CTGF對腹膜間皮細胞上皮間質表型轉化的調控及對胃癌腹膜轉移影響

1、中國醫(yī)科大學研究生學位論文獨創(chuàng)性聲明 本人申明所呈交的學位論文是我本人在導師指導下進行的研究工作及取得的研究成果。據(jù)我所知，除了文中特別加以標注和致謝的地方外，論文中不包含其他人已經發(fā)表或撰寫過的研究成果，也不包含為獲得我?；蚱渌逃龣C構的學位或證書而使用過的材料，與我一同工作的同志對本研究所做的任何貢獻均已在論文中作了明確的說明并表示謝意。 申請學位論文與資料若有不實之處，本人承擔一切相關責任。 論文作者簽名：圭基盔因 日期： 中國醫(yī)科大學研究生學位論文版權使用授權書 本人完全了解中國醫(yī)科大學有關保護知識產權的規(guī)定，即：研究生在攻讀學位期間論文工作的知識產權單位屬中國醫(yī)科大學。本人保證畢業(yè)離

2、校后，發(fā)表論文或使用論文工作成果時署名單位為中國醫(yī)科大學，且導師為通訊作者，通訊作者單位亦署名為中國醫(yī)科大學。學校有權保留并向國家有關部門或機構送交論文的復印件和磁盤，允許論文被查閱和借閱。學?？梢怨紝W位論文的全部或部分內容（保密內容除外），以采用影印、縮印或其他手段保存論文。 論文作者簽名： 指導教師簽名： 日 期： 目 錄一、摘要 中文論著摘要 英文論著摘要二、英文縮略語 三、論文論文一 前言 剛吾“ 材料與方法 實驗結果 討論” 結論“論文二 前言 日舀” 材料與方法 實驗結果 討論 結論一論文三 前。言“ 剛舌“ 材料與方法 實驗結果 討論 結論四、本研究創(chuàng)新性的自我評價五、參考文獻

3、六、附錄 一 一 期 問 秉 硼 成 績 一 一 綜在致個 述學謝人 簡 介 一 疆誓曩辱 中文論著摘要對腹膜間皮細胞上皮間質表型轉化的調控及對 胃癌腹膜轉移影響的研究 刖 罱 胃癌是消化道系統(tǒng)最常見的惡性腫痛。雖然近年來在其診治方面取得了一些成績，但預后仍不理想，我國胃癌的死亡率仍居惡性腫瘤前列。腹膜轉移是進展期胃癌根治術后最常見的復發(fā)形式，也是胃癌患者最主要的死亡原因。目前，國內外許多學者認為腹膜轉移是特殊的腫瘤細胞與腹膜適宜的環(huán)境相互作用的結果，涉及粘附、降解、移動、血管生成、免疫逃避等諸多方面。 正常腹膜為三層結構：表面為單層間皮細胞層；其下為一薄的連續(xù)的膠原纖維層，內含少量基質細胞，

4、最下一層為脂肪組織層。扁平狀的間皮細胞呈連續(xù)排列，覆蓋于盆腹腔各壁的內面及腔內各器官的表面，呈半透明狀，薄而光滑，能分泌、表達多種細胞因子、粘附分子及基質成分，是一道天然的機械防御屏障，避免問皮下組織的暴露以及微生物的侵襲。進展期胃癌常發(fā)生腹膜轉移，而腹膜轉移是一個多階段的過程，在這個過程中，覆蓋在腹膜表面的間皮細胞無疑發(fā)揮著重要的作用。 結締組織生長因子（ ）于上世紀年代初在血小板衍化生長因子（ ，）的誘導下從人臍周靜脈內皮細胞文庫中首次發(fā)現(xiàn)。編碼人類的基因定位于染色體，包含個外顯子，個內含子，含個氨基酸。近年來研究發(fā)現(xiàn)，與細胞外基質相互作用，調節(jié)多種組織惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展、血管生成及浸潤轉

5、移。 上皮問質轉化（ ，）是指完全分化的上皮細胞表型改變以后轉變成完全分化的問質細胞，通常轉變?yōu)槌衫w維細胞或肌成纖維細胞的過程。在正常胍胎發(fā)育及組織創(chuàng)傷修復中發(fā)揮重要作用，病理狀態(tài)下主要參與器官纖維化與腫瘤浸潤轉移。受多種細胞因子調節(jié)，其中被認為是導致的主要分子。是的下游效應分子，介導了的效應。有研究發(fā)現(xiàn)能直接誘導體外培養(yǎng)的腎小管上皮細胞發(fā)生。本研究擬研究在腹膜問皮細胞過程中的作用，并探討其對胃癌腹膜轉移影響。 材料與方法一、 細胞培養(yǎng)和處理 間皮細胞系在”、濕度溫箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)液為力 體積分數(shù)的胎牛血清，含青霉素和，貼壁生長，天以：傳代，通過胰蛋白酶消化后收集。不同時間用不同濃度重組人（）及

