結(jié)核分枝桿菌研究論文

1、結(jié)核分枝桿菌研究論文【關(guān) 鍵 詞】 結(jié) 核 分 枝 桿 菌Immun eresp on sesa ndprotectiveeficacyi nducedi nm icebyMycobact eriumtuberculosisMPT64ESAT6fusi on prote in【Abstract AIM:Toevaluatehumorala ndcellmediatedim mun eresp on sesbyMPT64a n dESAT6fusio nprotei nsan dtotestprotectiveefficacyagai nstMyco bacteriumtuberculosis(

2、MTB)challe nge.METHODS:BALB/cmicewerei mmun ized3timesat2weeki ntervalsubcuta neously on thebackwithfus ion protei nMPT64ESAT6.l nthesplee nlymphocytesofim mun izedmices timulati onin dex(SI)wasmeasuredbyMTTmethoda ndthelevelofsecre tedIFN y wasdetectedbyELISA.SomeofvaccinatedBALB/cmicebyfusi on pro

3、tei nswere in trave nouslyi nfectedwith1x 105CFUMTBstrai nH37Rv.Fourweekslater,bacterialloadi nsplee nswasdetermi ned.RESULTS:Thetiterofseras pecifica ntibodyi nBALB/cmiceim mun izedwithfusio nexpressi onpro tein MPT64ESAT6was 1 15OO.TheSloflymphocytesi nfusio nprote ini mmun izedgroupwas2.23,sig ni

4、fica ntlyhighertha nthatofsali neimm unizedgroup(0.88).ThelFN丫 levelinculturesupernatantofspleenlymphocytesfromthemiceim mun izedwithfusio nprotei nswere(4.28 士 0.27)卩 g/L,significantlyhigherthanthatofsalineimmunizedgr oup(0.48 士 0.17)卩 g/L,P0.05 ,butlowerthanthatofBacillusCalme tteGueri n(BCG)im mu

5、n izedgroup(5.18 士 0.31)卩 g/L .Comparedwithsalineimmunizedmice(bacterialloadwas6.45 士 0.17 ) ,dramaticreductionswereobserv edforMTBreplicatio nin thesplee nfromBALB/cmiceim mun izedwithfu sion prote in s(bacterialoadwas5.04士 0.11)followi ngasubseque ntchalle nge,buttheprotectiveefficacyi nm iceim mu

6、n izedwithMPT64E SAT6was no tasgoodasthatofBCGim mun izedgroup(bacterialloadwas4 .38 士 0.22).CONCLUSION:MPT64andESAT6fusionproteinscouldbeuse dasa no velcomp onen tofthe newTBvacc ine.【 Keywords Mycobacteriumtuberculosis ; vaccine ; MPT64; ESAT6 ; fusionexpression 【摘要目的：測(cè)定 MPT64與 ESAT6融合蛋白在小 鼠體內(nèi)誘導(dǎo)的免

7、疫應(yīng)答及保護(hù)力.方法：將MPT64與ESAT6的融合蛋 白皮下免疫小鼠3次，每次間隔2wk, ELISA測(cè)定免疫小鼠血清特異 性抗體的滴度.最后一次免疫完成后 4wk,分離部分免疫小鼠脾淋巴 細(xì)胞，MTT法檢測(cè)淋巴細(xì)胞刺激指數(shù)，ELISA檢測(cè)懸液中IFNy水平. 另一部分免疫的BALB/c小鼠經(jīng)尾靜脈感染MTB毒株H37Rv 4wk后計(jì) 數(shù)脾臟細(xì)菌負(fù)荷數(shù).結(jié)果：MPT64ESAT融合蛋白免疫小鼠血清特異性 抗體滴度1 : 1500,免疫小鼠后淋巴細(xì)胞刺激增殖指數(shù)為 2.23 ,而生 理鹽水免疫組只有 0.88 ;脾淋巴細(xì)胞懸液中誘發(fā)的 IFN 丫為(4.28 士 0.27 )卩g/L ,顯著高

8、于生理鹽水免疫組(0.48 士 0.17 )卩 g/L , P0.05,但不及 BCG免疫組(5.18 士 0.31 )卩 g/L .與生理鹽水免疫組（細(xì)菌負(fù)荷6.45 士 0.17 ）相比較，融合蛋白免疫的小鼠， 對(duì)攻擊感染后抗MTB在脾臟中增殖有顯著作用，細(xì)菌負(fù)荷為 5.04 士 0.11，但與BCG免疫組相比脾臟細(xì)菌負(fù)荷減少甚微（細(xì)菌負(fù)荷4.38 士 0.22 ）.結(jié)論：MPT64與ESAT6融合蛋白可作為新型結(jié)核疫苗 的候選組分.【關(guān)鍵詞】結(jié)核分枝桿菌；疫苗； MPT64 ESAT6融合 表達(dá)0引言ESAT6（Mr6000的早期分泌蛋白）和MPT64是結(jié)核分支桿 菌（Mycobacte

