第3章高效液相色譜分析法 HPLC

1、2021-7-1Instrumental Analysis 化學(xué)化工學(xué)院 1 特指一種用液體為流動(dòng)相的色譜特指一種用液體為流動(dòng)相的色譜 分離分析方法。它在經(jīng)典色譜理論的基礎(chǔ)上，采用了分離分析方法。它在經(jīng)典色譜理論的基礎(chǔ)上，采用了 高壓泵、化學(xué)鍵合固定相高效分離柱、高靈敏專用檢高壓泵、化學(xué)鍵合固定相高效分離柱、高靈敏專用檢 測(cè)器等新實(shí)驗(yàn)技術(shù)建立的一種液相色譜分析法。測(cè)器等新實(shí)驗(yàn)技術(shù)建立的一種液相色譜分析法。 2021-7-1Instrumental Analysis 化學(xué)化工學(xué)院 2 高壓：高壓：150-350105 Pa 高速：高速：一般在一般在1h內(nèi)完成內(nèi)完成 高效：大于高效：大于30000

2、塔板塔板/米米 高靈敏：高靈敏：10-9g （紫外檢測(cè)）、（紫外檢測(cè)）、10-11g （熒光檢測(cè)）（熒光檢測(cè)） 1分析對(duì)象的區(qū)別分析對(duì)象的區(qū)別 GC：適于能氣化、熱穩(wěn)定性好、且沸點(diǎn)較低的樣：適于能氣化、熱穩(wěn)定性好、且沸點(diǎn)較低的樣 品；但對(duì)高沸點(diǎn)、揮發(fā)性差、熱穩(wěn)定性差、離子型及品；但對(duì)高沸點(diǎn)、揮發(fā)性差、熱穩(wěn)定性差、離子型及 高聚物的樣品，尤其對(duì)大多數(shù)生化樣品不可檢測(cè)占有高聚物的樣品，尤其對(duì)大多數(shù)生化樣品不可檢測(cè)占有 機(jī)物的機(jī)物的20%。 2021-7-1Instrumental Analysis 化學(xué)化工學(xué)院 3 HPLC：適于溶解后能制成溶液的樣品（包括有：適于溶解后能制成溶液的樣品（包括有

3、機(jī)介質(zhì)溶液），不受樣品揮發(fā)性和熱穩(wěn)定性的限制，機(jī)介質(zhì)溶液），不受樣品揮發(fā)性和熱穩(wěn)定性的限制， 對(duì)分子量大、難氣化、熱穩(wěn)定性差的生化樣品及高分對(duì)分子量大、難氣化、熱穩(wěn)定性差的生化樣品及高分 子和離子型樣品均可檢測(cè)。用途廣泛，占有機(jī)物的子和離子型樣品均可檢測(cè)。用途廣泛，占有機(jī)物的 80%。 GCGC：流動(dòng)相為惰性，氣體組分與流動(dòng)相無(wú)親合作用：流動(dòng)相為惰性，氣體組分與流動(dòng)相無(wú)親合作用 力，只與固定相有相互作用。力，只與固定相有相互作用。 2021-7-1Instrumental Analysis 化學(xué)化工學(xué)院 4 HPLC HPLC：流動(dòng)相為液體，流動(dòng)相與組分間有親合作用：流動(dòng)相為液體，流動(dòng)相與組分

4、間有親合作用 力，能提高柱的選擇性、改善分離度，對(duì)分離起正向力，能提高柱的選擇性、改善分離度，對(duì)分離起正向 作用。且流動(dòng)相種類較多，選擇余地廣，改變流動(dòng)相作用。且流動(dòng)相種類較多，選擇余地廣，改變流動(dòng)相 極性和極性和pHpH值也對(duì)分離起到調(diào)控作用，當(dāng)選用不同比例值也對(duì)分離起到調(diào)控作用，當(dāng)選用不同比例 的兩種或兩種以上液體作為流動(dòng)相也可以增大分離選的兩種或兩種以上液體作為流動(dòng)相也可以增大分離選 擇性。擇性。 GCGC：加溫操作：加溫操作 HPLCHPLC：室溫；高壓（液體粘度大，峰展寬小）：室溫；高壓（液體粘度大，峰展寬?。?2021-7-1Instrumental Analysis 化學(xué)化工學(xué)院

5、 5 理論與氣相色譜一致。理論與氣相色譜一致。 理理 nLH/ 22 21 2 )(16)(54. 5)( W t W tt n RRR 理 effeff nLH/ 2 21 2 )(54. 5)(16 W t W t n RR eff 0 t t k R 2 ) 1 ( k k nneff 理 2021-7-1Instrumental Analysis 化學(xué)化工學(xué)院 6 1、 （填充柱）：uCuBAHGC/ （毛細(xì)管柱）或uCuBH/ dpA2dpA gm DDB22 gR DBtB， M T D T D gg 或 2021-7-1Instrumental Analysis 化學(xué)化工學(xué)院 7

6、 2、 討論：討論： 1）流動(dòng)相流速對(duì)）流動(dòng)相流速對(duì)HPLC板高的影響（與板高的影響（與GC對(duì)比）對(duì)比） R tnHu uHscmu ，但柱效， 時(shí)，/1 （忽略縱向擴(kuò)散項(xiàng)后）：uHHHHPLC se mdd DCH T Dm 相忽略大低，流動(dòng)相柱溫BT 2021-7-1Instrumental Analysis 化學(xué)化工學(xué)院 8 2）渦流擴(kuò)散項(xiàng)及其影響）渦流擴(kuò)散項(xiàng)及其影響 dpH e 2dpHe 柱效，nHAdp 2021-7-1Instrumental Analysis 化學(xué)化工學(xué)院 9 3）縱向擴(kuò)散項(xiàng)）縱向擴(kuò)散項(xiàng) 分子在液相中的擴(kuò)散系數(shù)比氣相中要小分子在液相中的擴(kuò)散系數(shù)比氣相中要小4-5

