蛋白質(zhì)藥物的分析

1、1 第十章第十章 氨基酸與蛋白質(zhì)類藥物的分析氨基酸與蛋白質(zhì)類藥物的分析 第一節(jié)第一節(jié) 概述概述 第二節(jié)第二節(jié) 氨基酸類藥物的分析氨基酸類藥物的分析 第三節(jié)第三節(jié) 蛋白質(zhì)類藥物的分析蛋白質(zhì)類藥物的分析 2 第一節(jié)第一節(jié) 概述概述 v一、氨基酸的性質(zhì)一、氨基酸的性質(zhì) v二、蛋白質(zhì)的性質(zhì)二、蛋白質(zhì)的性質(zhì) 3 一、氨基酸的性質(zhì)一、氨基酸的性質(zhì) v具有具有旋光性旋光性 v光吸收光吸收：酪氨酸、色氨酸、苯丙氨酸，在近紫外：酪氨酸、色氨酸、苯丙氨酸，在近紫外 區(qū)有最大吸收。區(qū)有最大吸收。 v酸堿性酸堿性：兩性電解質(zhì)，凈電荷為零時的：兩性電解質(zhì)，凈電荷為零時的pH稱為等稱為等 電點(diǎn)（電點(diǎn)（pI ），）， 生理

2、條件下多數(shù)以負(fù)離子形式存在生理條件下多數(shù)以負(fù)離子形式存在 pH = pI 凈電荷凈電荷=0 pH pI 凈電荷為負(fù)凈電荷為負(fù) CH R COOH NH3+ CH R COO NH2 CH R COO NH3+ + H+ + OH- + H+ + OH- (pK 1)(pK 2) 當(dāng)氨基酸溶液在某一定當(dāng)氨基酸溶液在某一定pH值時，使某特定氨基酸分子上所帶正負(fù)值時，使某特定氨基酸分子上所帶正負(fù) 電荷相等，成為兩性離子，在電場中既不向陽極也不向陰極移動，此電荷相等，成為兩性離子，在電場中既不向陽極也不向陰極移動，此 時溶液的時溶液的pH值即為該氨基酸的值即為該氨基酸的等電點(diǎn)等電點(diǎn)(isoelectr

3、ic point，pI)。 1.1.兩性解離和等電點(diǎn)兩性解離和等電點(diǎn) 一、氨基酸的性質(zhì)一、氨基酸的性質(zhì) Trp Tyr Phe 的的 紫紫 外外 吸吸 收收 光光 譜譜 摩爾吸收系數(shù)摩爾吸收系數(shù) 波長波長 2.2.光學(xué)性質(zhì)光學(xué)性質(zhì) a. a. 與茚三酮反應(yīng)與茚三酮反應(yīng): :用于氨基酸定量定性測定用于氨基酸定量定性測定. . b.b.與與2,42,4一二硝基氟苯一二硝基氟苯(DNFB)(DNFB)反應(yīng)反應(yīng)(sanger(sanger反應(yīng)反應(yīng)):): 用于蛋白質(zhì)用于蛋白質(zhì)N-N-端測定端測定。 c. c. 與苯異硫氰酯（與苯異硫氰酯（PITCPITC）反應(yīng)）反應(yīng)(Edman(Edman反應(yīng)反應(yīng))

4、)， 用于蛋白用于蛋白N-N-端測定，蛋白質(zhì)順序測定儀設(shè)計原理端測定，蛋白質(zhì)順序測定儀設(shè)計原理 依據(jù)。依據(jù)。 3.3.重要化學(xué)反應(yīng)重要化學(xué)反應(yīng) 氨基酸與茚三酮反應(yīng)氨基酸與茚三酮反應(yīng) + 3H20 水合茚三酮水合茚三酮(無色無色) NH3 CO2 RCHO + 還原性茚三酮還原性茚三酮 紫色化合物紫色化合物 (弱酸弱酸) 加熱加熱 水合茚三酮水合茚三酮 + 2NH3 + 還原性茚三酮還原性茚三酮 氨基酸與氨基酸與2,42,4一二硝基氟苯一二硝基氟苯(DNFB)(DNFB)的反應(yīng)的反應(yīng) （sangersanger反應(yīng)）反應(yīng)） DNFB（dinitrofiuorobenzene） DNP-AA(黃色

