三提取和分離PPT課件

1、學(xué)習(xí)內(nèi)容：制備細(xì)胞總DNA培養(yǎng)、搜集細(xì)菌細(xì)胞制備細(xì)胞提取物DNA純化、濃縮從其他生物中提取總DNA質(zhì)粒DNA提取根據(jù)分子大小分離根據(jù)結(jié)構(gòu)分離質(zhì)粒擴(kuò)增提取噬菌體DNA噬菌體的培養(yǎng)制備非溶源性噬菌體收集噬菌體從噬菌體中純化DNA 純化M13 DNA 第1頁(yè)/共41頁(yè)Figure3.1 The basic steps in preparation of total cell DNA from a culture of bacteriaBasic Steps第2頁(yè)/共41頁(yè)1.制備總DNA基本步驟：1) 收集細(xì)菌細(xì)胞2)打碎細(xì)胞，釋放內(nèi)容物3)去掉DNA以外的成分4)DNA溶液的濃縮第3頁(yè)/共41頁(yè)1

2、.1培養(yǎng)、搜集細(xì)菌細(xì)胞兩種類型的細(xì)菌培養(yǎng)基的成分： M9培養(yǎng)基： Na2HPO4(6.0) KH2PO4(3.0) NaCl(0.5) NH4Cl(1.0) MgSO4(0.5) Glucose(2.0) CaCl2(0.015) LB培養(yǎng)基：Yeast extract(5) NaCl(10)第4頁(yè)/共41頁(yè)1.1培養(yǎng)、收集細(xì)菌細(xì)胞37C，150-250rpm達(dá)到最大濃度2-3109cell/ml, 600nm下的OD值，1OD相當(dāng)于0.8109cell/ml Figure3.2 Estimation of bacterial cell number by measurement of opt

3、ical density第5頁(yè)/共41頁(yè)Figure3.3 Harvesting bacteria by centrifugation第6頁(yè)/共41頁(yè)1.2 制備細(xì)胞提取物利用溶菌酶、EDTA或兩者結(jié)合。 溶菌酶是存在于蛋清或眼淚、唾液等分泌物中，消化多聚物。 EDTA絡(luò)合保持細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整的鎂離子，也可以抑制細(xì)胞中降解DNA酶的活性。 一般溶菌酶或EDTA足以破壞細(xì)菌細(xì)胞，在提取液中同時(shí)還加入SDS。 第7頁(yè)/共41頁(yè)Figure3.4 Preparation of a cell extract.第8頁(yè)/共41頁(yè)Figure3.5 Removal of protein contaminants

4、 by phenol extraction. 第9頁(yè)/共41頁(yè)1.制備細(xì)胞總DNA1.4 DNA的濃縮與濃度測(cè)定最常用的方法是乙醇沉淀（同時(shí)含有Na離子）。DNA沉淀可用玻璃棒挑出，或者離心沉淀。260nm下測(cè)定吸光度，1OD相當(dāng)于50g雙鏈DNA/ml。A260/A280=1.8，2說(shuō)明有RNA第10頁(yè)/共41頁(yè)Figure3.6 Collecting DNA by ethanol precipitation .第11頁(yè)/共41頁(yè)Figure3.7 The CTAB method for purification of plant DNA十六烷基三十六烷基三甲基溴化銨甲基溴化銨第12頁(yè)/共4

5、1頁(yè)Figure3.8 The use of an anion-exchange chromatography resin in DNA purification.第13頁(yè)/共41頁(yè)2 質(zhì)粒DNA提取質(zhì)粒DNA的大?。?8%）。DNA的構(gòu)造 Alkaline denaturation Ethidium bromide（溴化二氨乙苯啡啶）-caesium chloride（氯化銫） density gradient centrifugation第14頁(yè)/共41頁(yè)2質(zhì)粒DNA提取2.1 根據(jù)分子大小提取質(zhì)粒DNA sphaeroplasts裂解細(xì)胞可以破壞部分細(xì)胞壁，而保持細(xì)胞膜的完整。 問(wèn)題：

6、裂解液中不可避免的包含一些染色體DNA 質(zhì)粒分子非常大時(shí) ，將與染色體DNA共沉淀第15頁(yè)/共41頁(yè)Figure3.9 Preparation of a cleared .Sphaeroplast殘壁細(xì)胞殘壁細(xì)胞第16頁(yè)/共41頁(yè)2質(zhì)粒DNA提取2.2 根據(jù)分子構(gòu)造提取 堿裂解法 基本原理：在非常窄的pH范圍內(nèi)，非螺旋化的DNA會(huì)變性，而螺旋化的質(zhì)粒不變性。在裂解液中加入氫氧化鈉，調(diào)pH值至12.012.5,破壞氫鍵，使DNA變性。加入酸，變性的細(xì)菌DNA進(jìn)一步聚集形成沉淀，通過(guò)離心的方法去除。另外一個(gè)優(yōu)點(diǎn)，利用SDS（十二烷基磺酸鈉）（Sodium dodecyl sulfate，SDS），

