沉淀反應與凝集反應yhl

1、第十章第十章 沉淀反應與凝集反應沉淀反應與凝集反應 第一部分第一部分 凝集反應凝集反應第一節(jié)第一節(jié) 凝集反應的特點凝集反應的特點第二節(jié)第二節(jié) 直接凝集反應直接凝集反應第三節(jié)第三節(jié) 間接凝集反應間接凝集反應第四節(jié)第四節(jié) 自身紅細胞凝集試驗自身紅細胞凝集試驗第五節(jié)第五節(jié) 抗球蛋白試驗抗球蛋白試驗一、凝集反應定義一、凝集反應定義 細菌、螺旋體、紅細胞或細胞性抗原等細菌、螺旋體、紅細胞或細胞性抗原等顆粒性抗顆粒性抗原原，或，或可溶性抗原（或抗體）與載體顆粒結合可溶性抗原（或抗體）與載體顆粒結合成致成致敏顆粒后，它們與相應抗體（或抗原）發(fā)生特異性敏顆粒后，它們與相應抗體（或抗原）發(fā)生特異性反應，在反應，

2、在適當電解質(zhì)存在適當電解質(zhì)存在下，形成肉眼可見的凝集下，形成肉眼可見的凝集現(xiàn)象。參與凝集反應的抗體有現(xiàn)象。參與凝集反應的抗體有igmigm和和igg,igg,igmigm的凝集的凝集作用比作用比iggigg大數(shù)百倍。大數(shù)百倍。第一節(jié)第一節(jié) 凝集反應的特點凝集反應的特點二、反應階段二、反應階段抗原抗體的特異性結合抗原抗體的特異性結合出現(xiàn)肉眼可見的凝集現(xiàn)象出現(xiàn)肉眼可見的凝集現(xiàn)象三、特點三、特點 該方法簡便、敏感度高，應用廣泛。該方法簡便、敏感度高，應用廣泛。四、類型四、類型 按按抗原的性質(zhì)抗原的性質(zhì)和和反應方式反應方式的不同分為：的不同分為： 直接凝集和間接凝集直接凝集和間接凝集直接凝集反應直接凝

3、集反應(direct agglutination)： 顆粒性抗原直接與抗體結合，在電解質(zhì)的顆粒性抗原直接與抗體結合，在電解質(zhì)的作用下，出現(xiàn)肉眼可見的凝集現(xiàn)象。作用下，出現(xiàn)肉眼可見的凝集現(xiàn)象。第二節(jié)第二節(jié) 直接凝集反應直接凝集反應（一）（一） 玻片凝集試驗玻片凝集試驗（二）（二） 試管凝集試驗試管凝集試驗+ +（一）玻片凝集試驗（一）玻片凝集試驗方法評價方法評價: : 定性試驗定性試驗，簡便和快速；敏感度低。，簡便和快速；敏感度低。臨床應用臨床應用: : 菌種鑒定；血清學分型；血型鑒定。菌種鑒定；血清學分型；血型鑒定。 在試管內(nèi)顆粒性抗原直接與抗體結合，在電解質(zhì)在試管內(nèi)顆粒性抗原直接與抗體結合，

4、在電解質(zhì)的作用下，的作用下，出現(xiàn)肉眼可見出現(xiàn)肉眼可見的凝集現(xiàn)象。的凝集現(xiàn)象。（二）試管凝集試驗（二）試管凝集試驗方法評價：方法評價： 半定量試驗；簡便、快速；敏感度低；可有假陽性。半定量試驗；簡便、快速；敏感度低；可有假陽性。應用：應用：測定相應抗體的效價；可作臨床診斷或流行病學調(diào)查。測定相應抗體的效價；可作臨床診斷或流行病學調(diào)查。試管凝集試驗試管凝集試驗 根據(jù)凝集程度記錄為：（根據(jù)凝集程度記錄為：（100100凝集）、凝集）、（7575凝集）、（凝集）、（5050凝集）、（凝集）、（2525凝集）。以凝集）。以出現(xiàn)出現(xiàn)5050凝集以上凝集以上的的血清最大稀釋度血清最大稀釋度為該血清的凝集效價