6、腫瘤細胞上清處理問皮細胞，光鏡下觀察、日皮細胞處理后形態(tài)變化。二、 激光共聚焦顯微鏡 無菌蓋玻片經多聚賴氨酸包被后，置于六孔培養(yǎng)板。細胞均勻接種于六孔培養(yǎng)板內（ ），生長融合至時，按實驗需要分組，并加入處理因素處理，每組設個復孔，取蓋玻片行免疫熒光染色方法測定細胞鈣粘蛋白（），波形蛋白（）及僅平滑肌肌動蛋白（【）的表達情況。三、 蛋白印記法 每組收集細胞，加入細胞裂解液，”超聲波粉碎，過夜后吸出上清液，” ，離一。調整各標本蛋白濃度一致。每孔加樣，聚丙烯酰胺凝膠電泳，分離膠電壓，濃縮膠電壓。在水浴式轉印槽中轉膜，將膜封閉，加入一抗，”孵育過夜。然后將膜置于辣根過氧化物酶標記的二抗中，室溫孵育，

7、洗膜 次，發(fā)光法檢測。四、 實時定量逆轉錄聚合酶鏈反應（ ， ） 用試劑提取細胞，總，測定濃度、純度，根據(jù)試劑盒步驟進行 。采用法比較值（ ），以為內參，相對定量樣本靶基因表達水平。每一試驗至少重復三次。五、 細胞粘附實驗 將問皮細胞以每孔個細胞鋪于孑，板中，不同時間用不同濃度重組人（）及腫瘤細胞上清處理間皮細胞。再加入標記的細胞，溫箱中培養(yǎng)。 培養(yǎng)結束后，吸出培養(yǎng)液，緩慢沖洗三次，在熒光酶標讀數(shù)儀進行熒光值的測定。細胞粘附率粘附細胞熒光強度空白組熒光強度細胞總數(shù)熒光強度空白組熒光強度。并在熒光顯微鏡下觀察粘附情況。六、 裸鼠體內成瘤實驗 取雌性裸鼠只，分為三組，每組只。其中一組腹腔注入無血清

8、，另外一組腹腔注）濃度的，兩周后，取處于對數(shù)生長期的胃癌細胞株消化、重懸，調整細胞濃度為 ，每只裸鼠腹腔內注射胃癌細胞。以上裸鼠周后拉頸處死，觀察腹腔內成瘤及腹水情況。 結 拿口卜 果 體外實驗顯示不同濃度可使腹膜間皮細胞發(fā)生形態(tài)改變，由原來的橢圓形鋪路石樣變?yōu)殚L梭形，且排列極性消失。 結果顯示處理過的腹膜間皮細胞 表達下降，肌纖維細胞標志物【、 表達上升。及免疫熒光法測定的蛋白表達下降，伐、蛋白表達上升。以上情況表明可誘導腹膜間皮細胞發(fā)生。我們又檢測了種胃癌高轉移細胞系，及間皮細胞上清中的含量，發(fā)現(xiàn)種高轉移細胞系的濃度較高，而間皮細胞上清中的含量很低。我們用上清液與問皮細胞共培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn) 及蛋

9、白表達同樣下降；【、 及蛋白表達同樣上升；而且間皮細胞形態(tài)也變?yōu)殚L梭形。這說明含有較高濃度的胃癌細胞系上清液也可使腹膜間皮細胞發(fā)生。我們應用轉染 胃癌細胞，瞬時轉染后收集上清培養(yǎng)問皮細胞，其程度明顯降低。同時在上清中加入中和抗體，其現(xiàn)象被部分逆轉。通過體外粘附實驗，我們發(fā)現(xiàn)經過及胃癌細胞上清處理的腹膜間皮細胞與胃癌細胞的粘附率明顯高于正常間皮細胞。裸鼠體內實驗我們發(fā)現(xiàn)，腹腔注射重組段時間的裸鼠較注射及未注射組的裸鼠體內瘤節(jié)結生長及腹水生成明顯增多。這說明可以誘導腹膜間皮細胞發(fā)生，而且對胃癌細胞的腹膜轉移有促進作用。 結 論 體外可以誘導腹膜問皮細胞系發(fā)生，而且的程度與 的濃度及作用時間有關。