9、riumtuberculosis , MTB中重要的保護(hù)性抗原，編碼 這兩種蛋白的基因只存在于MTB毒株中而卡介苗（BacillusCalmetteGueri n,BCG ）中缺失1,研究發(fā)現(xiàn)重組的 MPT64 和ESAT6蛋白免疫小鼠后均可有效抵抗 MTB感染.本研究在成功獲得 MPT64與 ESAT6融合蛋白的基礎(chǔ)上2,研究該融合蛋白在小鼠體內(nèi) 誘導(dǎo)的免疫應(yīng)答水平和對(duì) MTB毒株H37Rv攻擊的保護(hù)力.1材料和方 法1.1材料MTB毒株H37Rv由陜西省結(jié)核病防治研究所王瑞副主任技 師惠贈(zèng)；卡介苗疫苗株由蘭州生物制品研究所出品（國藥準(zhǔn)字 SF20010035批號(hào)20011201）;鼠IFN

10、y和ELISA檢測(cè)試劑盒購自晶 美公司；潮霉素（GIBCOBRL公司）.BCG培養(yǎng)增強(qiáng)齊I（albumindextrosecatalaseADC ）和 RPMI1640培養(yǎng)基均購自 GIBCO 公司.7H9液體培養(yǎng)基購自美國Difco公司；改良羅氏培養(yǎng)基由本室 自制，MTB的培養(yǎng)濾液蛋白（culturefiltrateproteins,CFP）由本室制備.羊抗鼠IgGHRF購自華美生物公司.68周齡BALB/c小鼠，雌性， 由第四軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，飼養(yǎng)于第四軍醫(yī)大學(xué)動(dòng)物中心感染實(shí)驗(yàn)室.1.2方法1.2.1MTB毒株H37RV的培養(yǎng)和定量取羅氏培養(yǎng)基中保存的MTB毒株H37RV接種到7H

11、9培養(yǎng)基(含 100g/LADC和 0.5g/LTween80)，37C振搖培養(yǎng) 3wk, 5000r/min 離心 10min,收集 細(xì)菌，保存于-20C備用.用7H9液體培養(yǎng)基系列稀釋濃縮液，接種于 羅氏培養(yǎng)基37C培養(yǎng)2wk計(jì)數(shù)濃縮液細(xì)菌的CFU.1.2.2BCG的培養(yǎng) 和定量取 BCG疫苗株接種到 7H9液體培養(yǎng)基(含 100g/LADC和 0.5g/LTween80),相同方法培養(yǎng)、收集BCG并計(jì)數(shù)細(xì)菌的菌落形成 單位(colonyformingunits,CFU ) .1.2.3 融合蛋白的大量制備取 MPT64pProEXHTESA陽生克隆2,活化后分別接種到1000mLLB培

12、養(yǎng)液中，37 C振搖培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長期，IPTG誘導(dǎo)，集菌，先進(jìn)行 SDSPAGE采用 Invitrogen 的NiNTA純化試劑盒純化目的蛋白，分光 光度法測(cè)定蛋白濃度.1.2.4免疫動(dòng)物實(shí)驗(yàn)隨機(jī)分為3組，每組10只 小鼠，一組用MPT64ESAT融合蛋白免疫BALB/c小鼠；免疫劑量均為 1mg/只，共免疫3次，第一次和第二次免疫加有不完全福氏佐劑，第 三次單純免疫融合蛋白，每次間隔2wk,免疫結(jié)束后，收集小鼠血清， 用CFP作為抗原，ELISA測(cè)定免疫小鼠血清特異性抗體滴度，其余兩 組分別為BCG和生理鹽水對(duì)照組.最后一次免疫結(jié)束后4wk,進(jìn)行以 下實(shí)驗(yàn)：每組取5只小鼠，用于測(cè)定淋巴細(xì)胞刺