7、個(gè)數(shù)量個(gè)數(shù)量 級(jí)，當(dāng)流動(dòng)相的線速度大于級(jí)，當(dāng)流動(dòng)相的線速度大于 0.5 cm/s時(shí)，此項(xiàng)可以忽時(shí)，此項(xiàng)可以忽 略。略。 4）傳質(zhì)阻力項(xiàng)及其影響）傳質(zhì)阻力項(xiàng)及其影響 （1）固定相傳質(zhì)阻力項(xiàng)）固定相傳質(zhì)阻力項(xiàng) u DC H md d u D dC H s fs s 2 2021-7-1Instrumental Analysis 化學(xué)化工學(xué)院 10 （2）流動(dòng)相傳質(zhì)阻力項(xiàng)）流動(dòng)相傳質(zhì)阻力項(xiàng) 流動(dòng)的流動(dòng)相傳質(zhì)阻力項(xiàng)流動(dòng)的流動(dòng)相傳質(zhì)阻力項(xiàng) 滯留的流動(dòng)相傳質(zhì)阻力項(xiàng)滯留的流動(dòng)相傳質(zhì)阻力項(xiàng) u D dC H m pm m 2 u D dC H m psm sm 2 2021-7-1Instrumental A

8、nalysis 化學(xué)化工學(xué)院 11 ）（忽略固定相傳質(zhì)阻抗 smmssmmt HHHHHH m smm D dp HH 2 m D dp H 2 T Dm 柱效，nHHdp t 柱效，nHDm ，柱阻， ，但易產(chǎn)生氣泡 m tm DT HDT uCuCHHHPLC smme ： 2021-7-1Instrumental Analysis 化學(xué)化工學(xué)院 12 2021-7-1Instrumental Analysis 化學(xué)化工學(xué)院 13 結(jié)論：結(jié)論： 1、提高柱效，必須提高柱內(nèi)填料裝填的均勻、提高柱效，必須提高柱內(nèi)填料裝填的均勻 性和減小粒度以加快傳質(zhì)速率。性和減小粒度以加快傳質(zhì)速率。 2、液相

9、色譜的柱效比氣相高的多，且流速比、液相色譜的柱效比氣相高的多，且流速比 GC流速小近一個(gè)數(shù)量級(jí)。流速小近一個(gè)數(shù)量級(jí)。 3、HPLC還要主意柱外展寬，包括柱前擴(kuò)展和還要主意柱外展寬，包括柱前擴(kuò)展和 柱后擴(kuò)展，前者主要是由進(jìn)樣所引起，后者主柱后擴(kuò)展，前者主要是由進(jìn)樣所引起，后者主 要是由連接管、檢測(cè)器流通池體積所引起。要是由連接管、檢測(cè)器流通池體積所引起。 2021-7-1Instrumental Analysis 化學(xué)化工學(xué)院 14 化學(xué)鍵合固定相色譜化學(xué)鍵合固定相色譜 （CBC） （1）分離機(jī)制：利用組分在兩相中溶解度的差異）分離機(jī)制：利用組分在兩相中溶解度的差異 （2）固定相：載體）固定相：

10、載體+固定液（物理或機(jī)械涂漬法）固定液（物理或機(jī)械涂漬法） 缺點(diǎn)：系統(tǒng)內(nèi)部壓力大，易流失，不實(shí)用缺點(diǎn)：系統(tǒng)內(nèi)部壓力大，易流失，不實(shí)用 固定液固定液極性極性 固定液固定液非極性非極性 2021-7-1Instrumental Analysis 化學(xué)化工學(xué)院 15 （3）正相色譜正相色譜固定液極性固定液極性 流動(dòng)相極性流動(dòng)相極性 極性小的組分先出柱，極性大的組分后出柱適于極性小的組分先出柱，極性大的組分后出柱適于 分離極性組分分離極性組分。 反相色譜反相色譜固定液極性固定液極性 流動(dòng)相極性流動(dòng)相極性 極性大的組分先出柱，極性小的組分后出柱適于極性大的組分先出柱，極性小的組分后出柱適于 分離非極性組

11、分。分離非極性組分。 （一）常規(guī)化學(xué)鍵合相（一）常規(guī)化學(xué)鍵合相 利用化學(xué)反應(yīng)將固定液的官能團(tuán)鍵合在載體表面。利用化學(xué)反應(yīng)將固定液的官能團(tuán)鍵合在載體表面。 （1）分離機(jī)制：分配）分離機(jī)制：分配 + 吸附（以吸附（以LLC為基礎(chǔ)）為基礎(chǔ)） 2021-7-1Instrumental Analysis 化學(xué)化工學(xué)院 16 （2）特點(diǎn)：）特點(diǎn)： 不易流失不易流失 熱穩(wěn)定性好熱穩(wěn)定性好 化學(xué)性能好化學(xué)性能好 載樣量大載樣量大 適于梯度洗脫適于梯度洗脫 2、液固吸附色譜法（、液固吸附色譜法（LSC） 流動(dòng)相為液體，固定相為固體吸附劑。流動(dòng)相為液體，固定相為固體吸附劑。 2021-7-1Instrumenta

12、l Analysis 化學(xué)化工學(xué)院 17 （1）分離機(jī)制：利用溶質(zhì)分子占據(jù)固定相表面吸附）分離機(jī)制：利用溶質(zhì)分子占據(jù)固定相表面吸附 活性中心能力的差異活性中心能力的差異 分離前提：分離前提：K K不等或不等或k k不等不等 m V S Kk )1 ( 0 m R V S Ktt 2021-7-1Instrumental Analysis 化學(xué)化工學(xué)院 18 （2）固定相：與）固定相：與LC比，固定相粒徑不同（比，固定相粒徑不同（17% 17% 分配色譜分配色譜 硅膠失活硅膠失活載體載體 吸附的水吸附的水固定液固定液 2021-7-1Instrumental Analysis 化學(xué)化工學(xué)院 21

