補陽還五湯對Cav-1---小鼠腦缺血模型PI3K、Akt、PTEN表達的影響

1、    補陽還五湯對cav-1-/-小鼠腦缺血模型pi3k、akt、pten表達的影響    陳博威 周勝強 易健 張文將 劉柏炎 摘要：目的  觀察補陽還五湯對cav-1-/-小鼠腦缺血模型pi3k、akt、pten表達的影響，探討其可能的作用機制。方法  將野生型小鼠（wt）及cav-1-/-小鼠（ko）隨機分為假手術(shù)組、模型組與補陽組。采用大腦中動脈栓塞法制備腦缺血模型，干預(yù)10 d后運用ayelet levy 14分評分法觀察小鼠神經(jīng)功能評分。免疫組化和qrt-pcr分別檢測小鼠腦組織pi3k、akt、pten蛋白和mrna的

2、表達。結(jié)果  與假手術(shù)組比較，各模型組小鼠均出現(xiàn)明顯神經(jīng)功能障礙（p<0.01），且pi3k、akt蛋白和mrna表達明顯升高（p<0.01），pten蛋白和mrna表達明顯降低（p<0.01），wt模型組小鼠腦組織pi3k、akt、pten蛋白和mrna表達更顯著，且神經(jīng)功能評分優(yōu)于ko模型組（p<0.01，p<0.05）;wt補陽組小鼠腦組織pi3k、akt、pten蛋白和mrna的調(diào)控程度及神經(jīng)功能恢復(fù)程度均優(yōu)于wt模型組和ko補陽組（p關(guān)鍵詞：補陽還五湯;腦缺血;pi3k/akt信號通路;cav-1基因敲除;小鼠中圖分類號：r285.5 

3、;   文獻標(biāo)識碼：a    文章編號：1005-5304（2020）04-0035-06doi：10.3969/j.issn.1005-5304.201910455effects of buyang huanwu decoction on expressions of pi3k， akt， ptenin cav-1-/- mice after cerebral ischemiachen bowei1， zhou shengqiang2， yi jian3， zhang wenjiang1，4， liu baiyan1，41. hunan university o

4、f chinese medicine， changsha 410208， china;2. affiliated hospital of hunan provincial academy of chinese medicine， changsha 410006， china;3. the first affiliated hospital of hunan university of chinese medicine， changsha 410007， china;4. yiyang medical college， yiyang 413000， chinaabstract： objectiv

5、e to observe the effects of buyang huanwu decoction on expressions of pi3k， akt and pten after cerebral ischemia in cav-1-/-mice; to discuss its possible mechanism. methods wild type mice （wt） and cav-1-/-mice （ko） were randomly divided into sham-operation group， model group and buyang huanwu decoct

6、ion group. cerebral ischemia model was established by middle cerebral artery occlusion. after 10 days of intervention， the neurological function scores of each group were observed by ayelet levy 14 points. immunohistochemistry and qrt-pcr were used to detect the expressions of pi3k， akt， pten protei

7、n and mrna. results compared with sham-operation group， there were obvious neurological dysfunction in each model group （pkeywords： buyang huanwu decoction; cerebral ischemia; pi3k/akt signaling pathway; cav-1 gene knockout; mice缺血性腦血管疾病因其高發(fā)病率、高死亡率和高致殘率給社會、家庭及個人帶來沉重的痛苦和負擔(dān)1。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，cav-1在腦缺血損傷中可抑制炎

8、癥反應(yīng)、降低缺血側(cè)半暗帶自噬及促進血管新生2-4，達到促進神經(jīng)恢復(fù)的作用。pi3k/akt信號通路是一條能調(diào)控細胞生長、分化及自噬的經(jīng)典通路，對腦缺血損傷具有保護作用5。有研究表明，cav-1可通過調(diào)控pi3k/akt通路治療疾病6-7，但cav-1是否調(diào)控pi3k/akt通路對腦缺血后腦保護作用產(chǎn)生影響，迄今未見報道。補陽還五湯為治療缺血性中風(fēng)氣虛血瘀證的經(jīng)典名方，其療效已被臨床證實8。本研究以cav-1基因敲除小鼠作為研究對象，通過觀察腦缺血小鼠神經(jīng)功能評分與pi3k/akt通路相關(guān)指標(biāo)的蛋白與mrna變化，探討補陽還五湯干預(yù)腦缺血小鼠的作用機制。1  實驗材料1.1 