13、激指數(shù) (stimulationindex,SI)和IFN y水平；其余 5只用于毒株攻擊實(shí)驗(yàn).1.2.5 脾臟淋巴細(xì)胞的分離與制備將免疫的小鼠斷頸處死，無菌 取脾臟，置于平皿內(nèi)200目的鋼網(wǎng)上，用注射器針芯研磨，并加入 RPMI1640培養(yǎng)液沖洗.將上述細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)入2倍體積的淋巴細(xì)胞分離液，1000r/min離心20min.吸取中間單核細(xì)胞層，用 RPIM1640液洗 滌兩次后計(jì)數(shù).1.2.6 特異性淋巴細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)將分離的淋巴細(xì)胞濃 度調(diào)整至5X108/L，在96孔板中用100mL/LFCS勺R(shí)PMI1640完全培 養(yǎng)液培養(yǎng)，200卩L/孔，同時(shí)實(shí)驗(yàn)組每孔加入 25卩LMTBCFR25mg

14、/L 溶于PBS本室制備），對(duì)照組不加 CFP調(diào)零孔不加脾細(xì)胞， 37C 50mL/LCO2孵箱培養(yǎng) 68h 后，每孔加 20 LMTT（5g/L,溶于 PBS PH7.2,過濾除菌），繼續(xù)培養(yǎng)4h后棄上清，加DMSO15QL/孔，振 蕩10min,測(cè)定A490nmf直.結(jié)果用刺激指數(shù)SI=實(shí)驗(yàn)組A值/對(duì)照組A 值表示.1.2.7IFN 丫的誘生及含量的測(cè)定5X 109/L脾細(xì)胞在24孔板 用含10mL/LFCS的RPMI1640完全培養(yǎng)液中培養(yǎng)，800卩L/孔，同時(shí)加 入MTBCFP1的L/孔，37C50mL/LCO2孵箱培養(yǎng)72h,收集培養(yǎng)液， 5000r/min離心5min,取上清，-2

15、0C凍存?zhèn)錂z.參照試劑盒說明（夾 心ELISA法）測(cè)定各標(biāo)本所含IFN 丫濃度.1.2.8MTB毒株H37Rv的攻 擊實(shí)驗(yàn)最后一次免疫完成后4wk用MTB毒株H37Rv經(jīng)尾靜脈感染小 鼠，劑量為105CFU只，412wk后，斷頸處死小鼠，脾臟勻漿， 計(jì)數(shù)細(xì)菌CFU統(tǒng)計(jì)學(xué)處理：實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以x 士 s表示,統(tǒng)計(jì)分析采用單 因素方差分析，兩兩比較采用LSDt檢驗(yàn),P0.05有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義.2結(jié)果 2.1小鼠體內(nèi)特異性抗體滴度 MPT64ESAT融合蛋白免疫小鼠三次后 血清特異性抗體滴度平均值為1 : 1500.2.2抗原特異性脾臟淋巴細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)分離免疫小鼠的脾臟淋巴細(xì)胞，在體外用CFP抗原刺激，測(cè)定了

16、淋巴細(xì)胞的增殖反應(yīng)，與生理鹽水對(duì)照組（SI為0.88 ）相比較融合蛋白MPT64ESAT免疫小鼠的脾淋巴細(xì)胞增殖明顯，SI為2.23 , BCG免疫組SI為3.58，高于融合蛋白免疫組.2.3脾臟淋巴細(xì)胞中誘 生的IFNy水平MPT64ESAT免疫的小鼠的脾淋巴細(xì)胞懸液，體外用 CFP刺激，其懸液IFNy含量分別為（4.28 士 0.27 ）卩g/L，與生理 鹽水對(duì)照組（0.48 士 0.17）卩g/L相比較有明顯增加（P0.05），但不 及 BCG免疫組（5.18 士 0.31 ）卩 g/L,P0.05 （圖 1） .2.4 免疫小鼠 對(duì)MTB毒株攻擊時(shí)的抵抗作用免疫完成后 4wk, H37

17、Rv經(jīng)尾靜脈感染 BALB/c小鼠，4wk后計(jì)數(shù)脾臟細(xì)菌負(fù)荷數(shù)，與生理鹽水免疫組（細(xì)菌 負(fù)荷數(shù)6.45 士 0.17 ）相比較，融合蛋白 MPT64ESAT免疫的BALB/c 小鼠，對(duì)攻擊感染后抗MTB在脾臟中增殖有顯著作用（細(xì)菌負(fù)荷數(shù)分 別為5.04 士 0.11 ），但與BCG免疫組（細(xì)菌負(fù)荷數(shù)為4.38 士 0.22 ）相 比較脾臟細(xì)菌負(fù)荷減少甚微.aP0.05vs生理鹽水.n=5.圖1融合蛋白 在小鼠脾臟淋巴細(xì)胞中誘生的IFNy水平（略）3討論卡介苗（BCG 是目前唯一的預(yù)防結(jié)核病疫苗，但其對(duì)成年人結(jié)核病的預(yù)防效果不穩(wěn) 定，保護(hù)力常發(fā)生變化（080% :3,因此，研制全面有效的新疫苗