5、黃色) + + HF 弱鹼中弱鹼中 氨基酸氨基酸 氨基酸與苯異硫氰酯（氨基酸與苯異硫氰酯（PITCPITC）的反應(yīng)）的反應(yīng) （EdmanEdman反應(yīng)）反應(yīng)） PITC（phenylisothiocyanate） + 苯乙內(nèi)酰硫脲衍生物苯乙內(nèi)酰硫脲衍生物(PTH-AA) （phenylisothiohydantion-AA） 弱鹼中弱鹼中 (400 C) (硝基甲烷硝基甲烷 400 C) H+ 二、蛋白質(zhì)的性質(zhì)二、蛋白質(zhì)的性質(zhì) v蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)(protein)是由許多氨基酸是由許多氨基酸(amino acids)通過肽鍵通過肽鍵(peptide bond)相連形成的相連形成的 高分子含氮化合物

6、高分子含氮化合物。 2.1蛋白質(zhì)為什么能作為藥物蛋白質(zhì)為什么能作為藥物? 1）作為生物催化劑（酶）作為生物催化劑（酶） 2）代謝調(diào)節(jié)作用）代謝調(diào)節(jié)作用(胰島素調(diào)節(jié)血糖胰島素調(diào)節(jié)血糖) 3）免疫保護(hù)作用）免疫保護(hù)作用(白介素和干擾素白介素和干擾素) 4）物質(zhì)的轉(zhuǎn)運(yùn)和存儲）物質(zhì)的轉(zhuǎn)運(yùn)和存儲 5）運(yùn)動與支持作用）運(yùn)動與支持作用 6）參與細(xì)胞間信息傳遞）參與細(xì)胞間信息傳遞 2.2 蛋白質(zhì)元素組成的特點(diǎn)：蛋白質(zhì)元素組成的特點(diǎn)： v各種蛋白質(zhì)的含氮量很接近，平均為各種蛋白質(zhì)的含氮量很接近，平均為16。 v100克樣品中蛋白質(zhì)的含量克樣品中蛋白質(zhì)的含量 ( g % )= 每克樣每克樣 品含氮克數(shù)品含氮克數(shù)

7、6.25100 2.3 蛋白質(zhì)的基本單位蛋白質(zhì)的基本單位-氨基酸氨基酸 氨基酸的分類：氨基酸的分類： v非極性側(cè)鏈氨基酸非極性側(cè)鏈氨基酸 v非電離極性側(cè)鏈氨基酸非電離極性側(cè)鏈氨基酸 v酸性氨基酸酸性氨基酸 v堿性氨基酸堿性氨基酸 14 2.4 蛋白質(zhì)的性質(zhì)蛋白質(zhì)的性質(zhì) n 高分子有機(jī)物高分子有機(jī)物 n 蛋白質(zhì)膠體性質(zhì)蛋白質(zhì)膠體性質(zhì) n 兩性解離性質(zhì)及等電點(diǎn)兩性解離性質(zhì)及等電點(diǎn) n 蛋白質(zhì)的紫外吸收特性蛋白質(zhì)的紫外吸收特性 n 蛋白質(zhì)呈色反應(yīng)蛋白質(zhì)呈色反應(yīng) 15 蛋白質(zhì)為高分子有機(jī)物蛋白質(zhì)為高分子有機(jī)物 v蛋白質(zhì)水溶液具有親水膠體的性質(zhì)，還蛋白質(zhì)水溶液具有親水膠體的性質(zhì)，還 具有擴(kuò)散和具有擴(kuò)散和