9、 動物健康雄性cav-1-/-小鼠（ko）與同源野生型c57（wt）小鼠各40只。其中cav-1-/-小鼠購自美國jackson laboratory，批號2909619，湖南中醫(yī)藥大學(xué)動物中心自行繁衍，均經(jīng)pcr鑒定為cav-1基因敲除9，自由攝食飲水。1.2  藥物補陽還五湯（黃芪120 g，當(dāng)歸尾6 g，川芎3 g，紅花3 g，赤芍4.5 g，桃仁3 g，地龍3 g），飲片購自湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院。常規(guī)煎煮后濃縮至含2 g原藥材/ml，冷藏備用。1.3  主要試劑與儀器pi3k抗體、akt抗體、pten抗體、sabc-pod試劑盒（武漢博士德公司，批號依次為ba

10、1353-1、ba1512、bm4114、sa1022）。eg1150h石蠟包埋機（德國萊卡公司），rm2235切片機（德國萊卡公司），bx71顯微鏡（日本奧林巴斯公司），trizol reagent（美國life technologies公司），rever taid first strand cdna synthesis kit（美國thermo公司），pcr引物（上海生工合成），pcr擴增儀（美國bio-rad公司），核酸水平電泳儀（北京百晶生物技術(shù)有限公司），核酸蛋白濃度測定儀（英國bio-drop公司）。2  實驗方法2.1  分組、造模與給藥將ko組和wt組按隨機

11、數(shù)字表法分為假手術(shù)組、模型組及補陽組，運用大腦中動脈栓塞法復(fù)制腦缺血模型，每組12只。將小鼠麻醉后固定，取頸正中切口，游離左側(cè)頸總、頸內(nèi)、頸外動脈，依次結(jié)扎頸總、頸外動脈。于頸總動脈分叉部下方0.20.3 cm處剪一小口，將魚線通過頸總動脈，插入頸內(nèi)動脈，遇輕微阻力后停止進線，深度（7.5±0.5）mm，固定魚線并逐層縫合。假手術(shù)組僅切開皮膚、分離頸內(nèi)、頸外動脈后即縫合。術(shù)后2 h參照longa等105分法進行神經(jīng)功能評分。分值在13分表明造模成功，予以納入研究。補陽組術(shù)后2 h給藥，給藥劑量為每日18.5 g/kg（按70 kg成人與動物體質(zhì)量藥量折算表換算）補陽還五湯藥液，灌胃體

12、積按0.2 ml/10 g體質(zhì)量，模型組和假手術(shù)組動物均給予等體積蒸餾水。每日1次，連續(xù)10 d。2.2  檢測指標(biāo)2.2.1  神經(jīng)功能評分運用ayelet levy 14分評分法11評估神經(jīng)功能。提住尾巴將小鼠逐漸提高：前肢屈曲計1分，后肢屈曲計1分，30 s內(nèi)頭移動與縱軸形成角度>10°計1分;將大鼠置于地面：正常爬行計0分，無法直線爬行計1分，沿患側(cè)轉(zhuǎn)圈計2分，患側(cè)跌倒計3分;梁平衡測試：靜態(tài)姿勢下可平衡計0分，抓握梁邊計1分，抱住梁、有一肢體掉落計2分，抱住梁、有兩肢體掉落，或在梁上旋轉(zhuǎn)（>60 s）計3分，試圖在梁上保持平衡但跌落（>

13、40 s）計4分，試圖在梁上保持平衡但跌落（>20 s）計5分，跌落且沒有試圖保持平衡或抓梁（2.2.2  免疫組化檢測蛋白表達小鼠處死后，4%多聚甲醛固定大腦，脫水，常規(guī)包埋，切片，厚度約4 m，依次烤片、脫蠟水化，3%過氧化氫去離子水滅活，熱修復(fù)抗原，bsa封閉液封閉，適量一抗4 冰箱過夜，pbs沖洗后二抗孵育，再次pbs沖洗，滴加sabc孵育，最后dab顯色并梯度脫水，透明，封片。每只大鼠取5張切片，光學(xué)顯微鏡（200倍）鏡下觀察，運行image pro plus 6.0圖像分析軟件計算陽性細胞數(shù)。另因一抗特性不同，pten在dab染色后再用蘇木素復(fù)染，光學(xué)顯微鏡（200

