黑果腺肋花楸莖尖培養(yǎng)中不同消毒方法的比較研究

1、黑果腺肋花楸莖尖培養(yǎng)中不同消毒方法的比較研究摘 要本實(shí)驗(yàn)以黑果腺肋花楸莖尖為組培材料，研究不同消毒劑和不同處理時(shí)間對(duì)莖尖消毒效果的影響，使污染降低，提高組織培養(yǎng)的誘導(dǎo)率。本實(shí)驗(yàn)分別用濃度為0.1%氯化汞和8%次氯酸鈉對(duì)黑果腺肋花楸莖尖進(jìn)行不同時(shí)間的消毒處理，然后根據(jù)不同消毒劑和不同處理時(shí)間對(duì)莖尖誘導(dǎo)不定芽進(jìn)行比較，把誘導(dǎo)率和污染率作為評(píng)價(jià)指標(biāo)。結(jié)果表明：用8%的次氯酸鈉對(duì)莖尖進(jìn)行消毒15min，得苗情況是90%，污染情況為6.67%，褐化情況為3.33%，效果最好；用0.1%氯化汞對(duì)莖尖進(jìn)行消毒6min，得苗情況是3.33%，污染情況為86.67%，褐化情況為10%，效果最差。關(guān)鍵詞：黑果腺肋

2、花楸；莖尖；消毒方法；比較研究THE ROSACEAE PLANT BLACK CHOKEBERRY SHOOT TIP CULTURE COMPARISON OF DIFFERENT METHODS OF STERILIZATIONABSTRACTThe thesis is based on the Rosaceae plant black chokeberry shoot tip as the experimental materials of in use after the different disinfection methods of Sorbus pohuashanensis

3、stem tip regeneration. Sterilization of explants in tissue culture is a very important link, this experiment respectively with 0.1% mercuric chloride and 8% sodium hypochlorite of Sorbus pohuashanensis stem apex for the disinfection of the treatment of different treatment depending on the time of di

4、sinfectants and shoot tip induce adventitious buds were compared to induce rate and contamination rate as the evaluation index. Test results show that: with 8% sodium hypochlorite disinfection immersion 15min, The survival rate of shoot tips was 90%, and the pollution was 6.67%, and with the 3.33% b

5、rowning case, this way was the best results; with 0.1% mercuric chloride were explants disinfection 6min, the survival rate of shoot tips was 3.33%, and the pollution was 86.67%, and browning the case of 10%, this was the worst one.Key words: Aronia melanocarpa Elliot; stem tip; disinfection method;

6、 comparative study目 錄1 前 言11.1 花楸的介紹及概述11.1.1 生物學(xué)習(xí)性11.1.1 生態(tài)學(xué)特性11.1.2 觀賞價(jià)值和市場(chǎng)價(jià)值21.1.3 黑果腺肋花楸栽培現(xiàn)狀21.2 花楸莖尖培養(yǎng)中的常見(jiàn)的消毒方法31.2.1乙醇31.2.2 氯化汞31.2.3次氯酸鈉31.2.4漂白粉41.2.5次氯酸鈣41.3 本實(shí)驗(yàn)的目的及意義42 材料與方法52.1 實(shí)驗(yàn)材料52.2 實(shí)驗(yàn)藥品52.3 實(shí)驗(yàn)儀器62.4 實(shí)驗(yàn)方法62.4.1 無(wú)菌莖尖的獲得62.4.2 培養(yǎng)基的制備72.4.3 無(wú)菌室及培養(yǎng)基的滅菌82.4.4 培養(yǎng)步驟92.4.5 培養(yǎng)條件92.4.6測(cè)定方法93

7、結(jié)果與分析113.1 次氯酸鈉不同消毒時(shí)間對(duì)莖尖生長(zhǎng)發(fā)育的影響113.2 氯化汞不同消毒時(shí)間對(duì)莖尖生長(zhǎng)發(fā)育的影響113.3 不同劑和不同消毒處理時(shí)間對(duì)莖尖生長(zhǎng)發(fā)育的影響124 結(jié) 論13參考文獻(xiàn)14致 謝151 前 言1.1 花楸的介紹及概述1.1.1 生物學(xué)習(xí)性黑果腺肋花楸(Aroniamelanocarpaelliot)，又稱不老莓、野生莓，它是植物界被子植物門，薔薇科，花楸屬的腺肋花楸，落葉灌木。樹(shù)高1.53m，球形或叢狀樹(shù)形，樹(shù)高與冠徑大約相同。具有淺根性，葉互生的特點(diǎn)。花期20天，花序是復(fù)傘房，花顏色為白色的完全花1。黑果腺肋花楸的花芽是混合芽，頂芽和側(cè)芽均可結(jié)出果實(shí)，花屬兩性花。光