13、 、離子對(duì)色譜離子對(duì)色譜ion pair chromatography ：將一種（或多種）與溶質(zhì)離子電荷相反的：將一種（或多種）與溶質(zhì)離子電荷相反的 離子（對(duì)離子或反離子）加到流動(dòng)相中使其與溶質(zhì)離離子（對(duì)離子或反離子）加到流動(dòng)相中使其與溶質(zhì)離 子結(jié)合形成疏水性離子對(duì)化合物，使其能夠在兩相之子結(jié)合形成疏水性離子對(duì)化合物，使其能夠在兩相之 間進(jìn)行分配。間進(jìn)行分配。 ：常采用烷基銨類，如氫氧化四丁基：常采用烷基銨類，如氫氧化四丁基 銨或氫氧化十六烷基三甲銨作為對(duì)離子。銨或氫氧化十六烷基三甲銨作為對(duì)離子。 ：常采用烷基磺酸類，如己烷磺酸鈉：常采用烷基磺酸類，如己烷磺酸鈉 作為對(duì)離子。作為對(duì)離子。 20

14、21-7-1Instrumental Analysis 化學(xué)化工學(xué)院 22 離子對(duì)色譜，根據(jù)流動(dòng)相和固定相的性質(zhì)可分為離子對(duì)色譜，根據(jù)流動(dòng)相和固定相的性質(zhì)可分為 正相和反相離子對(duì)色譜法正相和反相離子對(duì)色譜法 反相離子對(duì)色譜法（反相離子對(duì)色譜法（IPCIPC） 反相色譜中，非極性的疏水固定相反相色譜中，非極性的疏水固定相(C-18柱柱)，含有對(duì)，含有對(duì) 離子離子Y+的甲醇的甲醇-水或乙腈水或乙腈-水作為流動(dòng)相，試樣離子水作為流動(dòng)相，試樣離子X- 進(jìn)入流動(dòng)相后，生成疏水性離子對(duì)進(jìn)入流動(dòng)相后，生成疏水性離子對(duì)Y+ X -后；在兩相后；在兩相 間分配。這樣就增加間分配。這樣就增加k和和tR，以改善分離

15、。，以改善分離。 2021-7-1Instrumental Analysis 化學(xué)化工學(xué)院 23 1）離子對(duì)試劑：烷基磺酸鈉）離子對(duì)試劑：烷基磺酸鈉分析堿分析堿 四丁基季胺鹽四丁基季胺鹽分析酸分析酸 2）影響影響k的因素的因素 a與與m的極性有關(guān)（同反相色譜）的極性有關(guān)（同反相色譜） b與與R的鏈長(zhǎng)有關(guān)：的鏈長(zhǎng)有關(guān)：R長(zhǎng)，極性長(zhǎng)，極性小，小，tR，k 3）適用：較強(qiáng)的有機(jī)酸、堿）適用：較強(qiáng)的有機(jī)酸、堿 2021-7-1Instrumental Analysis 化學(xué)化工學(xué)院 24 它解決了以往一些難分離混合物的分離問(wèn)題，如它解決了以往一些難分離混合物的分離問(wèn)題，如 酸、堿和離子、非離子混合物，

16、特別是生化試樣核酸、酸、堿和離子、非離子混合物，特別是生化試樣核酸、 核苷、兒苶酚胺、生物堿及藥物。核苷、兒苶酚胺、生物堿及藥物。 2021-7-1Instrumental Analysis 化學(xué)化工學(xué)院 25 、離子交換色譜法（、離子交換色譜法（IEC） 離子交換色譜法是基于離子交換樹脂上可解離的離子交換色譜法是基于離子交換樹脂上可解離的 離子與流動(dòng)相中具有相同電荷的溶質(zhì)離子進(jìn)行可逆交離子與流動(dòng)相中具有相同電荷的溶質(zhì)離子進(jìn)行可逆交 換，根據(jù)這此離子對(duì)交換劑具有不同的親和力而將它換，根據(jù)這此離子對(duì)交換劑具有不同的親和力而將它 們進(jìn)行分離。們進(jìn)行分離。 2021-7-1Instrumental

17、Analysis 化學(xué)化工學(xué)院 26 離子色譜是在離子色譜是在20世紀(jì)世紀(jì)70年代中期發(fā)展起來(lái)的一年代中期發(fā)展起來(lái)的一 中技術(shù)，其與離子交換色譜的區(qū)別是其采用了特制中技術(shù)，其與離子交換色譜的區(qū)別是其采用了特制 的、具有極低交換容量的離子交換樹脂作為柱填料，的、具有極低交換容量的離子交換樹脂作為柱填料， 并采用淋洗液抑制技術(shù)和電導(dǎo)檢測(cè)器，是測(cè)定混合并采用淋洗液抑制技術(shù)和電導(dǎo)檢測(cè)器，是測(cè)定混合 陰離子的有效方法。陰離子的有效方法。 （1 1）離子色譜法原理）離子色譜法原理 離子交換原理，與傳統(tǒng)離子交換的不同點(diǎn)：離子交換原理，與傳統(tǒng)離子交換的不同點(diǎn)： 2021-7-1Instrumental Ana

18、lysis 化學(xué)化工學(xué)院 27 采用交換容量非常低的特制離子交換樹脂為固定相；采用交換容量非常低的特制離子交換樹脂為固定相； 細(xì)顆粒柱填料，高柱效；采用高壓輸液泵；細(xì)顆粒柱填料，高柱效；采用高壓輸液泵； 低濃度淋洗液或本底電導(dǎo)抑制（在分離柱后，采用低濃度淋洗液或本底電導(dǎo)抑制（在分離柱后，采用 抑制柱來(lái)消除淋洗液的高本底電導(dǎo)）；抑制柱來(lái)消除淋洗液的高本底電導(dǎo)）； 可采用電導(dǎo)檢測(cè)器，快速分離分析微量無(wú)機(jī)離子混可采用電導(dǎo)檢測(cè)器，快速分離分析微量無(wú)機(jī)離子混 合物；合物； 各種抑制裝置及無(wú)抑制方法的出現(xiàn)，發(fā)展迅速。各種抑制裝置及無(wú)抑制方法的出現(xiàn)，發(fā)展迅速。 2021-7-1Instrumental An