14、倍）鏡下觀察，運行imagepro plus6.0圖像分析軟件計算平均光密度。2.2.3  qrt-pcr檢測mrna表達從引物銀行下載基因序列，用primer premier 6.0進行引物設(shè)計，由上海生工生物工程有限公司合成，引物序列見表1。運用trizol法提取腦組織總rna;檢測rna濃度及質(zhì)量;兩步法反轉(zhuǎn)錄cdna;pcr反應(yīng)：預(yù)變性95 、2 min，變性95 、15 s，退火58.260.8 ，40個循環(huán)。溶解曲線反應(yīng)程序：95 、15 s，60 、15 s，溫度緩慢上升（20 min）。-actin為內(nèi)參基因，用2-ct進行相對定量，表示該基因相對表達量。ct值=基因

15、ct值-內(nèi)參ct值，ct值=實驗組ct值-對照組ct值。3  統(tǒng)計學(xué)方法采用spss21.0統(tǒng)計軟件及graphpad prism 8作圖軟件進行分析。計量資料以x±s表示，符合正態(tài)性分布，組間比較采用方差分析。p<0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。4  結(jié)果4.1  補陽還五湯對模型小鼠神經(jīng)功能的影響假手術(shù)組小鼠無神經(jīng)功能障礙;各模型組小鼠出現(xiàn)明顯神經(jīng)功能障礙（p<0.01），且ko比wt神經(jīng)功能損傷更嚴重（p<0.05）;補陽組小鼠神經(jīng)功能評分較模型組明顯降低（p<0.05，p<0.01），但ko補陽組效果差于wt補陽組（p

16、<0.01）。見表2。4.2  補陽還五湯對模型小鼠pi3k、akt、pten蛋白表達的影響與假手術(shù)組比較，ko模型組較wt模型組小鼠pi3k、akt蛋白表達升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（p<0.01），pten蛋白表達降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（p<0.01）;與ko比較，wt變化更顯著（p<0.05，p<0.01）;與wt模型組比較，wt補陽組各蛋白表達變化更顯著，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（p<0.01），而ko補陽組調(diào)控程度不及wt補陽組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（p<0.01）。見圖1圖6。4.3  補陽還五湯對模型小鼠pi3k、akt、pten m

17、rna表達的影響與假手術(shù)組比較，ko模型組與wt模型組pi3k、akt mrna表達升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（p<0.01），與ko比較，wt變化更顯著（p<0.05，p<0.01）。wt補陽組與wt模型組比較，各指標(biāo)表達的變化更顯著，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（p<0.01），而ko補陽組調(diào)控程度不及wt補陽組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（p<0.01），與蛋白表達相似。見圖7。5  討論補陽還五湯由王清任所創(chuàng)，常用于治療缺血性中風(fēng)氣虛血瘀之證。王氏認為元氣藏于身體“氣管之內(nèi)，分布周身，左右各得一半”，中風(fēng)后半身不遂是因元氣虧損，則“經(jīng)絡(luò)自然空虛，有空虛之隙，難免其氣向一邊

18、歸并”，若元氣只剩下五成，致元氣歸于半身而致對側(cè)半身不遂。因此治療上需補充虧損半身的五成元氣。所謂“補陽”即補氣，氣為陽，“還五”即恢復(fù)半身虧損的元氣，由此可保證全身元氣十足，恢復(fù)偏癱肢體。王氏指出“元氣既虛，必不能達于血管，血管無氣，必停留而瘀”，氣虛血行不利，必導(dǎo)致血瘀。本方重用黃芪為君藥，以大補元氣;配以當(dāng)歸尾活血和血，為臣藥;紅花、桃仁、川芎、赤芍助當(dāng)歸活血祛瘀，地龍長于行散走竄，通經(jīng)活絡(luò)，均為佐藥。諸藥合用，使氣旺促血行，活血而不傷正，則筋肉得養(yǎng)，痿廢可愈。課題組前期研究表明，補陽還五湯能在腦缺血后通過降低炎癥反應(yīng)12、抑制細胞凋亡13、促進血管新生4、減少細胞自噬14等途徑發(fā)揮抗腦