10、含有較高濃度的胃癌細胞系上清液也可使腹膜間皮細胞發(fā)生，應 用中和抗體可部分逆轉現(xiàn)象。 經過及胃癌細胞上清處理的發(fā)生的腹膜問皮細胞與胃癌細胞的粘 附率明顯高于正常間皮細胞。 腹腔注射一段時間的裸鼠較注射及未注射組的裸鼠體內瘤節(jié)結 生長及腹水生成明顯增多。 關鍵詞胃癌；腹膜問皮細胞；腹腔微環(huán)境 英文論著摘要 歟椋幔? ， ， ， ， ， ， ， （）， （） （） ： ， ， ， ， （ ） （ ） ， （ ） ， ， ， （）， ， ” ，【一、 ； ， ， ， ， ， ， ， ， （ ） ， （）， ”， 一 ， ； （ ，） ： ， ， ， 、 ， 【、 ， 簦瑁幔? ， ； 伐一、 ， ，

11、 ， ， ， ， ， ； ； 英文縮略語 論文一 在腹膜間皮細胞上皮間質表型轉化中 作用的研究 刖 吾 胃癌是消化道系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤。雖然近年來在其診治方面取得了一些成績，但預后仍不理想，我國胃痛的死亡率仍居惡性腫瘤前列。腹膜轉移是進行期胃癌根治術后最常見的復發(fā)形式，也是胃癌患者最主要的死亡原因【】。目前，國內外許多學者認為腹膜轉移是特殊的腫瘤細胞與腹膜適宜的環(huán)境相互作用的結果，涉及粘附、降解、移動、血管生成、免疫逃避等諸多方面。 正常腹膜為三層結構：表面為單層間皮細胞層；其下為一薄的連續(xù)的膠原纖維層，內含少量基質細胞，最下一層為脂肪組織層。扁平狀的間皮細胞呈連續(xù)排列，覆蓋于盆腹腔各壁的內

12、面及腔內各器官的表面，呈半透明狀，薄而光滑，能分泌、表達多種細胞因子、粘附分子及基質成分，是一道天然的機械防御屏障。避免間皮下組織的暴露以及微生物的侵襲。進展期胃癌常發(fā)生腹膜轉移，而腹膜轉移是一個多階段的過程，在這個過程中，覆蓋在腹膜表面的間皮細胞無疑發(fā)揮著重要的作用。 結締組織生長因子（ ，）于上世紀年代初在血小板源性生長因子（ ，）的誘導下從人臍周靜脈內皮細胞文庫中首次發(fā)現(xiàn)【】。的結構包含個外顯子，個內含子，起始位點是，其端包括個位點。第一個外顯子編碼信號肽，另外四個分別編碼個不同的功能結構域，：（）胰島素生長因子（ ，）結合蛋白區(qū)，包括個半胱氨酸殘基，與類胰島素生長因子結合蛋白（）有相一

13、致的序列（），是一個公認的胰島素結合模式；（）因子型重復（分子），這個區(qū)域與單聚作用和蛋白復合物的形成有關，包括個半胱氨酸殘基；（）血小板反應蛋白型重復（，），包括了個半胱氨酸硫酸化糖蛋白；（）生長因子半胱氨酸群，包括了剩余的個半胱氨酸。 上皮問質轉化（ ，）是指完全分化的上皮細胞表型改變以后轉變成完全分化的間質細胞，通常轉變?yōu)槌衫w維細胞或肌成纖維細胞的過程【。在正常胚胎發(fā)育及組織創(chuàng)傷修復中發(fā)揮重要作用，病理狀態(tài)下主要參與器官纖維化與腫瘤浸潤轉移。受多種細胞因子調節(jié)，其被認為是導致的主要分子（司。是的下游效應分子，介導勺效應【。有研究發(fā)現(xiàn)能直接誘導體外培養(yǎng)的腎小管上皮細胞發(fā)生，應用抗體或反義寡

14、核苷酸能阻斷這一過程。本研究主要探討在腹膜間皮細胞過程中的作用，以期為研究在胃癌腹膜轉移腹腔微環(huán)境變化過程中的作用打下基礎。 實驗材料一、材料 （一）、細胞系 人胃癌細胞株、及人腹膜間皮細胞系由中國醫(yī)科大學細胞生物教研室提供。 （）、主要儀器、超凈工作臺（北京）、培養(yǎng)箱（ 公司，日本）、倒置顯微鏡（公司， 日本）、光學顯微鏡（公司，日本）、熒光顯微鏡（公司，日本）、 低溫超速離心機（型，美國和，日本）、超低溫冰箱”（公司，同本）、制冰機（公司，美國）、 儀（ ，美國） 、電泳儀（型，北京）、 電泳槽：型（北京）、水浴式轉印槽（北京）、垂直電泳槽：（ ，美國）、紫外分光度計（，英國）、自動電泳凝膠成像分析系統(tǒng)（ ， ，）、 自動酶