19、alysis 化學(xué)化工學(xué)院 28 如在陰離子分析中，試樣通過(guò)陰離子交換樹脂時(shí)，如在陰離子分析中，試樣通過(guò)陰離子交換樹脂時(shí)， 流動(dòng)相中待測(cè)陰離子（以流動(dòng)相中待測(cè)陰離子（以Br-為例）與樹脂上的為例）與樹脂上的OH-離離 子交換。洗脫反應(yīng)則為交換反應(yīng)的逆過(guò)程。在陰離子子交換。洗脫反應(yīng)則為交換反應(yīng)的逆過(guò)程。在陰離子 分離中，最簡(jiǎn)單的洗脫液是分離中，最簡(jiǎn)單的洗脫液是NaOH。當(dāng)待測(cè)陰離子從。當(dāng)待測(cè)陰離子從 柱子中被洗脫下來(lái)進(jìn)入電導(dǎo)池時(shí)，要求能檢測(cè)出洗脫柱子中被洗脫下來(lái)進(jìn)入電導(dǎo)池時(shí)，要求能檢測(cè)出洗脫 液中電導(dǎo)的改變。但由于待測(cè)離子的濃度很小，引起液中電導(dǎo)的改變。但由于待測(cè)離子的濃度很小，引起 的電導(dǎo)改變

20、非常小，導(dǎo)致靈敏度極差。若使分離柱流的電導(dǎo)改變非常小，導(dǎo)致靈敏度極差。若使分離柱流 出的洗脫液通過(guò)填充有高容量出的洗脫液通過(guò)填充有高容量H+型陽(yáng)離子交換的抑制型陽(yáng)離子交換的抑制 柱，則有：柱，則有： 2021-7-1Instrumental Analysis 化學(xué)化工學(xué)院 29 R-H+ + Na+OH-R-Na+ + H2O R-H+ +Na+Br-R-Na+ + H+Br- 故從抑制柱流出的洗脫液中，洗脫液故從抑制柱流出的洗脫液中，洗脫液(NaOH)已轉(zhuǎn)變成已轉(zhuǎn)變成 電導(dǎo)很小水，消除了本底電導(dǎo)的影響；試樣陰離子則電導(dǎo)很小水，消除了本底電導(dǎo)的影響；試樣陰離子則 被轉(zhuǎn)變成其相應(yīng)的酸，由于被轉(zhuǎn)變

21、成其相應(yīng)的酸，由于H+的離子淌度的離子淌度7倍于倍于Na+, 這就大大提高了檢測(cè)靈敏度。這就大大提高了檢測(cè)靈敏度。 如在陽(yáng)離子分析中，試樣通過(guò)陽(yáng)離子交換樹脂時(shí)，如在陽(yáng)離子分析中，試樣通過(guò)陽(yáng)離子交換樹脂時(shí)， 流動(dòng)相中待測(cè)陽(yáng)離子與樹脂上的流動(dòng)相中待測(cè)陽(yáng)離子與樹脂上的H+離子交換。洗脫反離子交換。洗脫反 應(yīng)則為交換反應(yīng)的逆過(guò)程。在陽(yáng)離子分離中，常用的應(yīng)則為交換反應(yīng)的逆過(guò)程。在陽(yáng)離子分離中，常用的 洗脫液是無(wú)機(jī)酸。洗脫液是無(wú)機(jī)酸。 2021-7-1Instrumental Analysis 化學(xué)化工學(xué)院 30 洗脫液進(jìn)入陽(yáng)離子交換柱洗脫分離陽(yáng)離子后，進(jìn)洗脫液進(jìn)入陽(yáng)離子交換柱洗脫分離陽(yáng)離子后，進(jìn) 入填充

22、有入填充有OH-型高容量陰離交換的抑制柱，將酸轉(zhuǎn)變型高容量陰離交換的抑制柱，將酸轉(zhuǎn)變 為水。為水。 R-OH- + H+Cl-R-Cl- + H2O R-OH- +M+Bl-R-Cl- + M+OH- 因此抑制反應(yīng)不僅降低了洗脫液的電導(dǎo)，而且由于因此抑制反應(yīng)不僅降低了洗脫液的電導(dǎo)，而且由于 OH-的離子淌度的離子淌度2.6倍于倍于Cl-,從而提高了檢測(cè)靈敏度。從而提高了檢測(cè)靈敏度。 2021-7-1Instrumental Analysis 化學(xué)化工學(xué)院 31 （2 2）離子色譜的優(yōu)點(diǎn)）離子色譜的優(yōu)點(diǎn) 1 1）分析速度快）分析速度快 可在數(shù)分鐘內(nèi)完成一個(gè)試樣 的分析； 2 2）分離能力高）分離

23、能力高 在適宜的條件下，可使 常見的各種陰離子混合物 分離；例：使用雙柱法， 在十幾分鐘內(nèi)，可使七種 陰離子完全分離。 2021-7-1Instrumental Analysis 化學(xué)化工學(xué)院 32 3 3）分離混合陰離子的最有效方法）分離混合陰離子的最有效方法 4 4）耐腐蝕，儀器流路采用全塑件，玻璃柱）耐腐蝕，儀器流路采用全塑件，玻璃柱 （2）離子色譜的類型離子色譜的類型 化學(xué)抑制型（雙柱型）化學(xué)抑制型（雙柱型） ： 分離柱中離子交換樹脂的交換容量通常在分離柱中離子交換樹脂的交換容量通常在0.01 0.05毫摩爾毫摩爾/克干樹脂?？烁蓸渲?。 非抑制型（單柱型）非抑制型（單柱型）: 當(dāng)進(jìn)一步

24、降低分離柱中樹當(dāng)進(jìn)一步降低分離柱中樹 脂的交換容量脂的交換容量(0.0070.07毫摩爾毫摩爾/克干樹脂克干樹脂),使用低使用低 濃度、低電離度的有機(jī)弱酸及弱酸鹽作淋洗液，如苯濃度、低電離度的有機(jī)弱酸及弱酸鹽作淋洗液，如苯 甲酸、苯甲酸鹽等。檢測(cè)器可直接與分離柱相連，不甲酸、苯甲酸鹽等。檢測(cè)器可直接與分離柱相連，不 需抑制柱。需抑制柱。 2021-7-1Instrumental Analysis 化學(xué)化工學(xué)院 33 6 6、空間、空間排阻色譜排阻色譜 size- exclusion chromatography 固定相固定相：凝膠凝膠(具有一定大小孔隙分布具有一定大小孔隙分布)； 原理：按分子