19、缺血損傷作用。pi3k/akt通路是細胞一條關(guān)鍵的信號通路，廣泛參與調(diào)控細胞增殖、分化及凋亡的各個過程5。腦缺血后機體受到刺激會釋放各類酪氨酸激酶活性受體激活的物質(zhì)，這些受體能特異性活化pi3k，當(dāng)pi3k激活后，會將pip2轉(zhuǎn)化成pip3，激活akt。akt作為一種重要的信息分子，不僅能繼續(xù)激活下游哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（mtor）信號因子及b淋巴細胞瘤-2基因（bcl-2）、bcl-2相關(guān)x蛋白（bax）等調(diào)節(jié)細胞生長、自噬與凋亡15，還能通過減少腫瘤壞死因子-和白細胞介素-1的釋放減輕腦缺血后炎癥損傷16。而pten能逆轉(zhuǎn)pip2向pip3的轉(zhuǎn)化，起到對整個通路的負性調(diào)控作用17。另有研

20、究表明，pi3k/akt信號通路還能在腦缺血后通過誘導(dǎo)神經(jīng)再生18、抑制氧化應(yīng)激19、促進血管新生20等方式，在腦缺血后恢復(fù)中扮演重要角色。本實驗發(fā)現(xiàn)，腦缺血后小鼠pi3k、akt的蛋白及mrna表達上升，pten的蛋白及mrna表達被抑制，但整體活化程度有限，無法完全修復(fù)受損神經(jīng)，仍有明顯神經(jīng)功能缺損。補陽還五湯的干預(yù)使相關(guān)蛋白調(diào)控作用更明顯，并能顯著改善神經(jīng)功能。我們推測補陽還五湯可能通過調(diào)控pi3k/akt通路，發(fā)揮抗腦缺血損傷的作用。小窩是一種特殊形式的脂筏，位于細胞膜表面的特異性凹陷區(qū)，在神經(jīng)元及膠質(zhì)細胞膜上有豐富的表達。cav-1是小窩中重要的功能結(jié)構(gòu)與核心蛋白，通過“腳手架結(jié)構(gòu)區(qū)

21、”可與下游各類效應(yīng)因子結(jié)合，廣泛參與細胞生長、分化、凋亡等病理生理過程21。課題組前期發(fā)現(xiàn)，cav-1是治療中風(fēng)的潛在靶點：正常腦內(nèi)有少量cav-1表達，腦缺血后cav-1迅速增加，cav-1-/-小鼠腦梗死面積縮小速度明顯低于正常小鼠，神經(jīng)功能恢復(fù)也明顯減緩22;cav-1敲除可降低缺血腦組織血管新生4及神經(jīng)干細胞的增殖23。有研究表明，pi3k/akt通路存在于小窩中并受到cav-1的調(diào)控，抑制cav-1可呈量效關(guān)系減弱akt的活化24。也有研究表明，cav-1能阻斷pi3k/akt通路來抑制胰腺癌的生長，并且cav-1還可通過抑制神經(jīng)酰胺的釋放25，激活akt信號通路，阻止細胞凋亡。據(jù)此

22、，我們推測cav-1可能通過調(diào)控pi3k/akt通路發(fā)揮抗腦缺血的作用。本實驗發(fā)現(xiàn)，補陽還五湯能改善腦缺血后的神經(jīng)功能，其機制可能與調(diào)控pi3k/akt通路有關(guān)。同時ko與wt比較，小鼠腦缺血后神經(jīng)功能評分改善較低，pi3k/akt通路相關(guān)因子表達受損，提示補陽還五湯可能是通過cav-1調(diào)控pi3k/akt信號通路的活性，促進神經(jīng)恢復(fù)。綜上所述，本研究初步發(fā)現(xiàn)補陽還五湯可能通過cav-1調(diào)控pi3k/akt信號通路的活性發(fā)揮抗腦缺血損傷的作用，但目前尚無法確定其作用機制與pi3k/akt信號通路上調(diào)相關(guān)。今后課題組將采取cav-1基因敲除及pi3k/akt抑制劑雙重阻斷cav1/pi3k/ak

23、t信號通路的方式，希望進一步明確補陽還五湯抗腦缺血損傷的作用機制。參考文獻：1 benjamin e， blaha m， chiuve s， et al. heart disease and stroke statistics-2017 update：a report from the american heart associationj. circulation，2017，131（4）：e29.2 黃素芬，周勝強，羅東，等.陷窩蛋白-1對永久性大腦中動脈閉塞小鼠缺血皮質(zhì)白細胞介素-1和白細胞介素-6表達的影響j.國際腦血管病雜志，2016，24（11）：1022-1027.3 周勝強.補陽

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