5、。為該血清的凝集效價。間接凝集反應間接凝集反應( (indirect agglutinationindirect agglutination) ): : 將將可溶性抗原或抗體可溶性抗原或抗體吸附于顆粒性吸附于顆粒性載體載體表面，表面，然后與相應的抗體或抗原反應，在電解質(zhì)的作用然后與相應的抗體或抗原反應，在電解質(zhì)的作用下，出現(xiàn)肉眼可見的凝集現(xiàn)象。下，出現(xiàn)肉眼可見的凝集現(xiàn)象。第三節(jié)第三節(jié) 間接凝集反應間接凝集反應1.1.正向間接凝集試驗正向間接凝集試驗2.2.反向間接凝集試驗反向間接凝集試驗3.3.間接凝集抑制試驗間接凝集抑制試驗4.4.協(xié)同凝集試驗協(xié)同凝集試驗一、間接凝集反應的類型一、間接凝集反

6、應的類型用抗原致敏載體用抗原致敏載體- -檢測抗體檢測抗體 1.1.正向間接凝集試驗正向間接凝集試驗2.2.反向間接凝集試驗反向間接凝集試驗用抗體致敏載體用抗體致敏載體-檢測抗原檢測抗原3.3.間接凝集抑制試驗間接凝集抑制試驗用抗原致敏載體用抗原致敏載體- -檢測抗原檢測抗原4.4.協(xié)同凝集試驗協(xié)同凝集試驗二、間接血凝試驗二、間接血凝試驗1/21/21/41/41/81/81/161/161/321/321/641/641/1281/1281/2561/2561/5121/5121/10241/1024pos.pos.neg.neg.titertiter64648 85125122232321

7、2812832324 4patientpatient1 12 23 34 45 56 67 78 8反向間接血凝試驗反向間接血凝試驗血凝試驗強度血凝試驗強度三、膠乳凝集試驗三、膠乳凝集試驗 孕婦尿中，絨毛膜促性腺激素（孕婦尿中，絨毛膜促性腺激素（hcghcg）含量明顯增高。）含量明顯增高。 反之，非孕婦尿中反之，非孕婦尿中hcghcg含量甚微，不能消耗掉抗含量甚微，不能消耗掉抗hcghcg抗體?？贵w。 將待檢血清或抗原和致敏乳膠各滴一滴在玻片上，陽將待檢血清或抗原和致敏乳膠各滴一滴在玻片上，陽性者性者5 510min10min即出現(xiàn)凝集。如妊娠免疫診：即出現(xiàn)凝集。如妊娠免疫診：四、明膠凝集試驗

8、四、明膠凝集試驗 將病毒抗原或重組抗原將病毒抗原或重組抗原吸附于粉紅色吸附于粉紅色明膠顆粒明膠顆粒上，當致敏顆粒與樣品血清作用上，當致敏顆粒與樣品血清作用時，若血清含有抗病毒抗體則可時，若血清含有抗病毒抗體則可形成肉眼形成肉眼可見的粉紅色凝集可見的粉紅色凝集。五、間接凝集反應的應用五、間接凝集反應的應用一）抗原的檢測一）抗原的檢測 反向間接凝集試驗可用于檢測病原體的可溶性抗反向間接凝集試驗可用于檢測病原體的可溶性抗原，也可用于檢測各種蛋白質(zhì)成分。原，也可用于檢測各種蛋白質(zhì)成分。二）抗體的檢測二）抗體的檢測檢測細菌、病毒、寄生蟲等感染后產(chǎn)生的抗體。檢測細菌、病毒、寄生蟲等感染后產(chǎn)生的抗體。 未經(jīng)

9、致敏的受檢者新鮮紅細胞未經(jīng)致敏的受檢者新鮮紅細胞試劑：試劑：抗人抗人o o型紅細胞的單克隆抗體型紅細胞的單克隆抗體臨床應用臨床應用：hivhiv檢測、檢測、hbvhbv檢測檢測第四節(jié)第四節(jié) 自身紅細胞凝集試驗自身紅細胞凝集試驗自身紅細胞凝集試驗自身紅細胞凝集試驗抗球蛋白試驗抗球蛋白試驗又稱又稱coombs試驗試驗第五節(jié)第五節(jié) 抗球蛋白試驗抗球蛋白試驗（一）直接（一）直接coombscoombs試驗試驗檢測紅細胞上抗體或不完全抗體檢測紅細胞上抗體或不完全抗體 單價抗體只能與一方抗原的抗原決定簇結合，不產(chǎn)生凝單價抗體只能與一方抗原的抗原決定簇結合，不產(chǎn)生凝集反應，當加入抗球蛋白抗體后，可以將兩個各

