以抑制pmt1p的酶活性，阻斷生物膜形成的早期階段，有可能阻止白色念珠菌的定植和生物膜依賴的耐藥性。 Pmt酶蛋白作為二聚體存在，結(jié)合方式與共同的保守蛋白質(zhì)區(qū)域有關(guān)，對Pmt復(fù)合體的形成和穩(wěn)定性是必要的。 該PMT蛋白結(jié)合部位為攻擊真菌鄰甘露糖基化過程提供了靶點。 Mkc1p已被證