8、沉降沉降作用，粘度大和不透過作用，粘度大和不透過 半透膜半透膜等。等。 v沉降常數(shù)（沉降常數(shù)（S）：）： v擴(kuò)散常數(shù)（擴(kuò)散常數(shù)（D）：）： v粘度：在一定溶質(zhì)濃度下，取決于溶質(zhì)粘度：在一定溶質(zhì)濃度下，取決于溶質(zhì) 的分子量和形狀。的分子量和形狀。 16 蛋白質(zhì)為兩性電解質(zhì)蛋白質(zhì)為兩性電解質(zhì) v蛋白質(zhì)分子至少具有一個自由氨基和蛋白質(zhì)分子至少具有一個自由氨基和 一個自由羧基，具有一個自由羧基，具有兩性解離性質(zhì)兩性解離性質(zhì)。 v蛋白質(zhì)電泳、離子交換。蛋白質(zhì)電泳、離子交換。 蛋白質(zhì)主要呈色反應(yīng)蛋白質(zhì)主要呈色反應(yīng) 雙縮脲反應(yīng)雙縮脲反應(yīng) 酚試劑反應(yīng)酚試劑反應(yīng) 蛋白質(zhì)定量、定性蛋白質(zhì)定量、定性 茚三酮反應(yīng)茚三

9、酮反應(yīng) 測定常用方法測定常用方法 18 雙縮脲反應(yīng)雙縮脲反應(yīng) v雙縮脲試劑的成分雙縮脲試劑的成分: :堿性硫酸銅溶液。堿性硫酸銅溶液。 v堿性溶液中，堿性溶液中，雙縮脲雙縮脲( (H H2 2NOCNOCNHNHCONHCONH2 2) )能與能與 CuCu2+ 2+作用，形成紫色或紫紅色的絡(luò)合物。 作用，形成紫色或紫紅色的絡(luò)合物。 19 Folin 酚反應(yīng)（酚反應(yīng)（Lowry） v 包括兩步反應(yīng)：包括兩步反應(yīng)： v（1）在堿性條件下，與銅試劑作用生成）在堿性條件下，與銅試劑作用生成蛋蛋 白質(zhì)銅絡(luò)合物白質(zhì)銅絡(luò)合物； v（2）此絡(luò)合物將磷鉬酸、磷鎢酸試劑還原，）此絡(luò)合物將磷鉬酸、磷鎢酸試劑還原，

10、 生成深藍(lán)色混合物，顏色深淺與蛋白含量生成深藍(lán)色混合物，顏色深淺與蛋白含量 成正相關(guān)。成正相關(guān)。 v660nm測定，靈敏度比雙縮脲法高測定，靈敏度比雙縮脲法高100倍。倍。 適于微量蛋白的測定。適于微量蛋白的測定。 蛋白質(zhì)的紫外吸收光譜蛋白質(zhì)的紫外吸收光譜 蛋白質(zhì)在遠(yuǎn)紫外光蛋白質(zhì)在遠(yuǎn)紫外光 區(qū)（區(qū)（200-230nm200-230nm）有較）有較 大的吸收，在大的吸收，在280nm280nm有有 一特征吸收峰，可利用一特征吸收峰，可利用 這一特性對蛋白質(zhì)進(jìn)行這一特性對蛋白質(zhì)進(jìn)行 定性定量鑒定。定性定量鑒定。 蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度/（mg/ml）=1.55A1cm - 0.76A1cm