10、連接一方抗集反應，當加入抗球蛋白抗體后，可以將兩個各連接一方抗原決定簇的單價抗體連接起來，出現(xiàn)凝集現(xiàn)象。原決定簇的單價抗體連接起來，出現(xiàn)凝集現(xiàn)象。（二）（二）間接間接coombscoombs試驗試驗檢測血清中的抗紅細胞抗體檢測血清中的抗紅細胞抗體臨床應用：臨床應用：在輸血上的應用；在輸血上的應用；血型抗原抗體的檢查；血型抗原抗體的檢查；對新生兒溶血性貧血性疾病的診斷；對新生兒溶血性貧血性疾病的診斷；對溶血性貧血的研究；對溶血性貧血的研究；對細菌或立克次體的不完全抗體檢查。對細菌或立克次體的不完全抗體檢查。第一節(jié)第一節(jié) 沉淀反應的特點沉淀反應的特點第二節(jié)液體內(nèi)沉淀試驗第二節(jié)液體內(nèi)沉淀試驗第三節(jié)凝

11、膠內(nèi)沉淀試驗第三節(jié)凝膠內(nèi)沉淀試驗第四節(jié)第四節(jié) 免疫電泳技術免疫電泳技術第二部分第二部分 沉沉 淀淀 反反 應應1.1.沉淀反應（沉淀反應（precipitationprecipitation）: : 是指是指可溶性抗原可溶性抗原與相應抗體在適當條件下發(fā)與相應抗體在適當條件下發(fā)生特異性結合而出現(xiàn)的沉淀現(xiàn)象生特異性結合而出現(xiàn)的沉淀現(xiàn)象, ,其特性與經(jīng)典的其特性與經(jīng)典的抗原抗體反應相同。抗原抗體反應相同。第一節(jié)第一節(jié) 沉淀反應原理及特點沉淀反應原理及特點2.2.沉淀反應分兩個階段沉淀反應分兩個階段第一階段：第一階段： 抗原抗體特異性結合，快速但不可見?？乖贵w特異性結合，快速但不可見。第二階段：第二

12、階段： 形成肉眼可見的大的免疫復合物。形成肉眼可見的大的免疫復合物。免疫免疫濁度測濁度測定定絮狀絮狀沉淀試沉淀試驗驗單向單向擴散試擴散試驗驗雙向雙向擴散試擴散試驗驗對流免疫電泳對流免疫電泳火箭免疫電泳火箭免疫電泳免疫電泳免疫電泳免疫固定電泳免疫固定電泳液體內(nèi)沉液體內(nèi)沉淀試驗淀試驗凝膠內(nèi)沉凝膠內(nèi)沉淀試驗淀試驗凝膠免疫凝膠免疫電泳技術電泳技術3.3.沉淀反應的類型沉淀反應的類型l絮狀沉淀試驗是將抗原與相應抗體混合，在絮狀沉淀試驗是將抗原與相應抗體混合，在電解質(zhì)電解質(zhì)存在的條件下，抗原抗體結合形成肉眼可見的絮狀沉存在的條件下，抗原抗體結合形成肉眼可見的絮狀沉淀物。淀物。l方法方法受抗原抗體比例的影響

13、受抗原抗體比例的影響非常明顯非常明顯l應用于測定抗原抗體反應的最適比例應用于測定抗原抗體反應的最適比例l三種類型：三種類型： 抗原稀釋法：抗原最適比例抗原稀釋法：抗原最適比例 抗體稀釋法：抗體最適比例抗體稀釋法：抗體最適比例 方陣滴定法：抗原抗體最適比例方陣滴定法：抗原抗體最適比例一、一、 絮狀沉淀試驗絮狀沉淀試驗第二節(jié)液體內(nèi)沉淀試驗第二節(jié)液體內(nèi)沉淀試驗抗體抗體稀釋度稀釋度抗原稀釋度抗原稀釋度1/101/101/201/201/401/401/801/801/1601/1601/3201/3201/6401/640對照對照1/51/5+ + + + + + + + + + + + + + +1

14、/101/10+ + + + + + + + + + + + + + +1/201/20+ + + + + + + + + + + + + + +1/401/40+ + + + + + + + + + +1/801/80+ + + +最適比例方陣測定法最適比例方陣測定法二、免疫濁度測定二、免疫濁度測定1.1.原理原理 當當可溶性抗原可溶性抗原與相應抗體特異結合，與相應抗體特異結合，二者比例合適二者比例合適時時，在特殊的緩沖液中它們快速形成一定大小的抗原抗，在特殊的緩沖液中它們快速形成一定大小的抗原抗體復合物，使反應液體出現(xiàn)濁度。利用現(xiàn)代光學測量儀體復合物，使反應液體出現(xiàn)濁度。利用現(xiàn)代光學測量儀