7、裂解，KAc中和可以去掉大部分的蛋白質(zhì)和RNA。第17頁(yè)/共41頁(yè)Figure3.10 Two conformation of circular double-stranded DNA.第18頁(yè)/共41頁(yè)Figure3.11 Plasmid purification by the alkaline denaturation method.Alkaline denaturation第19頁(yè)/共41頁(yè)2質(zhì)粒DNA提取2.2 EBCsCl密度梯度離心法在大離心力條件下，形成梯度，生物大分子形成條帶。條帶的位置取決于其浮力密度。最上部是蛋白質(zhì)，中間是DNA，下部是RNA。第20頁(yè)/共41頁(yè)Figure

8、3.12 CsCl density gradient centrifugation.CsCl density gradient centrifugation第21頁(yè)/共41頁(yè)2.2 EBCsCl密度梯度離心法 EB插入相鄰的堿基之間，降低了DNA的浮力密度，但超螺旋的DNA結(jié)合EB浮力密度降低較小，僅有0.085g/cm3。 CsCl可以用丁醇抽提，透析除去。純度可達(dá)100%。第22頁(yè)/共41頁(yè)Figure3.13 Partial unwinding of the DNA double helix by EtBr intercalation between adjacent base pari

9、rs.EB如何與如何與DNA結(jié)合結(jié)合?第23頁(yè)/共41頁(yè)Figure3.14Purification of plasmiod DNA by EtBr-CsCl density gradient centrifugation如何分離質(zhì)粒如何分離質(zhì)粒DNA？第24頁(yè)/共41頁(yè)2質(zhì)粒DNA提取2.3 質(zhì)粒擴(kuò)增 一些多拷貝質(zhì)粒具有在無(wú)蛋白合成條件下復(fù)制的能力。當(dāng)細(xì)胞增加到足夠數(shù)目時(shí)，加入蛋白合成抑制劑如氯霉素，繼續(xù)培養(yǎng)。在這個(gè)過(guò)程中，質(zhì)粒分子繼續(xù)復(fù)制，但染色體的復(fù)制和細(xì)胞分裂已經(jīng)停止，可以獲得上千個(gè)拷貝。第25頁(yè)/共41頁(yè)Figure3.15 Plasmid amplification Plasmid

10、 amplificationInhibitor of protein synthesis: Chloramphenical, 12h, 第26頁(yè)/共41頁(yè)3 噬菌體DNA的制備當(dāng)培養(yǎng)物離心時(shí)，細(xì)菌沉淀到底部，噬菌體留在懸浮液中，去蛋白就可以獲得噬菌體DNA。然而獲得大量的噬菌體DNA是一個(gè)障礙。每ml菌液可以獲得1010噬菌體，但只能產(chǎn)生500ngDNA。第27頁(yè)/共41頁(yè)3 噬菌體DNA的制備3.1 噬菌體的培養(yǎng)自然培養(yǎng)的噬菌體是溶源性的。要獲得大量的細(xì)胞外噬菌體，必須經(jīng)過(guò)誘導(dǎo)培養(yǎng)使所有的噬菌體都進(jìn)入裂解周期，使細(xì)胞死亡釋放噬菌體。第28頁(yè)/共41頁(yè)3.1 噬菌體的培養(yǎng)大部分實(shí)驗(yàn)室都使用cI

11、突變的溫度敏感突變體。cI基因可以使噬菌體保持整合狀態(tài)，突變后轉(zhuǎn)變成溶菌性的。在cIts突變體中，cI基因在30C條件下正常表達(dá)，在42C時(shí)，不能正常表達(dá)，產(chǎn)生溶菌性。第29頁(yè)/共41頁(yè)Figure3.17 Induction of a clts lysogen（溶原菌） by transferring from 30 to 42第30頁(yè)/共41頁(yè)Figure3.18 Achieving the right balance between culture age and inoculum size when preparing a sample of a non-lysogenic phage

12、由于缺失修飾，大由于缺失修飾，大多數(shù)基因工程載體多數(shù)基因工程載體屬于此類型。屬于此類型。第31頁(yè)/共41頁(yè)3 噬菌體DNA的制備3.3 收集噬菌體 噬菌體顆粒非常小，所以只有高速離心才能沉淀。通常利用PEG沉淀病毒顆粒，形成多聚體。離心可以收集噬菌體，重新溶解在少量的溶液中。第32頁(yè)/共41頁(yè)3 噬菌體DNA的制備3.4 從噬菌體中純化DNA PEG沉淀物中可能含有少量的細(xì)菌裂解物，也可能含有細(xì)菌DNA。這些組成部分可以通過(guò)梯度離心去掉。除去CsCl后可以獲得純凈的噬菌體。然后通過(guò)酚抽提或者蛋白酶處理蛋白質(zhì)外殼。第33頁(yè)/共41頁(yè)Figure3.19 Collection of phage p

13、articles by polyethylene（聚乙烯） glycol（乙二醇）(PEG) precipitation 第34頁(yè)/共41頁(yè)Figure3.20 Purification of phage particles by CsCl density gradient centrifugation.第35頁(yè)/共41頁(yè)第36頁(yè)/共41頁(yè)3.5 純化M13 DNA 每ml菌液可以獲得1012的噬菌體。這意味著少量的培養(yǎng)物可以獲得大量的噬菌體，如5ml或更少。由于細(xì)菌細(xì)胞不裂解，沒(méi)有細(xì)胞裂解物的問(wèn)題，也不需要CsCl梯度離心。第37頁(yè)/共41頁(yè)Figure3.21 Preparation of M13 DNA fr