25、大小分離。小分子可以擴(kuò)散到凝原理：按分子大小分離。小分子可以擴(kuò)散到凝 膠空隙，由其中通過(guò)，出峰最慢；中等分子只能通膠空隙，由其中通過(guò)，出峰最慢；中等分子只能通 過(guò)部分凝膠空隙，中速通過(guò)；而大分子被排斥在外過(guò)部分凝膠空隙，中速通過(guò)；而大分子被排斥在外 ，出峰最快；溶劑分子小，故在最后出峰。，出峰最快；溶劑分子小，故在最后出峰。 2021-7-1Instrumental Analysis 化學(xué)化工學(xué)院 34 全部在死體積前出峰；全部在死體積前出峰； 可對(duì)相對(duì)分子質(zhì)量在可對(duì)相對(duì)分子質(zhì)量在 100-105范圍內(nèi)的化合物按范圍內(nèi)的化合物按 質(zhì)量分離質(zhì)量分離 2021-7-1Instrumental An

26、alysis 化學(xué)化工學(xué)院 35 3-4 液相色譜固定相液相色譜固定相 1. 1. 液液- -液色譜法、鍵合相色譜法及離子對(duì)分配法固液色譜法、鍵合相色譜法及離子對(duì)分配法固 定相定相 （1）全多孔型擔(dān)體）全多孔型擔(dān)體 由氧化硅、氧化鋁、硅藻土等制成的多孔球體；由氧化硅、氧化鋁、硅藻土等制成的多孔球體； 早期采用早期采用100m的大顆粒，表面涂漬固定液，由于填的大顆粒，表面涂漬固定液，由于填 料不規(guī)則引起色譜峰擴(kuò)展；另外，由于孔徑分布不一料不規(guī)則引起色譜峰擴(kuò)展；另外，由于孔徑分布不一 ，存在顆粒深孔中形成滯留液體，導(dǎo)致性能不佳，現(xiàn)，存在顆粒深孔中形成滯留液體，導(dǎo)致性能不佳，現(xiàn) 已不多見?，F(xiàn)采用已不

27、多見?，F(xiàn)采用10m以下的小顆粒，化學(xué)鍵合制以下的小顆粒，化學(xué)鍵合制 備柱填料。備柱填料。 2021-7-1Instrumental Analysis 化學(xué)化工學(xué)院 36 （2）表面多孔型擔(dān)體）表面多孔型擔(dān)體 （薄殼型微珠擔(dān)體）（薄殼型微珠擔(dān)體） 20世紀(jì)世紀(jì)70年代出現(xiàn)。年代出現(xiàn)。3040m的玻璃微球，表面的玻璃微球，表面 附著一層厚度為附著一層厚度為1 2m的多孔硅膠。表面積小，柱的多孔硅膠。表面積小，柱 容量底；傳質(zhì)快；裝柱容易；重現(xiàn)性好。容量底；傳質(zhì)快；裝柱容易；重現(xiàn)性好。 （3 3）化學(xué)鍵合固定相）化學(xué)鍵合固定相 化學(xué)鍵合固定相化學(xué)鍵合固定相: 目前應(yīng)用最廣、性能最佳的固目前應(yīng)用最廣、

28、性能最佳的固 定相。定相。 2021-7-1Instrumental Analysis 化學(xué)化工學(xué)院 37 a. 硅氧碳鍵型：硅氧碳鍵型： SiOC b. 硅氧硅碳鍵型：硅氧硅碳鍵型：SiOSi C 穩(wěn)定，耐水、耐光、耐有機(jī)溶劑，應(yīng)用最廣穩(wěn)定，耐水、耐光、耐有機(jī)溶劑，應(yīng)用最廣； c. 硅碳鍵型：硅碳鍵型： SiC d. 硅氮鍵型：硅氮鍵型： SiN 2021-7-1Instrumental Analysis 化學(xué)化工學(xué)院 38 化學(xué)鍵合固定相的特點(diǎn)化學(xué)鍵合固定相的特點(diǎn) （1）傳質(zhì)快傳質(zhì)快，表面無(wú)深凹陷，比一般液體固定相傳，表面無(wú)深凹陷，比一般液體固定相傳 質(zhì)快；質(zhì)快； （2）壽命長(zhǎng)壽命長(zhǎng)，化學(xué)

29、鍵合，無(wú)固定液流失，耐流動(dòng)相，化學(xué)鍵合，無(wú)固定液流失，耐流動(dòng)相 沖擊；耐水、耐光、耐有機(jī)溶劑，穩(wěn)定；沖擊；耐水、耐光、耐有機(jī)溶劑，穩(wěn)定； （3）選擇性好選擇性好，可鍵合不同官能團(tuán)，提高選擇性；，可鍵合不同官能團(tuán)，提高選擇性； （4）有利于梯度洗脫。有利于梯度洗脫。 2021-7-1Instrumental Analysis 化學(xué)化工學(xué)院 39 存在著存在著雙重分離機(jī)制雙重分離機(jī)制：(鍵合基團(tuán)的覆蓋率決定鍵合基團(tuán)的覆蓋率決定 分離機(jī)理分離機(jī)理)高覆蓋率：分配為主；低覆蓋率：吸附為高覆蓋率：分配為主；低覆蓋率：吸附為 主。主。 2021-7-1Instrumental Analysis 化學(xué)化工學(xué)