15、器對濁度進行測定從而檢測抗原含量。器對濁度進行測定從而檢測抗原含量。 2.2.影響因素影響因素抗原抗體的比例：抗原抗體的比例： 反應體系中保持抗體過量反應體系中保持抗體過量抗體的質(zhì)量抗體的質(zhì)量: : 特異性強，效價高，親和力強。特異性強，效價高，親和力強。 抗原抗體反應液的最適抗原抗體反應液的最適ph:ph: 為為6.56.58.5 8.5 可溶性抗原可溶性抗原和相應抗體在凝膠中擴散，和相應抗體在凝膠中擴散，形成濃度形成濃度梯度梯度，在抗原抗體相遇并且，在抗原抗體相遇并且濃度比例適當?shù)奈恢脻舛缺壤m當?shù)奈恢眯纬尚纬扇庋劭梢姷某恋砭€或沉淀環(huán)。肉眼可見的沉淀線或沉淀環(huán)。 常用的凝膠有瓊脂、瓊脂糖、

16、葡聚糖或聚丙烯酰常用的凝膠有瓊脂、瓊脂糖、葡聚糖或聚丙烯酰胺凝膠。胺凝膠。第三節(jié)凝膠內(nèi)沉淀試驗第三節(jié)凝膠內(nèi)沉淀試驗一、原理一、原理二、方法二、方法1 1、單向擴散試驗、單向擴散試驗 （平板法）（平板法）原理：原理： 抗體與待測的抗原抗體與待測的抗原, ,在兩者比例合適的部位結合形成沉在兩者比例合適的部位結合形成沉淀環(huán)。淀環(huán)。環(huán)的大小與抗原的濃度成正相關?？梢远俊－h(huán)的大小與抗原的濃度成正相關?？梢远?。技術要點：技術要點： 將抗體混入將抗體混入0.9%0.9%瓊脂糖內(nèi)（瓊脂糖內(nèi)（5050），未凝固前傾注成），未凝固前傾注成平板，凝固后打孔（直徑平板，凝固后打孔（直徑3 35 5mm mm ），

17、孔中加入抗原溶液和），孔中加入抗原溶液和不同濃度的標準品，置濕盒內(nèi)不同濃度的標準品，置濕盒內(nèi)37,2437,244848h h 觀察孔周圍是觀察孔周圍是否出現(xiàn)沉淀環(huán)。否出現(xiàn)沉淀環(huán)。傾注平板打孔加樣傾注平板打孔加樣 放置放置373724244848h h觀察沉淀環(huán)觀察沉淀環(huán) 單向擴散試驗（平板法）單向擴散試驗（平板法）影響因素：影響因素： 抗體質(zhì)量抗體質(zhì)量 標準曲線標準曲線 ，質(zhì)控血清，質(zhì)控血清 結果與真實含量不符結果與真實含量不符 雙環(huán)現(xiàn)象（不同擴散率抗原性相同的兩個組分）雙環(huán)現(xiàn)象（不同擴散率抗原性相同的兩個組分） 上排為上排為5 5個不同濃度的參考品；下排為患者血清，下排個不同濃度的參考品；

18、下排為患者血清，下排右右2 2為異常病理血清為異常病理血清2 2、雙向擴散試驗、雙向擴散試驗 （平板法）（平板法）原理：原理： 將抗原抗體分別加在瓊脂糖不同的對應孔中，兩者在將抗原抗體分別加在瓊脂糖不同的對應孔中，兩者在凝膠中自由擴散，凝膠中自由擴散，在比例合適處形成白色沉淀線在比例合適處形成白色沉淀線。鑒定抗。鑒定抗原抗體的最基本、最常見的方法之一原抗體的最基本、最常見的方法之一 技術要點：技術要點： 平板玻璃上傾注一層均勻的瓊脂糖薄層，凝固后打孔，平板玻璃上傾注一層均勻的瓊脂糖薄層，凝固后打孔，孔徑為孔徑為3 3mmmm，孔間距在孔間距在3 35 5 mmmm之間，在相對的孔中加入抗之間，