11、280 260 測定范圍：測定范圍：0.10.5mg/ml 21 第二節(jié)第二節(jié) 氨基酸類藥物的分析氨基酸類藥物的分析 v一、氨基酸鑒別一、氨基酸鑒別 v二、氨基酸定量二、氨基酸定量 22 一、氨基酸鑒別一、氨基酸鑒別 v茚三酮茚三酮：溶液均顯藍(lán)紫色。：溶液均顯藍(lán)紫色。 v旋光性旋光性： v薄層色譜鑒別法薄層色譜鑒別法 ： v紫外光譜鑒別紫外光譜鑒別：酪氨酸、色氨：酪氨酸、色氨 酸、苯丙氨酸，在紫外區(qū)有最酸、苯丙氨酸，在紫外區(qū)有最 大吸收。大吸收。 v紅外光譜鑒別紅外光譜鑒別：壓制成溴化鉀：壓制成溴化鉀 片，在片，在4000667 cm-1范圍內(nèi)范圍內(nèi) 測定吸收圖譜。測定吸收圖譜。 23 二、氨

12、基酸定量二、氨基酸定量 v（一）（一）茚三酮法茚三酮法 v（二）三硝基苯磺酸法（二）三硝基苯磺酸法 v（三）銅復(fù)合物紫外吸收法（三）銅復(fù)合物紫外吸收法 v（四）（四）甲醛滴定法甲醛滴定法 v（五）（五）非水溶液滴定法非水溶液滴定法 v（六）（六）雙波長分光光度法雙波長分光光度法 v（七）（七）導(dǎo)數(shù)分光光度法導(dǎo)數(shù)分光光度法 v（八）（八） HPLCHPLC法法 24 （一）茚三酮法（一）茚三酮法 v茚三酮在酸性條件下和氨基酸反應(yīng)，氨基酸被氧化茚三酮在酸性條件下和氨基酸反應(yīng)，氨基酸被氧化 分解生成醛，放出氨和二氧化碳，分解生成醛，放出氨和二氧化碳，還原型茚三酮還原型茚三酮。 v還原型茚三酮與氨及另

13、一分子茚三酮縮合生成藍(lán)紫還原型茚三酮與氨及另一分子茚三酮縮合生成藍(lán)紫 色的物質(zhì)，最大吸收值波長色的物質(zhì)，最大吸收值波長570 nm。 v范圍：范圍：0.5-50g 25 （二）三硝基苯磺酸法（二）三硝基苯磺酸法 vTNBS在偏堿性的條件下與氨基酸反應(yīng)，先在偏堿性的條件下與氨基酸反應(yīng)，先 形成形成中間絡(luò)合物中間絡(luò)合物。 v酸性溶液中，中間絡(luò)合物轉(zhuǎn)化成酸性溶液中，中間絡(luò)合物轉(zhuǎn)化成TNB-氨基氨基 酸酸，吸收值移至，吸收值移至340nm處。處。 26 （三）銅復(fù)合物紫外吸收法（三）銅復(fù)合物紫外吸收法 v在合適的在合適的pH條件下，二分子條件下，二分子-氨基酸與一分子氨基酸與一分子 銅離子形成銅離子形

14、成氨基酸氨基酸-銅復(fù)合物銅復(fù)合物。 v復(fù)合物呈藍(lán)色，除了在復(fù)合物呈藍(lán)色，除了在620nm有吸收峰外，在有吸收峰外，在 230nm有最大吸收有最大吸收 v蛋白質(zhì)水解速度和蛋白質(zhì)水解速度和水解程度水解程度的測定。的測定。 27 （四）甲醛滴定法（四）甲醛滴定法 v在在pH中性下，甲醛迅速與氨基酸上的氨基結(jié)中性下，甲醛迅速與氨基酸上的氨基結(jié) 合，使平衡合，使平衡向右移動向右移動，促進(jìn)氫離子釋放，使，促進(jìn)氫離子釋放，使 溶液酸度增加。溶液酸度增加。 v每釋放出一個氫離子，相當(dāng)有一個每釋放出一個氫離子，相當(dāng)有一個氨基氮。氨基氮。 28 （五）非水溶液滴定法（五）非水溶液滴定法 v非水溶液滴定法：是氨基酸