8、滑的樹(shù)皮，皮孔圓形，灰色。淺根性的根系屬，水平根具有很發(fā)達(dá)的特性，主根分布在3040cm 的土層中2。果實(shí)為漿果，味道甜酸略澀，暗紅色果肉，1.5cm左右直徑，在無(wú)霜期較短的寒冷地區(qū)，整個(gè)冬天果實(shí)可宿存樹(shù)上，是珍貴的觀賞樹(shù)種。黑果腺助花楸是喜光植物，同時(shí)具有很強(qiáng)的抵寒、抗旱性，即使極限低溫-40以上，降水量?jī)H僅400 mm以上的不良條件下也能正常生長(zhǎng)3。1.1.1 生態(tài)學(xué)特性花楸為中生落葉闊葉灌木，性喜濕潤(rùn)土壤，耐濕冷環(huán)境，也能耐干燥瘠薄的土壤環(huán)境，多沿著溪澗山谷的陰坡生長(zhǎng)。我國(guó)的東北黑龍江省老爺嶺、小興安嶺及完達(dá)山地區(qū)為主要分布地區(qū)；另外，東北地區(qū)的遼寧省和吉林省及華北各省也有很多分布。此外

9、，在俄羅斯的遠(yuǎn)東地區(qū)和朝鮮北部也有不多數(shù)量的分布，常常生長(zhǎng)在海拔比較高的山谷雜木林內(nèi)、山地暗針葉林內(nèi)，以及林緣、山路旁和河岸等地，其狀態(tài)呈單株散生。我國(guó)東北地區(qū)的優(yōu)質(zhì)花楸樹(shù)種作為城市良好的綠化樹(shù)種，鄰國(guó)日本引進(jìn)進(jìn)行栽培，并且在東京、大坂等地區(qū)有著很好的發(fā)育情況4。1.1.2 觀賞價(jià)值和市場(chǎng)價(jià)值花楸具有挺拔美觀的樹(shù)干，春發(fā)新芽，郁郁蔥蔥，枝秀葉美。夏天青青綠葉，花白如雪，令人著迷。入秋紅黃相間的果實(shí)與它的綠葉相配，多種色彩互相映照。晚秋葉片色彩斑斕，或黃、或紅、或粉、或紫，更加凸顯出果實(shí)的紅艷。冬天枝脫葉落，挺拔俊朗的身姿上掛滿了紅紅的果實(shí)。花楸是一種優(yōu)良的觀賞型樹(shù)種，所以在園林種植，城市美化綠

10、化等多方面是優(yōu)選的樹(shù)種5?；ㄩ钡墓麑?shí)當(dāng)中有豐富的維生素，一克果實(shí)含有胡蘿卜素8毫克，維生素C 40150毫克，另外果實(shí)中含有豐富的檸檬酸和糖等，可以制成美味可口的食用產(chǎn)品，例如果醬、果醋、果酒、果汁、果凍、蜜餞、干粉等6。也可以制作含有維生素的糧果餡和巧克力，所以花楸食用價(jià)值還是不錯(cuò)的。同時(shí)花楸的根、果實(shí)、種子等可以入藥，有止咳化痰，調(diào)理脾胃之功效，樹(shù)皮制成的藥劑可用于腹泄的治療，漿果中的成分可以提煉漱口藥的配方，也可用于扁桃體炎的治療。還可以治療肺結(jié)核、慢性支氣管炎等多種身體疾病，在醫(yī)藥用途方面前景廣闊7。另外，花楸樹(shù)因?yàn)槠溆兄?xì)膩堅(jiān)硬的材質(zhì)，常用作家具的制作，農(nóng)民也常把它用來(lái)做農(nóng)用工具8-

11、9。1.1.3 黑果腺肋花楸栽培現(xiàn)狀黑果腺肋花楸原產(chǎn)地位于美國(guó)東北部，波羅的海沿岸至太平洋沿岸也皆有生長(zhǎng)，在歐洲的引種栽培歷史已百余年。歐美的保加利亞、加拿大和亞洲地區(qū)的朝鮮、日本都有引進(jìn)栽培種植。19461947年，前蘇聯(lián)的黑果花楸全境普及，在之后的1020年間，黑果腺肋花楸迅速推廣，總種植面積達(dá)到了9000公頃以上10。在將近20年的時(shí)間里，全球腺肋花楸的栽種范圍也在逐步的增長(zhǎng)。歐洲部分國(guó)家例如匈牙利、波蘭、烏克蘭等國(guó)已經(jīng)有了較大范圍的栽培和比較穩(wěn)定的加工產(chǎn)業(yè)，此外，在斯洛伐克和捷克等國(guó)也有較大的栽種面積。我國(guó)引進(jìn)黑果腺肋花楸的經(jīng)濟(jì)樹(shù)種近30年時(shí)間。1989年，遼寧省第一次從鄰國(guó)朝鮮引進(jìn)一

