DNA的合成與修復(fù)

第 章 DNA的生物合成和修復(fù) 第一節(jié) DNA 復(fù) 制 核酸鏈的合成方向只有一個：53。在DNA復(fù)制過程中，DNA雙螺旋的兩條鏈可以同時作為模板；但是在轉(zhuǎn)錄時，DNA雙鏈中往往只有1條鏈能夠作為模板鏈，也有個別例外。RNA聚合酶能夠從頭合成1條新的RNA鏈，而DNA聚合酶則需要RNA引物，它不能從頭合成1條DNA鏈。 染色體DNA復(fù)制的共同特征有：半保留復(fù)制。形成復(fù)制叉結(jié)構(gòu)。雙向復(fù)制。半不連續(xù)復(fù)制。復(fù)制起點(diǎn)具有特殊序列。需要RNA引物。復(fù)制的高度忠實(shí)性。-DNA復(fù)制時，1條鏈的合成方向和復(fù)制叉的前進(jìn)方向相同，可以連續(xù)復(fù)制，這條鏈叫作前導(dǎo)鏈(1eading strand)；-而另一條鏈的合成方向和復(fù)制叉的前進(jìn)方向正好相反，不能連續(xù)復(fù)制，只能分成幾個片段合成，故稱之為滯后鏈(1agging strand)。-滯后鏈片段叫作岡崎片段，它們合成后再連接起來。 -DNA鏈不能從頭合成。在DNA復(fù)制開始時必須先合成一小段RNA作為引物(primer)，從它的3羥基開始合成DNA鏈，這一過程叫作引發(fā)(priming)。- 三、E.coli的DNA復(fù)制 (一)復(fù)制的起始 oriC的9bp區(qū)富含A和T，DnaA蛋白的結(jié)合使這一區(qū)域容易解鏈(melted)，并形成復(fù)制起始的開放型復(fù)合物(open complex)，這個過程消耗ATP。dnaC蛋白將dnaB蛋白運(yùn)送到指定位置解旋酶 DnaB蛋白介導(dǎo)E.coli的染色體DNA必須進(jìn)一步解旋。復(fù)制開放復(fù)合物中的每1條單鏈上各有1個解旋酶分子結(jié)合。而形成預(yù)引發(fā)復(fù)合物(prepriming complex)。 *Ecoli的SSB蛋白結(jié)合于DNA單鏈區(qū)，以防止DNA再退火(reannealing)，此外，SSB蛋白可以防止形成局部發(fā)夾式螺旋阻礙DNA聚合酶前進(jìn)。 (二)引發(fā) DNA復(fù)制都需要引發(fā)酶合成RNA引物。這些RNA引物5，端第1個核苷酸通常是pppA，個別為pppG，其長度從幾個核苷酸(45個)到十幾個不等，它們的前12個核苷酸往往是固定的，后面的可以是任意的核苷酸，也可能從DNA模板鏈上拷貝。 -引發(fā)酶、DnaB和幾種蛋白因子形成的復(fù)合物叫作引發(fā)體(primosome)，它能沿著結(jié)合了SSB蛋白的DNA單鏈定向運(yùn)動，并在不同位點(diǎn)合成RNA引物。 (三)半不連續(xù)復(fù)制在E.coli復(fù)制叉，前導(dǎo)鏈的連續(xù)合成比較簡單。滯后鏈合成分段進(jìn)行，需要合成若干RNA引物，DNA聚合酶可以在RNA引物的3端開始合成罔崎片段(Okazaki fragments)，在細(xì)菌和噬菌體中它的長度一般為1 0002 000個核苷酸，但在真核細(xì)胞中只有100200個核苷酸。當(dāng)每個新合成的罔崎片斷3端到達(dá)相鄰的另1個罔崎片段的5端時，DNA聚合酶I利用其53，外切酶活性切除后者5端的RNA引物，同時利用它的DNA聚合酶活性填補(bǔ)兩個罔崎片段之間的缺口。然后，另1個關(guān)鍵酶DNA連接酶(1igase)將相鄰的這兩個罔崎片段的3羥基和5磷酸基團(tuán)連接起來。 DNA聚合酶I，從N端到C端有3個酶促活性結(jié)構(gòu)域依次排列： 53外切酶和35外切酶和DNA聚合酶。在DNA損傷修復(fù)時，DNA聚合酶I對于填補(bǔ)缺口(gapfilling)可能是最重要的酶。 DNA聚合酶兼有35外切酶和DNA聚合酶活性。DNA聚合酶能夠在DNA的兩條鏈在同一部位都發(fā)生損傷時進(jìn)行DNA修復(fù)。 只有DNA聚合酶符合E.coli體內(nèi)DNA復(fù)制的要求,DNA聚合酶在E.coli的DNA復(fù)制中是主要的DNA合成酶。 DNA聚合酶亞基具有DNA聚合酶活性，而亞基具有35為外切酶活性，它對于校正功能十分重要。亞基可能起組裝作用。其他7種亞基的主要功能是，將核心聚合酶從分配型酶(distributive enzyme)轉(zhuǎn)變成持續(xù)型酶(processiye enzyme)。 DNA聚合酶之所以具備持續(xù)合成能力，亞基二聚體起了關(guān)鍵作用，它的主要功能是防止核心聚合酶在DNA復(fù)制過程中從模板鏈上掉下來。 (四)復(fù)制的終止位點(diǎn)和Tus蛋白E.coli的兩個復(fù)制叉的匯合點(diǎn)就是復(fù)制的終點(diǎn)，在復(fù)制叉匯合點(diǎn)兩側(cè)約lOOkb處各有1個終止區(qū)(terD，A和terC，B)，它們是向1個方向運(yùn)動的復(fù)制叉特異的終止位點(diǎn)(TER sites)， 4個ter序列中都含有1個23bp的共有序列， Tus蛋白(36Kd)識別和結(jié)合于終止位點(diǎn)的23bp共有序列，它具有反解旋酶(contrahelicase)的活性，以阻止DnaB蛋白的解旋作用，從而抑制了復(fù)制叉的前進(jìn)。 -復(fù)制體(replisome)是在復(fù)制叉形成的1種多蛋白復(fù)合物，其中包括DNA聚合酶等酶和蛋白因子，它的功能是促使DNA復(fù)制。 四、真核細(xì)胞的DNA復(fù)制 在哺乳動物細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)了5種DNA聚合酶()。哺乳動物的DNA聚合酶和分別負(fù)責(zé)合成滯后鏈和前導(dǎo)鏈，和可能和DNA損傷修復(fù)有關(guān)，而負(fù)責(zé)合成線粒體DNA (二)端粒和端粒酶 真核生物線性染色體的末端具有特殊結(jié)構(gòu)端粒(telomeres)。端粒由特異的寡聚核苷酸重復(fù)序列組成, 端粒不僅對于染色體的穩(wěn)定性十分重要，而且為染色體DNA復(fù)制所必需。-端粒酶(telomerase)，它是1種核糖核蛋白(RNP)，可以利用自己的RNA分子作為模板，從3端合成并延長滯后鏈模板DNA。一旦滯后鏈模板的3端延伸到足夠長，就可以完整地合成滯后鏈的最后1個岡崎片段，產(chǎn)生完整的子染色單體。 某些基因組的DNA復(fù)制特征和原核或真核生物的染色體DNA復(fù)制明顯不同，例如線粒體DNA的D環(huán)(D-Loop)復(fù)制和噬菌體的滾環(huán)(rolling circle)復(fù)制。 DNA復(fù)制的高度忠實(shí)性有賴于多種因素，包括RNA引物的作用，DNA聚合酶的自我校正功能，幾種校正和修復(fù)系統(tǒng)，以及DNA本身的結(jié)構(gòu)特征(T取代U)等， (二)錯配校正系統(tǒng) E.coli的錯配校正系統(tǒng)利用dam基因編碼的甲基化酶(methylase)，將DNA所有的 GATC序列中的A在N6位甲基化，新合成的DNA鏈中的A要晚一些時候才被甲基化。這就為區(qū)別新DNA鏈和模板鏈提供了基礎(chǔ)。 E.coli的錯配校正過程始于三種蛋白發(fā)揮作用，它們是Mut S，Mut L和Mut H。Mut S可以識別和結(jié)合于DNA的錯配堿基處,Mut H在新DNA鏈(尚未甲基化)的GATC的5側(cè)造成缺口(nick)，而MutL將MutS和MutH連結(jié)在一起，從而使新合成的DNA鏈和模板鏈形成環(huán)狀結(jié)構(gòu)(looping)。然后，在DNA解旋酶和SSB蛋白等因子參與下，核酸外切酶I切除新DNA鏈上包括錯配堿基在內(nèi)的片段。最后，由DNA聚合酶和連接酶完成修復(fù)。 真核生物新合成的DNA鏈上往往帶有缺口，這種單鏈DNA缺口本身就是1個信號，可以指導(dǎo)在真核細(xì)胞中進(jìn)行正確的錯配校正。 七、拓?fù)洚悩?gòu)酶topo I可以在雙螺旋DNA中的1條鏈上造成缺口，于是缺口兩側(cè)的DNA就能夠以缺口對面的磷酸基團(tuán)為中心自由旋轉(zhuǎn)，旋轉(zhuǎn)方向取決于DNA雙螺旋中的張力，使張力得以釋放。E.coli的topo 只作用于負(fù)超螺旋DNA，消除負(fù)超螺旋，它對正超螺旋DNA不起作用。而真核細(xì)胞的topo I能夠使正或負(fù)超螺旋都消除。topo可以同時共價結(jié)合于DNA的兩條鏈，并將兩條鏈暫時切斷，再重新連接。在復(fù)制叉前進(jìn)時，E.coli的topo可以將前方產(chǎn)生的正超螺旋轉(zhuǎn)變?yōu)樨?fù)超螺旋。此外，它還能在DNA雙螺旋中引入負(fù)超螺旋， 在E.coli中還有1種第二類DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶topo，它的功能是將復(fù)制產(chǎn)生的兩個子染色體從連環(huán)體(catenanes)中分離出來。所有的第二類DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶都催化連環(huán) (catenation)和去連環(huán)(decatenation)過程第二節(jié) DNA的損傷修復(fù) 環(huán)境的物理或化學(xué)因素給細(xì)胞中的DNA帶來的損傷有以下幾種類型： (一)堿基丟失 (二)堿基改變 (三)核苷酸插入或缺失 (四)DNA鏈斷裂 (五)DNA鏈間共價交聯(lián)。 二、DNA損傷的幾種修復(fù)機(jī)制 (一)直接修復(fù)(directrepair) (二)切除修復(fù)(excisionrepair) (三)重組修復(fù)(recombinational repair) (四)DNA的傾向差錯合成和SOS反應(yīng) 切除修復(fù)可以分為以下3種方式：堿基切除修復(fù)。核苷酸切除修復(fù)。堿基錯配修復(fù)(校正)，第三節(jié) 逆 轉(zhuǎn) 錄 - 所謂逆轉(zhuǎn)錄，是指在逆轉(zhuǎn)錄酶的作用下以RNA為模板合成DNA的過程。 逆轉(zhuǎn)錄酶兼有三種