15、在非水溶液滴定法：是氨基酸在冰醋酸中冰醋酸中用用高高 氯酸的標(biāo)準(zhǔn)溶液氯酸的標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定其含量。滴定其含量。 v酸堿的質(zhì)子學(xué)說：一切能給出質(zhì)子的物質(zhì)為酸堿的質(zhì)子學(xué)說：一切能給出質(zhì)子的物質(zhì)為 酸，能接受質(zhì)子的物質(zhì)為堿。酸，能接受質(zhì)子的物質(zhì)為堿。 v弱堿在酸性溶劑中堿性顯得更強(qiáng)弱堿在酸性溶劑中堿性顯得更強(qiáng)，而弱酸在，而弱酸在 堿性溶劑中酸性顯得更強(qiáng)。堿性溶劑中酸性顯得更強(qiáng)。 v適合適合成品成品測定，測定范圍是幾十毫克。測定，測定范圍是幾十毫克。 29 非水溶液滴定法非水溶液滴定法 v直接滴定法直接滴定法：適用于能：適用于能溶于溶于冰醋酸的氨基冰醋酸的氨基 酸。丙氨酸、精氨酸、組氨酸、亮氨酸、酸。丙氨

16、酸、精氨酸、組氨酸、亮氨酸、 苯丙氨酸、色氨酸、蘇氨酸等。苯丙氨酸、色氨酸、蘇氨酸等。 v回滴法回滴法：適用于不能：適用于不能溶于冰醋酸而能溶于溶于冰醋酸而能溶于 高氯酸高氯酸的氨基酸。賴氨酸、絲氨酸、半胱的氨基酸。賴氨酸、絲氨酸、半胱 氨酸等。氨酸等。 30 （六）（六）雙波長分光光度法雙波長分光光度法 v消除共存組分干擾消除共存組分干擾 v等吸收波長的選擇等吸收波長的選擇:復(fù)方氨基酸復(fù)方氨基酸 注射液在注射液在320280 nm范圍內(nèi)，范圍內(nèi)， 只有只有色氨酸和酪氨酸色氨酸和酪氨酸有吸收度。有吸收度。 v酪氨酸在酪氨酸在280，303.2波長處吸波長處吸 收度相等，收度相等，選用選用280

17、與與303.2nm 為等吸收波長為等吸收波長。 31 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 v精密吸取精密吸取1.2，2.0，3.0，4.0，5.0， 6.0ml色氨酸對照品色氨酸對照品溶液，置溶液，置100 ml 量瓶中，用氫氧化鈉液稀釋至刻度，量瓶中，用氫氧化鈉液稀釋至刻度， 在在280，303.2nm處分別測定，計算處分別測定，計算 吸收度差值吸收度差值A(chǔ) 。 v在在0.53.0mg/100ml范圍，范圍，濃度與吸濃度與吸 收度差值呈良好性關(guān)系收度差值呈良好性關(guān)系。 32 （七）、（七）、導(dǎo)數(shù)分光光度法導(dǎo)數(shù)分光光度法 v選定導(dǎo)數(shù)光譜波長范圍為選定導(dǎo)數(shù)光譜波長范圍為322270nm，按導(dǎo)數(shù)分光按導(dǎo)數(shù)分光 光度法測定色氨酸、酪氨酸的一階，二階和三階導(dǎo)光度法測定色氨酸、酪氨酸的一階，二階和三階導(dǎo) 數(shù)光譜。數(shù)光譜。 v在在三階導(dǎo)數(shù)光譜三階導(dǎo)數(shù)光譜中色氨酸在中色氨酸在287、284、280nm有三有三 個導(dǎo)數(shù)光譜峰，而酪氨酸在零線上，選定三階導(dǎo)數(shù)個導(dǎo)數(shù)光譜峰，而酪氨酸在零線上，選定三階導(dǎo)數(shù) 分光光度法。分光光度法。 33 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制 v對照品對照品色氨酸色