12、個(gè)品種用于干旱地區(qū)造林研究，這開(kāi)啟了我國(guó)研究及利用黑果腺肋花楸的新篇章。1998年，在俄羅斯選擇一個(gè)品種并引進(jìn)；2001年，國(guó)家林業(yè)局的“948”項(xiàng)目“腺肋花楸優(yōu)良種質(zhì)資源及栽培與利用技術(shù)引進(jìn)”由遼寧省干旱地區(qū)造林研究所承擔(dān)發(fā)展，引進(jìn)的腺肋花楸優(yōu)良品種15個(gè)中包括了8個(gè)黑果腺肋花楸優(yōu)良品種，2005年，該項(xiàng)目通過(guò)驗(yàn)收，在國(guó)內(nèi)為進(jìn)一步開(kāi)發(fā)及利用黑果腺肋花楸打下了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)；2008 年，山西省桑干河楊樹(shù)豐產(chǎn)林實(shí)驗(yàn)局在太原地區(qū)也開(kāi)始了對(duì)黑果腺肋花楸引種栽培的探究 11 ；2010年，遼寧省鞍山市岫巖林業(yè)科學(xué)研究所在岫巖地區(qū)建了一個(gè)66.7公頃的示范基地，進(jìn)行黑果腺肋花楸的大量栽植。截止目前，我國(guó)有

13、大約12個(gè)省（直轄市）種植了黑果腺肋花楸樹(shù)種。黑果腺肋花楸的栽植培育在我國(guó)尚處于伊始階段，這些品種具有適應(yīng)性強(qiáng)、產(chǎn)量高、果實(shí)品質(zhì)高及觀賞性好的特點(diǎn)，不僅能滿足園林綠化又能進(jìn)行區(qū)域栽培而且果實(shí)還可以加工成食品，為我國(guó)豐富的良種選育和遺傳資源奠定了豐富的基礎(chǔ)3 。1.2 花楸莖尖培養(yǎng)中的常見(jiàn)的消毒方法由于滅菌藥劑種類不同，所以各種藥劑的殺菌力也有差異。所以在選擇不同的藥劑對(duì)外植體進(jìn)行殺菌時(shí)也要考慮濃度和處理時(shí)間。常見(jiàn)的消毒劑有以下幾種。1.2.1乙醇乙醇的殺菌能力較好，也有很強(qiáng)的組織穿透力。它可以對(duì)實(shí)驗(yàn)材料氣泡內(nèi)的空氣進(jìn)行殺菌，也能夠使材料濕潤(rùn)，為滲入其他消毒劑提供便利，做到既能殺菌又能濕潤(rùn)的雙重

14、功效?？梢掖枷镜臅r(shí)間不適太久，浸泡3060s便能達(dá)到表面滅菌，但滅菌不是很徹底，所以還需要其他殺菌劑的滅菌。1.2.2 氯化汞一種對(duì)人和動(dòng)物毒性巨大的重金屬化合物。常用濃度為0.1%，處理時(shí)間為515min，殺菌效果較好，但是殘余的毒性較大。莖尖滅菌過(guò)后，要用無(wú)菌水沖洗幾次。1.2.3次氯酸鈉次氯酸鈉，鈉的次氯酸鹽，強(qiáng)氧化劑。次氯酸鈉有很好的殺菌效果，也很方便去除，而且對(duì)植物造不成傷害。但因?yàn)榇温人徕c會(huì)隨著時(shí)間的流逝而逐漸分解，所以在使用時(shí)應(yīng)該新鮮配置，避光、避熱、密封保存。1.2.4漂白粉漂白粉是一種具有低毒性質(zhì)的消毒劑，為白色至灰白色的粉末或顆粒，通常情況下含少量的次氯酸鈣，使用時(shí)大約用

15、10%的濃度，或者稱取飽和溶液的上清液，浸泡1030min，殺菌功效比較好，而且對(duì)莖尖傷害較小，容易洗凈。漂白粉應(yīng)密封儲(chǔ)存，現(xiàn)用現(xiàn)配。1.2.5次氯酸鈣較好能溶于水的粉末狀固體，溶于水之后，等澄清后選取上層清液對(duì)材料消毒，一般使用的消毒濃度是35100g/L，大約15min的消毒時(shí)間。但是次氯酸鈣比次氯酸鈉進(jìn)入植物組織內(nèi)的時(shí)間慢很多，而且易潮解，存儲(chǔ)的時(shí)間有一定限制，不適選擇。一般采用消毒后容易除去的消毒劑，如果清除不凈，會(huì)對(duì)植物組織有傷害，不利于發(fā)育生長(zhǎng)。大部分實(shí)驗(yàn)會(huì)選擇氯化汞消毒處理黑果腺肋花楸或者次氯酸鈉對(duì)黑果腺肋花楸進(jìn)行消毒滅菌，但目前沒(méi)有對(duì)二者作為消毒方法的結(jié)果做比較研究。所以本實(shí)驗(yàn)