30、院 40 2. 2.液液- -固吸附分離固定相固吸附分離固定相 種類：硅膠、氧化鋁、分子篩、聚酰胺等；種類：硅膠、氧化鋁、分子篩、聚酰胺等； 結(jié)構(gòu)類型：全多孔型和薄殼型；結(jié)構(gòu)類型：全多孔型和薄殼型； 粒度：粒度：510 m（硅膠微粒）。（硅膠微粒）。 2021-7-1Instrumental Analysis 化學(xué)化工學(xué)院 41 3.3.離子交換色譜離子交換色譜分離固定相分離固定相 結(jié)構(gòu)類別：結(jié)構(gòu)類別： （1）薄殼型離子交換樹脂）薄殼型離子交換樹脂 薄殼玻璃珠為擔(dān)體，表 面涂約1%的離子交換樹脂； （2）離子交換鍵合固定相）離子交換鍵合固定相 薄殼鍵合型；微粒硅膠 鍵合型（鍵合離子交換基團(tuán)）

31、2021-7-1Instrumental Analysis 化學(xué)化工學(xué)院 42 樹脂類別：樹脂類別： （1） 陽(yáng)離子交換樹脂陽(yáng)離子交換樹脂 （強(qiáng)酸性、弱酸性）（強(qiáng)酸性、弱酸性） （2） 陰離子交換樹脂陰離子交換樹脂 （強(qiáng)堿性、弱堿性）（強(qiáng)堿性、弱堿性） 2021-7-1Instrumental Analysis 化學(xué)化工學(xué)院 43 4. 4. 空間排阻分離固定相空間排阻分離固定相 （1）軟質(zhì)凝膠）軟質(zhì)凝膠 葡聚糖凝膠、瓊脂凝膠等。多孔網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)；葡聚糖凝膠、瓊脂凝膠等。多孔網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)； 水為流動(dòng)相。適用于常壓排阻分離。水為流動(dòng)相。適用于常壓排阻分離。 （2）半硬質(zhì)凝膠）半硬質(zhì)凝膠 苯乙烯苯乙烯-二

32、乙烯基苯交聯(lián)共聚物，有機(jī)凝膠；二乙烯基苯交聯(lián)共聚物，有機(jī)凝膠； 非極性有機(jī)溶劑為流動(dòng)相，不能用丙酮、乙醇等非極性有機(jī)溶劑為流動(dòng)相，不能用丙酮、乙醇等 極性溶劑。極性溶劑。 2021-7-1Instrumental Analysis 化學(xué)化工學(xué)院 44 （3）硬質(zhì)凝膠）硬質(zhì)凝膠 多孔硅膠、多孔玻珠等；多孔硅膠、多孔玻珠等； 化學(xué)穩(wěn)定性、熱穩(wěn)定性好、機(jī)械強(qiáng)度大，流動(dòng)相化學(xué)穩(wěn)定性、熱穩(wěn)定性好、機(jī)械強(qiáng)度大，流動(dòng)相 性質(zhì)影響小，可在較高流速下使用。性質(zhì)影響小，可在較高流速下使用。 可控孔徑玻璃微球，具有恒定孔徑和窄粒度分可控孔徑玻璃微球，具有恒定孔徑和窄粒度分 布。布。 2021-7-1Instrume

33、ntal Analysis 化學(xué)化工學(xué)院 45 3-5 液相色譜的流動(dòng)相液相色譜的流動(dòng)相 mobile phases of LC 1. 1. 流動(dòng)相特性流動(dòng)相特性 （1）液相色譜的流動(dòng)相又稱為：）液相色譜的流動(dòng)相又稱為：淋洗液，洗脫劑淋洗液，洗脫劑 。流動(dòng)相組成改變，極性改變，可顯著改變組分分離。流動(dòng)相組成改變，極性改變，可顯著改變組分分離 狀況；狀況； （2）親水性固定液常采用疏水性流動(dòng)相，即流動(dòng)）親水性固定液常采用疏水性流動(dòng)相，即流動(dòng) 相的極性小于固定相的極性，稱為正相液液色譜法，相的極性小于固定相的極性，稱為正相液液色譜法， 極性柱也稱正相柱。極性柱也稱正相柱。 2021-7-1Inst

34、rumental Analysis 化學(xué)化工學(xué)院 46 （3）若流動(dòng)相的極性大于固定液的極性，則稱為反）若流動(dòng)相的極性大于固定液的極性，則稱為反 相液液色譜，非極性柱也稱為反相柱。組分在兩種類相液液色譜，非極性柱也稱為反相柱。組分在兩種類 型分離柱上的出峰順序相反。型分離柱上的出峰順序相反。 2.2.選擇流動(dòng)相時(shí)應(yīng)注意的幾個(gè)問(wèn)題選擇流動(dòng)相時(shí)應(yīng)注意的幾個(gè)問(wèn)題 （1）盡量使用高純度試劑作流動(dòng)相，防止微量雜）盡量使用高純度試劑作流動(dòng)相，防止微量雜 質(zhì)長(zhǎng)期累積損壞色譜柱和使檢測(cè)器噪聲增加。質(zhì)長(zhǎng)期累積損壞色譜柱和使檢測(cè)器噪聲增加。 2021-7-1Instrumental Analysis 化學(xué)化工學(xué)院

35、 47 （2）避免流動(dòng)相與固定相發(fā)生作用而使柱效下）避免流動(dòng)相與固定相發(fā)生作用而使柱效下 降或損壞柱子。如使固定液溶解流失；酸性溶劑降或損壞柱子。如使固定液溶解流失；酸性溶劑 破壞氧化鋁固定相等。破壞氧化鋁固定相等。 （3）試樣在流動(dòng)相中應(yīng)有適宜的溶解度，防）試樣在流動(dòng)相中應(yīng)有適宜的溶解度，防 止產(chǎn)生沉淀并在柱中沉積。止產(chǎn)生沉淀并在柱中沉積。 （4）溶劑的粘度小些為好。）溶劑的粘度小些為好。 （5）流動(dòng)相同時(shí)還應(yīng)滿足檢測(cè)器的要求。當(dāng)使）流動(dòng)相同時(shí)還應(yīng)滿足檢測(cè)器的要求。當(dāng)使 用紫外檢測(cè)器時(shí)，流動(dòng)相不應(yīng)有紫外吸收。用紫外檢測(cè)器時(shí)，流動(dòng)相不應(yīng)有紫外吸收。 2021-7-1Instrumental A

