焦磷酸測序技術(shù)檢測豬甲型流感病毒方法PPT學(xué)習(xí)教案

1、會計(jì)學(xué)1焦磷酸測序技術(shù)檢測豬甲型流感病毒方焦磷酸測序技術(shù)檢測豬甲型流感病毒方法法第1頁/共24頁第2頁/共24頁從2009年3月開始，陸續(xù)在墨西哥和美國發(fā)現(xiàn)人感染豬甲型H1N1流感后改為A（H1N1）疫情，目前已很多國家發(fā)現(xiàn)疑似病例 ，我國也確診了兩例第3頁/共24頁第4頁/共24頁第5頁/共24頁第6頁/共24頁焦磷酸測序技術(shù)分子診斷的黃金標(biāo)準(zhǔn)特異性、靈敏性遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于病毒分離鑒定方法，可能存在假陽性反應(yīng)。實(shí)時(shí)熒光實(shí)時(shí)熒光RT-PCRRTPCR測序確證遭遇瓶頸第7頁/共24頁P(yáng)yro + Sequencing = Pyrosequencing 焦磷酸技術(shù) 測序技術(shù) 焦磷酸測序Pyrosequen

2、cing是將焦磷酸技術(shù)應(yīng)用于DNA序列分析的新一代技術(shù)分子水平上的研究最佳選擇獲得分子診斷的黃金標(biāo)準(zhǔn)基因序列測序焦磷酸測序用于豬流感檢測的意義第8頁/共24頁P(yáng)PiATPAPSLuciferin硫酸化酶硫酸化酶雙磷酸酶雙磷酸酶熒光素酶熒光素酶lighttimePyrosequencing原理原理DNADNA聚合酶聚合酶第9頁/共24頁l 實(shí)時(shí)和定量序列分析結(jié)果Sample sequence ：AGGCAGTTCGAC12345678910110-1 A GG C A GA GG C A G特點(diǎn)特點(diǎn)第10頁/共24頁l 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)靈活I(lǐng)nterest regionRPKHDFPBSeq Forwa

3、rd sequencing Reverse sequencing Multiplesequencing primersInterest regionSeqRPBNNt gRcFP第11頁/共24頁中心理念中心理念代表各亞型代表各亞型目標(biāo)序列的目標(biāo)序列的比對尋找比對尋找血凝素基因血凝素基因神經(jīng)氨酸酶基因神經(jīng)氨酸酶基因鑒于最新爆發(fā)鑒于最新爆發(fā)H1N1甲型甲型流感病毒變異點(diǎn)較多，流感病毒變異點(diǎn)較多，特選取該株獨(dú)有且變異點(diǎn)較為特選取該株獨(dú)有且變異點(diǎn)較為集中的區(qū)域作為目標(biāo)序列集中的區(qū)域作為目標(biāo)序列 第12頁/共24頁P(yáng)CR檢測雙酶切檢測目的基因目的基因陽性菌測序獲得陽性克隆菌BioFlux回收試劑盒回收

4、 連接與轉(zhuǎn)化 RT-PCR引物設(shè)計(jì)引物設(shè)計(jì)提取模提取模板板滅活病原滅活病原 提取質(zhì)粒M基因及亞型基因的質(zhì)粒構(gòu)基因及亞型基因的質(zhì)粒構(gòu)建建第13頁/共24頁第14頁/共24頁第15頁/共24頁第16頁/共24頁P(yáng)CR試樣預(yù)處理Pyrosequencing反應(yīng)第17頁/共24頁開機(jī)，并拿出試劑，在使用前，保證所有試劑都達(dá)到室溫混勻 磁珠，在Mixer上常溫混勻10分鐘，每樣約3L加入結(jié)合緩沖液到50uL將50 L標(biāo)記有生物素的PCR產(chǎn)物與50 L鏈霉親和素包被的磁珠混合，在室溫25 下振蕩孵育20 min。用真空吸附器將與磁珠結(jié)合后的PCR產(chǎn)物吸起，然后在純水中清洗 30 s； 在70%乙醇中清洗5 s；變性緩沖液洗5 s；最后移到洗滌緩沖液中清洗10 s?？瘴狡鞣湃牒袦y序引物的板中，搖動，釋放磁珠。將樣品放入80 烘箱2 min，再冷卻到室溫。第18頁/共24頁Reagent cartridge96 well plateCCD cameraX-Y driveInk jet deliveryMixer and thermostatDetectionPositioni