16、就以氯化汞和次氯酸鈉的消毒方法進(jìn)行比較，觀察更適合黑果腺肋花楸莖尖在組織培養(yǎng)中消毒處理的方法。1.3 本實(shí)驗(yàn)的目的及意義在組培的整個(gè)過(guò)程中，促發(fā)實(shí)驗(yàn)材料污染的原因是多方面的，其中實(shí)驗(yàn)所用材料的消毒環(huán)節(jié)是整個(gè)過(guò)程中最關(guān)鍵的。消毒是否徹底，是否到達(dá)預(yù)期效果，直接對(duì)組織培養(yǎng)能否誘導(dǎo)出苗的結(jié)果造成影響，所以，在開(kāi)始做組培的實(shí)驗(yàn)時(shí)，就要考慮選擇使用哪種消毒方法。消毒劑的選擇不僅能殺滅植物莖尖上的病菌，又能很容易的自行分解掉或者用蒸餾水清洗干凈，而不會(huì)對(duì)花楸莖尖造成一點(diǎn)損傷，影響它的生長(zhǎng)發(fā)育。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)采用不同消毒劑和不同的消毒處理時(shí)間對(duì)黑果腺肋花楸莖尖進(jìn)行外植體消毒，使得在黑果腺肋花楸莖尖的組織培養(yǎng)過(guò)程

17、中，明確不同消毒方法對(duì)莖尖消毒的影響，對(duì)其生長(zhǎng)發(fā)育的差異，從而選擇最佳的消毒劑和最佳的消毒處理時(shí)間，為今后黑果腺肋花楸組織培養(yǎng)中外植體消毒方法的選擇節(jié)省了時(shí)間，也提供了技術(shù)參考。2 材料與方法2.1 實(shí)驗(yàn)材料實(shí)驗(yàn)材料取自于海城實(shí)驗(yàn)園基地。取自一年生生長(zhǎng)健壯、樹(shù)干樹(shù)姿優(yōu)良、色澤好、無(wú)病蟲害的黑果腺肋花楸枝條，將材料取回后，用自來(lái)水沖洗，洗去附著在其表面的泥土，然后把枝條剪成50cm左右的長(zhǎng)度，進(jìn)行水培，溫度控制在25左右。發(fā)芽之后，剪取莖尖為組培的外植體。2.2 實(shí)驗(yàn)藥品表1 實(shí)驗(yàn)藥品實(shí)驗(yàn)藥品分子式生產(chǎn)公司規(guī)格硝酸銨硝酸鉀硫酸鎂磷酸二氫鉀無(wú)水氯化鈣硫酸錳硫酸鋅硫酸銅鉬酸鈉碘化鉀乙二胺四乙酸二鈉煙

18、酸肌醇?xì)溲趸c硝酸銨甘氨酸次氯酸鈉無(wú)水乙醇瓊脂粉氯化汞NH4NO3KNO3MgSO47H2OKH2PO4CaCl22H2OMnSO44H2OZnSO47H2OCuSO45H2ONa2MoO42H2OKINa2-EDTAC6H5N2O2C6H12O6NaOHNH4NO3C2H5NO2NaClOCH3CH2OHHgCL2北京化工廠天津市紅巖化學(xué)試劑廠沈陽(yáng)市東興試劑廠沈陽(yáng)試劑一廠天津市科密歐化學(xué)試劑開(kāi)發(fā)中心天津市大茂化學(xué)試劑廠沈陽(yáng)市東興試劑廠沈陽(yáng)市東興試劑廠天津市化學(xué)試劑四廠沈陽(yáng)試劑一廠天津市光復(fù)科技發(fā)展有限公司國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司北京化工廠天津市紅巖化學(xué)試劑廠北京化工廠國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司

19、沈陽(yáng)市東興試劑廠天津博迪化工股份有限公司北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司分析純?cè)噭﹥?yōu)級(jí)純?cè)噭┓治黾冊(cè)噭┓治黾冊(cè)噭┓治黾冊(cè)噭┓治黾冊(cè)噭┗瘜W(xué)試劑分析純?cè)噭┓治黾冊(cè)噭┓治黾冊(cè)噭┓治黾冊(cè)噭┥噭┥噭┓治黾冊(cè)噭┓治黾冊(cè)噭┓治黾冊(cè)噭┓治黾冊(cè)噭┗瘜W(xué)試劑生物試劑化學(xué)試劑2.3 實(shí)驗(yàn)儀器表2 實(shí)驗(yàn)儀器實(shí)驗(yàn)儀器儀器功能型號(hào)生產(chǎn)廠家電子分析天平超凈工作臺(tái)高壓蒸汽滅菌鍋海爾空調(diào)電磁爐溫度濕度計(jì)電熱蒸餾水器培養(yǎng)架稱取蔗糖、瓊脂等物品進(jìn)行接種操作等培養(yǎng)基、接種器具進(jìn)行高壓蒸汽消毒調(diào)節(jié)培養(yǎng)室的溫度融化培養(yǎng)基中的瓊脂培養(yǎng)室溫度、濕度的檢測(cè)制備蒸餾水培養(yǎng)室內(nèi)的組織培養(yǎng)BS124SCJ-1SLDZX-

