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文檔簡(jiǎn)介
1、 Western blotting 操作規(guī)程(供參考)Western blotting(2007.7)1、 洗凈玻板,與膠接觸的一面傾斜朝下晾干。放入電泳橡膠套內(nèi)卡好(有框?yàn)楦?平面為低)2、 封板: (配膠全過(guò)程須戴手套和口罩,被有毒物質(zhì)污染的手套必須丟棄!)1%瓊脂糖(微波加熱, 液體剛沸騰即可)全溶后用槍將電泳橡膠套底部封好(兩面)一塊膠約24ml 瓊脂糖0.5 g,加水至50ml 將其裝入電泳槽內(nèi),玻璃板高的一邊通正極(紅色鈕) 蛋白從負(fù)極向正極跑3、 分離膠:配膠(附后),一般分子量大的按10%配(or 8%),分子量小的按12%配,10%的過(guò)硫酸銨現(xiàn)用現(xiàn)配,10%的SDS加熱溶解后
2、再用 15-20 ml/板4、 將電泳槽傾斜,將上述分離膠注入至離上樣梳約1cm,并在上面加2-3mm 高的異丙醇約500 ul/板,目的防止氧氣擴(kuò)散進(jìn)入凝膠而抑止聚合反應(yīng) 5、 約30min后凝固,倒出異丙醇,并用去離子水沖洗10次,再用濾紙輕輕吸出殘余的水 長(zhǎng)時(shí)間(2-3h)有利于膠結(jié)構(gòu)形成,因?yàn)槿庋劭茨z凝時(shí),膠內(nèi)部分子的排列尚未完成6、 基層膠:基層膠的配制(附后,室溫時(shí)膠凝聚比較快,夏天約需5 min,5-6ml/板) 將剩下的基層膠放置冰水中可延緩膠凝聚 基層膠如果收縮應(yīng)及時(shí)補(bǔ)膠7、 插上上樣梳(必需是干凈干燥的,傾斜插入以排氣泡),注意上樣梳的下沿要距離分離膠約1cm8、 待基層膠
3、凝固后往電泳槽倒入滿(mǎn)電泳緩沖液一槽二槽三槽四槽五槽5×電泳緩沖液 160ml320ml480ml640ml800mlddH2O640ml1280ml1920ml2560ml3200ml9、倒入電泳液后緩慢拔出上樣梳 凝聚的膠與不凝聚的膠有不同的折光率,故可分辨 拔上樣梳后若膠齒彎曲,用9#注射針頭將其扶直10、上樣:收細(xì)胞:1、培養(yǎng)液倒入離心筒,胰酶消化細(xì)胞,也倒入離心筒,2500-3000 r/min, 10 min, 倒掉上清液2、1ml PBS重懸細(xì)胞轉(zhuǎn)移至1.5 ml EP管,2500-3000 r/min, 10 min;大槍頭吸棄上清液3、2500-3000 r/min,
4、 2-3 min , 小槍頭吸棄上清液。-80凍存 裂解: 1、每管細(xì)胞加60-100 ml裂解液,于4冰箱內(nèi)冰浴1 h2、12,000 r/min離心10-15 min,用槍頭吸出上清至0.5 ml EP管3、加5×上樣緩沖液,沸水浴3-5 min。-20或-80凍存方法:每個(gè)泳道加15-20 ml的樣品(約30-100 mg,每個(gè)泳道上樣量必須一致)。 Marker(4-6 ml)加在第一個(gè)泳道或合適的泳道。(如果是新的Marker,則每瓶加200 ml 5×上樣緩沖液,分裝放于-20保存) 加的樣品不要溢出膠齒上部11、 通電:基層膠的電壓U=7585V (80V)
5、時(shí)間約0.5-1h 檢查電泳是否漏液!12、 換電壓:當(dāng)跑到分離膠時(shí),電壓調(diào)到180V, 時(shí)間約為3-4h13、 轉(zhuǎn)膜:待蛋白的前沿(溴酚藍(lán))跑到接近膠底1cm或合適的位置時(shí)停止如果要檢測(cè)的蛋白的分子量較小,則前沿可以不太接近底部,反之,則前沿盡量接近底部1. 將膠從電泳槽中取出,首先用手術(shù)刀柄輕輕掀起玻璃板,然后用玻璃板割去基層膠。在分離膠左下部切除一角以標(biāo)注凝膠的方位2. 輕輕取出分離膠,放入已配好的轉(zhuǎn)移緩沖液中3. 在轉(zhuǎn)移緩沖液中量出膠的長(zhǎng)、寬膠在含甲醇的轉(zhuǎn)移緩沖液中會(huì)收縮2-3mm4. 剪硝酸纖維素膜(一塊膠一張)和濾紙(一塊膠6張)膜與膠形狀相等,濾紙比膠少小2-3mm,否則轉(zhuǎn)膜時(shí)易
6、短路5. 將3張濾紙和膜都泡在轉(zhuǎn)移緩沖液中,充分浸潤(rùn)6. 待浸潤(rùn)后,先在板上放3張濾紙,用玻棒輕推濾紙以趕走氣泡,然后輕輕放上膠,用玻棒輕推膠以趕走氣泡膠的底部(溴酚藍(lán)條帶)朝向自己、將膠反轉(zhuǎn)使膠左下角成為右下角7. 在膠上面放好硝酸纖維素膜,再放上另外3張濾紙,該過(guò)程也需要趕氣泡 膜右下角剪腳以示位置,染色后反轉(zhuǎn)即是電泳上樣順序8. 放入槽內(nèi)并倒入緩沖液(膜朝里,即正極)轉(zhuǎn)移緩沖液的配制: 一槽二槽三槽一槽二槽三槽Tris Base3.64g7.28g10.92g3.36g6.73g10.08g甘氨酸17.3g 34.6g5.19g14.42g28.82g43.26g甲醇240ml 480m