18、是控制結(jié)核病的重要途徑.融合亞單位疫苗具有成分明確，使用安全， 可減少純化步驟等優(yōu)點(diǎn)而受到國內(nèi)外的重視.目前已知的保護(hù)性抗原有MTB早期分泌蛋白Ag85B復(fù)合物、ESAT6和MPT6C4等，選擇這 幾種抗原制備的亞單位疫苗可誘導(dǎo)強(qiáng)烈的特異性免疫應(yīng)答，并不受先前接觸分枝桿菌的影響.單個(gè)蛋白構(gòu)成的亞單位疫苗產(chǎn)生的特異性體 液和細(xì)胞免疫應(yīng)答是針對(duì)每一組分抗原的，機(jī)體獲得的免疫保護(hù)力有 限，因此新型TB疫苗著重于融合多個(gè)免疫表位5.本研究中將純化的MPT64與ESAT6融合蛋白，免疫小鼠，特異性抗體滴度可達(dá)到 1 : 1500,顯著高于已報(bào)道文獻(xiàn)6中抗體的滴度，融合蛋白免疫三 次后，小鼠特異性淋巴細(xì)胞

19、增殖指數(shù)顯著升高，說明淋巴細(xì)胞被有效活化.IFN 丫常被認(rèn)為是抵抗MTB感染的一個(gè)關(guān)鍵性細(xì)胞因子，也是 Th1型細(xì)胞免疫反應(yīng)的重要指標(biāo)，TB的保護(hù)性效應(yīng)與分泌IFN 丫的淋 巴細(xì)胞的產(chǎn)生密切相關(guān).融合蛋白MPT64ESAT免疫小鼠誘生的IFN y 水平顯著高于生理鹽水對(duì)照組 （P0.05）,提示這兩種融合基因可能是 TB疫苗中理想的候選基因.MTB毒株攻擊實(shí)驗(yàn)中，與生理鹽水組相比 較，MPT64ESAT免疫組使得細(xì)菌數(shù)由6.45 士 0.17降為5.04 士 0.11 , 有效控制了 MTB勺感染，但與BCG免疫組相比免疫保護(hù)力還是有一定 差距.研究發(fā)現(xiàn)，單獨(dú)使用結(jié)核桿菌短期培養(yǎng)液中分離純化的

20、分泌型 蛋白免疫動(dòng)物，只會(huì)產(chǎn)生很弱的免疫應(yīng)答，亞單位疫苗必須配以適宜 的佐劑多次接種才能達(dá)到效果7,在本研究中，采用不完全福氏佐 劑具有很強(qiáng)的免疫調(diào)節(jié)作用，可刺激產(chǎn)生 IL2 , IFNy和IL12，是本 室較常用的一種免疫策略.MPT64ESAT融合蛋白誘導(dǎo)的保護(hù)力有限， 分析原因可能是因?yàn)楸Ｗo(hù)性抗原種類不多，難以誘導(dǎo)產(chǎn)生廣泛而全面的細(xì)胞免疫應(yīng)答；同時(shí)蛋白質(zhì)在體內(nèi)的滯留時(shí)間短并且其產(chǎn)生的免疫 應(yīng)答的持續(xù)時(shí)間也較短，需選擇合適的劑量8,多次免疫才能達(dá)到 有效的保護(hù)水平.【參考文獻(xiàn)】1KamathAT,Fe ngCG,Macdo naldM,etal.Differe ntialprotectiveeffic acyofDNAvacci nesexpressi ngsecretedprotei nsofMycobacteriumtuberculosis J .Infectlmmun,1999,67(4):1702-1707.2師長宏，王曉武，朱德生，等.結(jié)核分枝桿菌差異蛋白MPT64與 ESAT6的融合表 達(dá)與純化J.第四軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào)，2005,26(20):1840-1842.:3范雄林，徐志凱,李元,等.結(jié)核分枝桿菌Ag85B成熟蛋白基因免疫J. 第四 軍醫(yī)大 學(xué)學(xué)報(bào)，2001,22(14):1283-128