20、50KBSKFRd-50Lw/vB(F)C21-RT2104WS-A1TT-98-IIYPT奧多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司天津市泰斯特儀器有限公司上海申安醫(yī)療器械廠青島海爾空調(diào)器有限公司廣東美的生活電器制造有限公司北京宏海永昌儀表技術(shù)開(kāi)發(fā)中心天津市泰斯特儀器有限公司天津市泰斯特儀器有限公司2.4 實(shí)驗(yàn)方法2.4.1 無(wú)菌莖尖的獲得（1）不同消毒時(shí)間處理先用75%酒精分別浸泡六份各3060s，用蒸餾水沖洗干凈后，其中三份用濃度為8%的次氯酸鈉處理不同時(shí)間，分別處理10 min、15 min、20 min，另三份則用濃度為0.1%的氯化汞分別處理不同時(shí)間，分別處理6、10、14min，再用蒸餾水

21、各沖洗過(guò)5次之后接入培養(yǎng)基中，每天觀察記錄莖尖的生長(zhǎng)發(fā)育狀況。（2）不同消毒劑處理a.次氯酸鈉消毒選取水培中生長(zhǎng)枝條的新生嫩芽，用剪刀剪下，放入培養(yǎng)皿中。將莖尖先用洗滌劑沖洗干凈，清水清洗35遍，然后用無(wú)菌水沖洗35遍后，置于75%的乙醇當(dāng)中處理3060s。然后再用蒸餾水沖洗35次，再將花楸莖尖置于8%的次氯酸鈉溶液中浸泡消毒，時(shí)間分別是10min、15min、20min。達(dá)到處理時(shí)間之后，再用蒸餾水沖洗花楸莖尖5次，保證清洗的干凈，然后準(zhǔn)備接入培養(yǎng)基中。b.氯化汞消毒選取水培中生長(zhǎng)枝條的新生嫩芽，用剪刀剪下，放入培養(yǎng)皿中。將莖尖先用洗滌劑清洗干凈，清水沖洗35遍，再蒸餾水沖洗35遍后，置于7

22、5%的乙醇當(dāng)中浸泡60s。再用無(wú)菌水沖洗35次，然后再將花楸莖尖置于0.1%的氯化汞溶液中分別處理6min、10min、14min。時(shí)間到了之后，再用蒸餾水沖洗莖尖5次，保證清洗的干凈，準(zhǔn)備接入培養(yǎng)基中。2.4.2 培養(yǎng)基的制備本實(shí)驗(yàn)采用的培養(yǎng)基配方為：MS+6-BA 2mg/L+NAA 0.5 mg/L。(1)溶解瓊脂在潔凈的不銹鋼鍋內(nèi)放入500mL蒸餾水，加熱至沸騰，隨后調(diào)至小火，緩慢加入8g瓊脂并不斷攪拌直至溶化。玻璃棒在攪拌過(guò)程中朝著一個(gè)時(shí)針?lè)较蜣D(zhuǎn)動(dòng)，防止瓊脂結(jié)塊。(2)溶解蔗糖加入蔗糖15g，快速不斷攪拌直到蔗糖完全溶入含有瓊脂的蒸餾水中。(3)加入母液按照MS培養(yǎng)基的配方量取各種試

23、劑的母液，其中大量元素母液：硝酸銨等混合液和鈣鹽母液各取100mL、有機(jī)物母液和微量元素母液各取10mL、量取5mL鐵鹽母液，再按需求加入生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑50mLNAA母液和30mL6-BA母液。(4)定容添加蒸餾水定容到1000mL。(5)測(cè)pH定容煮沸關(guān)火之后，用0.1mol/L的HCL和NaOH進(jìn)行調(diào)節(jié)pH值，使pH值保持在5.86.0之間，用pH試紙測(cè)定即可。(6)分裝因?yàn)榄傊蠹s在40左右凝結(jié)成固體，所以要趁熱進(jìn)行分裝。選取250mL的錐形瓶裝培養(yǎng)基，分裝容積在3040mL之間。分裝過(guò)程中盡量不要將培養(yǎng)基粘附在瓶口內(nèi)壁上，以免造成污染。(7)封口分裝完成后立即用封口膜和橡皮筋分口，避免出現(xiàn)