36、nalysis 化學(xué)化工學(xué)院 48 3. 3. 流動(dòng)相類別流動(dòng)相類別 按流動(dòng)相組成分：?jiǎn)谓M分和多組分；按流動(dòng)相組成分：?jiǎn)谓M分和多組分； 按極性分：極性、弱極性、非極性；按極性分：極性、弱極性、非極性； 按使用方式分：固定組成淋洗和梯度淋洗。按使用方式分：固定組成淋洗和梯度淋洗。 常用溶劑：常用溶劑： 己烷、四氯化碳、甲苯、乙酸乙己烷、四氯化碳、甲苯、乙酸乙 酯、乙醇、乙腈、水。酯、乙醇、乙腈、水。 采用二元或多元組合溶劑作為流動(dòng)相可以靈活采用二元或多元組合溶劑作為流動(dòng)相可以靈活 調(diào)節(jié)流動(dòng)相的極性或增加選擇性，以改進(jìn)分離或調(diào)調(diào)節(jié)流動(dòng)相的極性或增加選擇性，以改進(jìn)分離或調(diào) 整出峰時(shí)間。整出峰時(shí)間。

37、2021-7-1Instrumental Analysis 化學(xué)化工學(xué)院 49 4. 4. 流動(dòng)相選擇流動(dòng)相選擇 在選擇溶劑時(shí)，溶劑的極性是選擇的重要依據(jù)。在選擇溶劑時(shí)，溶劑的極性是選擇的重要依據(jù)。 采用正相液采用正相液-液分配分離時(shí)：首先選擇中等極性液分配分離時(shí)：首先選擇中等極性 溶劑，若組分的保留時(shí)間太短，降低溶劑極性，反溶劑，若組分的保留時(shí)間太短，降低溶劑極性，反 之增加。之增加。 也可在低極性溶劑中，逐漸增加其中的極性溶劑，也可在低極性溶劑中，逐漸增加其中的極性溶劑， 使保留時(shí)間縮短。使保留時(shí)間縮短。 2021-7-1Instrumental Analysis 化學(xué)化工學(xué)院 50 常用

38、溶劑的極性順序常用溶劑的極性順序： 水(最大) 甲酰胺 乙腈 甲醇 乙醇 丙醇 丙 酮 二氧六環(huán) 四氫呋喃 甲乙酮 正丁醇 乙酸乙 酯 乙醚 異丙醚 二氯甲烷氯仿溴乙烷苯四氯 化碳二硫化碳環(huán)己烷己烷煤油(最小) 2021-7-1Instrumental Analysis 化學(xué)化工學(xué)院 51 high performance liquid chromatograph 2021-7-1Instrumental Analysis 化學(xué)化工學(xué)院 52 2021-7-1Instrumental Analysis 化學(xué)化工學(xué)院 53 2021-7-1Instrumental Analysis 化學(xué)化工學(xué)院

39、 54 流程流程 2021-7-1Instrumental Analysis 化學(xué)化工學(xué)院 55 (1) 高壓輸液泵高壓輸液泵 主要部件之一，壓力：150 350105 Pa。 為了獲得高柱效而使用粒度 很小的固定相（ 電泳 電泳時(shí) 時(shí), ,陰陰 離子在負(fù)極最后流出離子在負(fù)極最后流出, ,在這種情況下在這種情況下, ,不但可以按類分離不但可以按類分離, ,除中除中 性粒子外性粒子外, ,同種類離子由于受到的電場(chǎng)力大小不一樣也同時(shí)被同種類離子由于受到的電場(chǎng)力大小不一樣也同時(shí)被 相互分離。相互分離。（動(dòng)畫）（動(dòng)畫） 2021-7-1Instrumental Analysis 化學(xué)化工學(xué)院 78 高

40、效毛細(xì)管電泳的特點(diǎn) 1.1.儀器簡(jiǎn)單、易自動(dòng)化儀器簡(jiǎn)單、易自動(dòng)化 電源、毛細(xì)管、檢測(cè)器、溶液瓶電源、毛細(xì)管、檢測(cè)器、溶液瓶 2.2.分析速度快、分離效率高分析速度快、分離效率高 在在3.1min3.1min內(nèi)分離內(nèi)分離3636種無(wú)機(jī)及有機(jī)陰離子，種無(wú)機(jī)及有機(jī)陰離子，4.1min4.1min 內(nèi)分離了內(nèi)分離了2424種陽(yáng)離子；分離柱效：種陽(yáng)離子；分離柱效：10105 510107 7/m/m理論塔理論塔 板數(shù)。板數(shù)。 2021-7-1Instrumental Analysis 化學(xué)化工學(xué)院 79 3.操作方便、消耗少操作方便、消耗少 進(jìn)樣量極少，水介質(zhì)中進(jìn)行；進(jìn)樣量極少，水介質(zhì)中進(jìn)行； 4.應(yīng)用

41、范圍極廣應(yīng)用范圍極廣 有機(jī)物、無(wú)機(jī)物、生物、中性分子；生物大分子等；有機(jī)物、無(wú)機(jī)物、生物、中性分子；生物大分子等； 分子生物學(xué)、醫(yī)學(xué)、藥學(xué)、化學(xué)、環(huán)境保護(hù)、材料分子生物學(xué)、醫(yī)學(xué)、藥學(xué)、化學(xué)、環(huán)境保護(hù)、材料 等；等； 2021-7-1Instrumental Analysis 化學(xué)化工學(xué)院 80 高效毛細(xì)管電泳儀高效毛細(xì)管電泳儀 high performance capillary electrophoresis apparatus 2021-7-1Instrumental Analysis 化學(xué)化工學(xué)院 81 儀器流程與主要部件儀器流程與主要部件 電壓：電壓：0 030kV30kV； 分離柱不