19、在相對的孔中加入抗原或抗體，放置濕盒原或抗體，放置濕盒371837182424h h 后，觀察孔周圍是否出后，觀察孔周圍是否出現(xiàn)沉淀環(huán)?，F(xiàn)沉淀環(huán)。 應用應用a.a.抗原或抗體的存在與否以及相對含量的估計；抗原或抗體的存在與否以及相對含量的估計；b.b.抗原或抗體相對分子量的估計抗原或抗體相對分子量的估計; ;c.c.抗原性質(zhì)的分析抗原性質(zhì)的分析; ;d.d.抗體效價的滴定抗體效價的滴定; ;e.e.抗原或抗體純度的鑒定?？乖蚩贵w純度的鑒定。優(yōu)點：優(yōu)點： 1. 1.加快反應的速度。加快反應的速度。 2. 2.提高了靈敏度。提高了靈敏度。3.3.增加了分辨率。增加了分辨率。 抗原抗體反應抗原抗體

20、反應的高度特異性的高度特異性電泳技術的高電泳技術的高分辨率、快速、分辨率、快速、微量微量第四節(jié)免疫電泳技術第四節(jié)免疫電泳技術電泳分析電泳分析 沉淀反應沉淀反應原理：原理：雙向擴散雙向擴散+ + 電泳電泳比雙向擴散試驗靈比雙向擴散試驗靈敏度提高敏度提高8 8 1616倍倍技術要點：技術要點：制備制備1.2%1.2%巴比妥巴比妥瓊脂凝膠板，在其上成對打瓊脂凝膠板，在其上成對打孔，孔徑孔，孔徑3 3mmmm，孔距孔距6 6 mmmm，于陰極側孔內(nèi)加待測血清，于陰極側孔內(nèi)加待測血清，陽性側孔加抗血清，電泳陽性側孔加抗血清，電泳。一、對流免疫電泳一、對流免疫電泳蛋白質(zhì)抗原常蛋白質(zhì)抗原常帶較強的負電帶較強

21、的負電荷，在電場中荷，在電場中向向正極正極移動移動抗體球蛋白抗體球蛋白帶負電荷較少，帶負電荷較少，籍電滲作用向籍電滲作用向負極負極泳動泳動 對流免疫電泳對流免疫電泳通電通電結果分析：結果分析：無沉淀線出現(xiàn)則表明無相無沉淀線出現(xiàn)則表明無相應的抗原。應的抗原。沉淀線位于抗原抗體孔中沉淀線位于抗原抗體孔中間，說明兩者比例較適合。間，說明兩者比例較適合。沉淀線偏向抗原孔一方，沉淀線偏向抗原孔一方，表示抗體濃度抗原，反表示抗體濃度抗原，反之，則是抗體濃度抗原之，則是抗體濃度抗原濃度。濃度。對流免疫電泳對流免疫電泳 電泳時凝膠中電泳時凝膠中抗體不移動抗體不移動，樣品孔中的抗原向正極樣品孔中的抗原向正極泳動

22、泳動，隨著抗原量的逐漸減少，抗原泳動的基底區(qū)越來，隨著抗原量的逐漸減少，抗原泳動的基底區(qū)越來越窄，抗原抗體分子復合物形成的沉淀線逐漸變窄，形越窄，抗原抗體分子復合物形成的沉淀線逐漸變窄，形成一個形狀如火箭的不溶性復合物沉淀峰，成一個形狀如火箭的不溶性復合物沉淀峰，抗體濃度固抗體濃度固定時，峰的高度與抗原量呈正相關定時，峰的高度與抗原量呈正相關。 二、火箭免疫電泳二、火箭免疫電泳1.1.原理：原理：單向免疫擴散電泳，定量檢測技術單向免疫擴散電泳，定量檢測技術2. 2. 技術要點：技術要點： 1.2% 1.2%巴比妥瓊脂糖約巴比妥瓊脂糖約5555，加入適量抗血清，混勻后，加入適量抗血清，混勻后制板，打孔，孔內(nèi)加待測樣品，樣品孔放負極側，制板，打孔，孔內(nèi)加待測樣品，樣品孔放負極側， 6h 6h后觀后觀察瓊脂板上沉淀峰，繪制標準曲線，求出待測樣品濃度。察瓊脂板上沉淀峰，繪制標準曲線，求出待測樣品濃度。3. 3. 影響因素：影響因素：瓊脂（無電滲或電滲很小的）影響火箭形狀不規(guī)則瓊脂（無電滲或電滲很小的）影響火箭形狀不規(guī)則; ;電泳終點時間的確定電泳終點時間的確定; ;標本數(shù)量多時應先通電后加樣標本數(shù)量多時應先通電后加樣, ,防止寬底峰形防止寬底峰形; ;iggigg定量時，可用甲醛與定量時，可用甲醛與iggigg上的氨基結合