24、菌類污染。(8)高壓滅菌用高溫高壓滅菌鍋對(duì)封口之后的培養(yǎng)基進(jìn)行滅菌，121溫度下滅菌，20min的滅菌時(shí)間。滅菌后將培養(yǎng)基移入到培養(yǎng)室觀察，23天后沒(méi)有出現(xiàn)污染，證明滅菌效果好可以使用。激素配制0.1 mg/mL的6-BA的配制：稱取100mg6-BA，用少量0.1mol/L NAOH進(jìn)行溶解，然后定容到1000mL。0.01mg/L的NAA的配制：稱量10mgNAA，用少量0.1mol/L NAOH進(jìn)行溶解，隨后定容到1000mL。2.4.3 無(wú)菌室及培養(yǎng)基的滅菌無(wú)菌室的滅菌無(wú)菌室的組成有兩部分，無(wú)菌操作室和無(wú)菌培養(yǎng)室。無(wú)菌室的滅菌，首先要到無(wú)菌操作室里，對(duì)超凈工作臺(tái)進(jìn)行滅菌處理，連接好電源

25、線，在實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備接種前的約20分鐘，要先打開(kāi)超凈工作臺(tái)的風(fēng)機(jī)和紫外燈。然后再打開(kāi)無(wú)菌操作室和無(wú)菌培養(yǎng)室的紫外燈對(duì)室內(nèi)進(jìn)行殺菌，時(shí)間在20min以上。時(shí)間達(dá)到以后，先關(guān)閉無(wú)菌室的紫外燈，再關(guān)閉超凈工作臺(tái)的紫外燈和風(fēng)機(jī)，然后將超凈工作臺(tái)的開(kāi)關(guān)打開(kāi)，大約15min過(guò)后即可進(jìn)入進(jìn)行實(shí)驗(yàn)操作。培養(yǎng)基的滅菌培養(yǎng)基在制備過(guò)程中會(huì)攜帶多種雜菌，因?yàn)榕囵B(yǎng)基里含有的蔗糖是高濃度的，這種情況是有利于細(xì)菌和微生物滋生的。如果滅菌不當(dāng)，就會(huì)照成微生物的污染，這種情況下，接種的組織會(huì)受到微生物的毒害，所以實(shí)驗(yàn)就不會(huì)成功。因此，在這種情況下，培養(yǎng)基完成分裝后應(yīng)該馬上滅菌處理。常用的儀器設(shè)備是高溫高壓滅菌鍋。在操作高溫高壓滅菌

26、鍋之前要仔細(xì)的檢查各個(gè)部位是否正常，比如滅菌鍋的溫度表、壓力表、放氣閥、安全閥等等。然后檢查鍋底的水量是否足夠，如果不夠，倒入一定量的蒸餾水，避免空燒或者干鍋的現(xiàn)象出現(xiàn)。裝鍋的時(shí)候，要將盛有培養(yǎng)基的錐形瓶垂直的放進(jìn)金屬筐中，然后放入高溫高壓蒸氣滅菌鍋內(nèi)。碼放完畢后蓋上鍋蓋。在消毒的工程當(dāng)中，要排除鍋內(nèi)的冷空氣，因?yàn)橹挥型耆懦藴缇亙?nèi)的空氣后，在鍋內(nèi)全部是蒸汽的情況下，鍋內(nèi)的溫度達(dá)到121，壓力為1.1kg/cm2。在這個(gè)溫度下是可以殺死各種細(xì)菌的，一般殺菌的時(shí)間設(shè)定在20min。設(shè)定的滅菌時(shí)間達(dá)到后，關(guān)閉滅菌鍋的電源開(kāi)關(guān)，打開(kāi)放氣閥進(jìn)行放氣處理，當(dāng)壓力下降到 0.00MPa后，放氣閥再?zèng)]有

27、蒸汽排出的時(shí)候，便可以開(kāi)啟滅菌鍋鍋蓋。在操作實(shí)驗(yàn)儀器滅菌的過(guò)程中，應(yīng)注意安全，避免蒸汽燙傷。2.4.4 培養(yǎng)步驟首先穿好實(shí)驗(yàn)服帶好口罩，用75%的酒精清洗超凈工作臺(tái)的臺(tái)面，接種用的鑷子放在盛有75%的酒精的燒杯中浸泡，其次將裝有花楸莖尖的培養(yǎng)皿、濾紙、消毒的鑷子、盛有75%酒精的燒杯和酒精燈放在超凈工作臺(tái)的臺(tái)面上，再用酒精浸泡過(guò)后的棉球擦洗雙手，點(diǎn)燃在超凈工作臺(tái)上的酒精燈，在超凈工作臺(tái)上的任何步驟都要保證酒精燈是點(diǎn)燃的，然后開(kāi)始接種。將接種用的鑷子全身過(guò)一遍火，之后在酒精燈的火苗上灼燒幾次尖端處即可。然后用鑷子夾起花楸莖尖在濾紙上吸吸表面附著的水，錐形瓶開(kāi)封后瓶口要在酒精燈火苗處旋轉(zhuǎn)幾圈，起到