42、涂敷任何固定液；分離柱不涂敷任何固定液； 紫外或激光誘導(dǎo)熒光檢測(cè)器紫外或激光誘導(dǎo)熒光檢測(cè)器 ； （可檢測(cè)到：（可檢測(cè)到：1010-19 -19 1010-21 -21 mol/L mol/L ） 2021-7-1Instrumental Analysis 化學(xué)化工學(xué)院 82 1.高壓電源 （1 1）0 030 kV 30 kV 穩(wěn)定、連續(xù)可調(diào)的直流電源；穩(wěn)定、連續(xù)可調(diào)的直流電源； （2 2）具有恒壓、恒流、恒功率輸出；）具有恒壓、恒流、恒功率輸出； （3 3）電場(chǎng)強(qiáng)度程序控制系統(tǒng)；）電場(chǎng)強(qiáng)度程序控制系統(tǒng)； （4 4）電壓穩(wěn)定性：）電壓穩(wěn)定性：0.1%0.1%； （5 5）電源極性易轉(zhuǎn)換；）電源

43、極性易轉(zhuǎn)換； 2. 2. 毛細(xì)管柱毛細(xì)管柱 （1 1）材料：石英：各項(xiàng)性能好；玻璃：光學(xué)、機(jī)械性能差；）材料：石英：各項(xiàng)性能好；玻璃：光學(xué)、機(jī)械性能差； （2 2）規(guī)格：內(nèi)徑）規(guī)格：內(nèi)徑202075m75m，外徑，外徑350350400m400m；長(zhǎng)度；長(zhǎng)度=1m電泳 電泳時(shí) 時(shí), ,陰離子在負(fù)極最后流出陰離子在負(fù)極最后流出, ,在這種情況下在這種情況下, , 不但可以按類分離不但可以按類分離, ,同種類離子由于同種類離子由于差速遷移差速遷移被相被相 互分離。互分離。 最基本、應(yīng)用廣的分離模式；最基本、應(yīng)用廣的分離模式； 2021-7-1Instrumental Analysis 化學(xué)化工學(xué)院

44、 87 2.2.毛細(xì)管凝膠電泳毛細(xì)管凝膠電泳 capillary gel electrophoresis ，CGE 將聚丙烯酰胺等在毛細(xì)管柱內(nèi)交聯(lián)生成凝膠。將聚丙烯酰胺等在毛細(xì)管柱內(nèi)交聯(lián)生成凝膠。 其具有多孔性，類似分子篩的作用，試樣分子其具有多孔性，類似分子篩的作用，試樣分子 按大小分離。能夠有效減小組分?jǐn)U散，所得峰型尖按大小分離。能夠有效減小組分?jǐn)U散，所得峰型尖 銳，分離效率高。銳，分離效率高。 蛋白質(zhì)、蛋白質(zhì)、DNADNA等的電荷等的電荷/ /質(zhì)量比與分子大小無(wú)關(guān)，質(zhì)量比與分子大小無(wú)關(guān)， CZECZE模式很難分離，采用模式很難分離，采用CGECGE能獲得良好分離，能獲得良好分離，DAND

45、AN 排序的重要手段。排序的重要手段。 2021-7-1Instrumental Analysis 化學(xué)化工學(xué)院 88 特點(diǎn)特點(diǎn)：抗對(duì)流性好，散熱性好，分離度極高。：抗對(duì)流性好，散熱性好，分離度極高。 無(wú)膠篩分技術(shù)無(wú)膠篩分技術(shù)：采用低粘度的線性聚合物溶液代替：采用低粘度的線性聚合物溶液代替 高粘度交聯(lián)聚丙烯酰胺。柱便宜、易制備。高粘度交聯(lián)聚丙烯酰胺。柱便宜、易制備。 3. 3. 膠束電動(dòng)毛細(xì)管色譜膠束電動(dòng)毛細(xì)管色譜（MECC ，MEKC） micellar electrokinetic capillary chromatography，MEKC 2021-7-1Instrumental Ana

46、lysis 化學(xué)化工學(xué)院 89 1 1）緩沖溶液中加入離子型表面活性劑，其濃度）緩沖溶液中加入離子型表面活性劑，其濃度 達(dá)到臨界濃度，形成一疏水內(nèi)核、外部帶負(fù)電的膠達(dá)到臨界濃度，形成一疏水內(nèi)核、外部帶負(fù)電的膠 束。束。 在電場(chǎng)力的在電場(chǎng)力的 作用下，膠束在作用下，膠束在 柱中移動(dòng)。柱中移動(dòng)。 2021-7-1Instrumental Analysis 化學(xué)化工學(xué)院 90 2 2） 電泳流和電滲流的方向相反，且電泳流和電滲流的方向相反，且電滲流 電滲流 電泳 電泳 ，負(fù)電膠束以較慢的速度向負(fù)極移動(dòng)； ，負(fù)電膠束以較慢的速度向負(fù)極移動(dòng)； 5 5）色譜與電泳分離模式的結(jié)合。）色譜與電泳分離模式的結(jié)合

47、。 3 3）中性分子在膠束相和溶液（水相）間分配，）中性分子在膠束相和溶液（水相）間分配， 疏水性強(qiáng)的組分與膠束結(jié)合的較牢，流出時(shí)間長(zhǎng)；疏水性強(qiáng)的組分與膠束結(jié)合的較牢，流出時(shí)間長(zhǎng)； 4 4）可用來(lái)分離中性物質(zhì)，擴(kuò)展了高效毛細(xì)管）可用來(lái)分離中性物質(zhì)，擴(kuò)展了高效毛細(xì)管 電泳的應(yīng)用范圍；電泳的應(yīng)用范圍； 2021-7-1Instrumental Analysis 化學(xué)化工學(xué)院 91 1) 1) 根據(jù)等電點(diǎn)差別分離生物大分子的高分辨率電根據(jù)等電點(diǎn)差別分離生物大分子的高分辨率電 泳技術(shù)；泳技術(shù)； 2) 2) 毛細(xì)管內(nèi)充有兩性電解質(zhì)（合成的具有不同等毛細(xì)管內(nèi)充有兩性電解質(zhì)（合成的具有不同等 電點(diǎn)范圍的脂肪族多胺基多羧酸混合物），當(dāng)施加直電點(diǎn)范圍的脂肪族多