28、殺菌的效果。再用鑷子夾起黑果腺肋花楸莖尖插入培養(yǎng)基中，莖尖要求直立插入到培養(yǎng)基中，且最好一次成功，鑷子也最好不要碰到瓶壁，避免帶入病菌，污染培養(yǎng)基。如果一個(gè)培養(yǎng)基上接種兩個(gè)或者三個(gè)，要注意莖尖之前的距離不能太近。在接種的過(guò)程中要經(jīng)常過(guò)火接種用的鑷子，防止交叉污染的發(fā)生。在超凈工作臺(tái)上接種時(shí)，接種人員的一切操作步驟都不能離開(kāi)超凈工作臺(tái)，盡量避免語(yǔ)言交流、肢體交流等。接種完成后將接種放進(jìn)裝有酒精的容器內(nèi)。然后將錐形瓶封口即可。最后要清理干凈超凈工作臺(tái)，關(guān)閉其電源。將接種完畢后的錐形瓶放到無(wú)菌培養(yǎng)室的培養(yǎng)臺(tái)上，整齊擺放，每天需要到培養(yǎng)室中開(kāi)空調(diào)控制室溫，澆水，觀察記錄莖尖的發(fā)育情況。2.4.5 培養(yǎng)

29、條件將接種完畢的錐形瓶放在溫度為24的無(wú)菌培養(yǎng)室里連續(xù)培養(yǎng)，每天的光照時(shí)間是16小時(shí)，光源是白熾日光燈，強(qiáng)度大約是20002500Lx。培養(yǎng)室的濕度保持在60%80%。2.4.6測(cè)定方法每天觀察記錄黑果腺肋花楸莖尖的變化情況。得苗情況（%）=得苗數(shù)/該處理接種外植體數(shù)×100污染情況（%）=污染數(shù)/該處理接種外植體數(shù)×100褐化情況（%）=褐化數(shù)/該處理接種外植體數(shù)×1003 結(jié)果與分析3.1 次氯酸鈉不同消毒時(shí)間對(duì)莖尖生長(zhǎng)發(fā)育的影響在預(yù)先使用75%無(wú)水乙醇消毒60s的情況下，利用8%次氯酸鈉對(duì)黑果腺肋花楸莖尖消毒不同時(shí)間進(jìn)行比較研究，研究結(jié)果由表3看出：在接種數(shù)

30、都為30的情況下，從得苗情況來(lái)看，效果從好到壞依次為15min好于20min好于10min。從污染情況來(lái)看，效果好壞依次是浸泡15min好于浸泡20min好于處理10min。從褐化情況來(lái)看，效果好壞依次為15min好于10min好于20min。所以用8%的次氯酸鈉消毒15min過(guò)后的黑果腺肋花楸莖尖效果最好，得苗情況高達(dá)90%，污染情況與褐化情況也為最小水平，分別是6.67%和3.33%。表3 次氯酸鈉不同消毒時(shí)間對(duì)莖尖生長(zhǎng)發(fā)育的影響8%NaClO接種外植體數(shù)得苗數(shù)污染數(shù)褐化數(shù)得苗情況污染情況褐化情況10min30918330%60%10%15min30272190%6.67%3.33%20m

31、in301631153.33%10%36.67%3.2 氯化汞不同消毒時(shí)間對(duì)莖尖生長(zhǎng)發(fā)育的影響在先使用75%無(wú)水乙醇的消毒30s60s的情況下，通過(guò)對(duì)0.1%氯化汞對(duì)花楸莖尖消毒的不同時(shí)間進(jìn)行研究，研究見(jiàn)表4：在接種數(shù)都為30的情況下，從得苗率來(lái)看，效果從好到壞依次為10min好于14min好于6min。從污染情況來(lái)看，效果好壞依次是10min好于14min好于6min。從褐化情況來(lái)看，消毒處理10min的效果好于處理6min和處理14min的效果。所以用0.1%的氯化汞溶液消毒10min過(guò)后的花楸莖尖整體效果最佳，得苗情況高達(dá)83.33%，污染情況與褐化情況也為最低水平，分別為13.34%和

32、3.33%。表4 氯化汞不同消毒時(shí)間對(duì)莖尖生長(zhǎng)發(fā)育的影響0.1%HgCl2接種外植體數(shù)得苗數(shù)污染數(shù)褐化數(shù)得苗情況污染情況褐化情況6min3012633.3386.671010min30254183.3313.343.3314min301413346.6743.33103.3 不同劑和不同消毒處理時(shí)間對(duì)莖尖生長(zhǎng)發(fā)育的影響結(jié)合以上兩種消毒劑不同消毒處理時(shí)間對(duì)黑果腺肋花楸莖尖組培誘導(dǎo)的影響結(jié)果，綜合比較每一種消毒劑消毒處理的最佳效果，優(yōu)選出黑果腺肋花楸莖尖組培誘導(dǎo)的最適消毒劑和最佳消毒處理時(shí)間。由表5可見(jiàn)，在接種外植體數(shù)都為30的情況下，8%的次氯酸鈉作為消毒劑來(lái)處理黑果腺肋花楸莖尖15min，其中

33、得苗情況為90%，污染情況為6.67%，褐化情況為3.33%。0.1%的氯化汞作為消毒劑來(lái)浸泡黑果腺肋花楸莖尖10min，其中得苗情況為83.33%，污染情況為13.34%，褐化情況為3.33%。在得苗情況方面，8%的次氯酸鈉好過(guò)0.1%的氯化汞；污染情況來(lái)看，8%的次氯酸鈉好于0.1%的氯化汞；而褐化情況則是0.1%的氯化汞與8%的次氯酸鈉持平。綜合數(shù)據(jù)比較，8%的次氯酸鈉消毒處理過(guò)后的黑果腺肋花楸莖尖生長(zhǎng)發(fā)育情況更好。表5 不同劑和不同消毒處理時(shí)間對(duì)莖尖生長(zhǎng)發(fā)育的影響消毒方法消毒時(shí)間接種外植體數(shù)得苗數(shù)污染數(shù)褐化數(shù)得苗情況污染情況褐化情況8%NaClO15min302721906.673.3

34、30.1%HgCl210min30254183.3313.343.33在花楸莖尖的整個(gè)組培過(guò)程中，最重要的就是消毒方法的選擇。根據(jù)表3、表4和表5的結(jié)果來(lái)分析，應(yīng)該選擇8%的次氯酸鈉，由表5能看出，次氯酸鈉90%的得苗情況比氯化汞的83.33%的得苗情況好，所以消毒溶液應(yīng)該選擇8%的次氯酸鈉。再通過(guò)表3能看出，15min的消毒時(shí)間對(duì)花楸莖尖的效果最好，因?yàn)榈妹缏矢哌_(dá)90%，遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過(guò)10min的30%和20min的53.33%。而在污染情況和褐化情況來(lái)看也是最低的，遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于10min和20min。4 結(jié) 論植物組織培養(yǎng)即植物無(wú)菌培養(yǎng)技術(shù)，又稱為離體培養(yǎng)。在組織培養(yǎng)的整個(gè)過(guò)程中，污染常常發(fā)生，所以

35、在操作實(shí)驗(yàn)開(kāi)始時(shí)，必須首先對(duì)該實(shí)驗(yàn)所需的外植體進(jìn)行全面徹底的滅菌消毒，不僅要將外植體表面的微生物徹底殺死，而且還不能對(duì)外植體的組織和表層細(xì)胞功能造成影響，這樣才能得到不污染外植體而且能使外植體存活。所以選擇最好的消毒處理方法對(duì)實(shí)驗(yàn)所需外植體進(jìn)行消毒是組培整個(gè)過(guò)程中最關(guān)鍵的一步。該實(shí)驗(yàn)用不同的消毒劑和消毒時(shí)間處理黑果腺肋花楸莖尖，對(duì)于控制污染有很好的效果。先用75%的酒精浸泡黑果腺肋花楸莖尖3060s，達(dá)到一個(gè)表面殺菌的效果，然后用不一樣的消毒劑對(duì)其進(jìn)行處理，每種溶劑處理的消毒時(shí)間也不相同。從消毒方法來(lái)看，8%的次氯酸鈉消毒處理應(yīng)該選擇15min，因?yàn)樵诘妹缜闆r方面高出了消毒10min和消毒20

36、min之后很多，從污染情況和褐化情況方面，又好于消毒處理10min和20min很多。0.1%氯化汞消毒時(shí)間應(yīng)選擇10min，因?yàn)橄咎幚?0min時(shí)，無(wú)論是得苗情況或者是污染情況亦或者褐化情況，都比處理6min和14min好太多。在消毒時(shí)間方面，當(dāng)消毒時(shí)間達(dá)不到標(biāo)準(zhǔn)時(shí)，其得苗率不高，污染率和褐化率反而不低，莖尖生長(zhǎng)發(fā)育效果及其不好，但是消毒時(shí)間過(guò)長(zhǎng)也會(huì)帶來(lái)相似的情況。所以應(yīng)該選擇最合適的消毒時(shí)間。其中8%的次氯酸鈉最佳的處理時(shí)間為15min時(shí)效果最好，0.1%的氯化汞最佳浸泡時(shí)間為10min時(shí)效果最佳。在比較兩種最佳的消毒時(shí)間后再比較兩種的處理效果，得苗情況來(lái)看，8%次氯酸鈉消毒15min之后的得苗情況為90%，大于0.1%氯化汞浸泡處理10min之后的83.33%。在污染情況方面8%的次氯酸鈉也比較好，比氯化汞消毒過(guò)后的污染數(shù)少了一半。褐化情況兩種方法相持平?？傮w來(lái)說(shuō)，8%的次氯酸鈉消毒效果更好，所以在消毒劑的選擇上來(lái)說(shuō)應(yīng)選擇8%的次氯酸鈉。綜上所述，本實(shí)驗(yàn)的結(jié)論是：最好的消毒方法是8%的次氯酸鈉消毒對(duì)莖尖處理15min，黑果腺肋花楸莖尖培養(yǎng)的效果達(dá)到最好