7、l720ml200ml400ml600ml去離子水960ml 1920ml2880ml800ml1600ml2400mlTotal1200ml2400ml3600ml1000ml2000ml3000ml12、 采用恒流100mA 轉(zhuǎn)膜3h(大分子5h)原:轉(zhuǎn)移時(shí)電壓是25v,過(guò)夜13、 加麗春紅染色:1. 將轉(zhuǎn)膜后的聚硝酸纖維素薄膜取出,放入已配好麗春紅染色缸中,染色5min2. 待出現(xiàn)條帶后,放入去離子水中浸泡,洗去染料,并按Marker顯示的位置,按分子量大小剪成一個(gè)個(gè)條帶14、 封閉:將封閉液均勻涂在剪下的蛋白條帶上,室溫?fù)u床緩慢振蕩封閉2h以上 封閉液;脫脂奶粉 5%(V/V)0.5g
8、1.5g2.5g0.02% 疊氮鈉0.002g0.006g0.01g1× PBS10ml30ml50ml15、 加一抗:把含一抗的封閉液滴在塑板上,將條帶從封閉液取出,濾紙貼角吸干,正面朝下貼在一抗上,注意不要留下氣泡,在反應(yīng)體系外罩一濕潤(rùn)平皿以防止溶液蒸發(fā)孵一抗通常4度過(guò)夜 通常40ul-50ul/cm2一抗溶液加入疊氮鈉,可在4存放至少2周16、 加二抗:1. 洗一抗:先用PBS洗3次,10min/次,并在搖床上振搖再用Tris-NaCl (PH 7.5)洗1次,10min/次2. 涂二抗:根據(jù)一抗的來(lái)源選擇合適的二抗,按相應(yīng)的比例稀釋?zhuān)覝胤跤?h二抗的配制方法: 脫脂奶粉 5
9、%(V/V)0.25g0.5gTris-NaCl(PH 7.5) 5ml10ml二抗 稀釋300-500倍17、 顯色(本方法為DAB法,現(xiàn)多用ECL法)A、二抗孵育2-3h后(室溫),用Tris-NaCl洗3次,10min/次,并振搖 B、加底物,顯色5min 底物的配制:Tris-HCl (0.01M,PH 7.6) 9ml27ml45ml二氨基聯(lián)苯胺(DAB,現(xiàn)用現(xiàn)配)6mg18mg30mg0.3%氯化鈷1ml3ml5ml總10ml30ml50ml注:臨顯色前再加入二氨基聯(lián)苯胺和CoCl2,還有30%的H2O2 10ml/10ml底物液(10ml加10mlH2O2),放入后快速顯色,一旦
10、有清晰蛋白帶出現(xiàn)立即拿出放在裝有蒸餾水的平皿中終止生色反應(yīng) 蛋白分子量 (僅供參考,詳細(xì)請(qǐng)查閱說(shuō)明書(shū))Maker蛋 白分子量(KD)蛋 白分子量(KD)ATM236EGFR170TrkB145PLCr2140iNOS130-140SIRT1120PARP116(全長(zhǎng))/85/2597KDRaf76、72-76IRAK180COX-272-74COX-17066KDAkt60BECN60Caspase-855(前體)/43/42/20Cyclin B155JNK1/JNK254/46P-cdc25c55P5353Fas48 (20ug/ml)Enolase48Caspase-947(前體)/37
11、/35Actin4645KDICAD(DFF45)45/35Caspase-145(前體)/20/10ERK1/ERK242/44Caspase-7FasL38P3838IKB-a35-37P-cdc2P3434Caspase-332(前體)/17/11Bck-xl3230KDBak30FADD30BDNF30(前體)/14Bcl-226Bax23Bad23Ras21P212120KDCyto c15LC31514KDWestern blotting試劑準(zhǔn)備1. 30%聚丙烯酰胺液: 丙烯酰胺(Acr)290 g亞甲雙丙烯酰胺(Bis)10 g加ddH2O定容至1000ml,棕色瓶4保存 神經(jīng)
12、毒性,可通過(guò)皮膚吸收和呼吸道進(jìn)入體內(nèi),操作時(shí)戴手套和口罩2. 4×分離膠緩沖液(1.5mol/L Tris-Hcl PH 8.8)Tris 181.71 g加ddH2O定容至1000ml ,濃鹽酸精確調(diào)至PH 8.8,4&室溫保存3. 4×濃縮膠緩沖液(0.5mol/L Tris-Hcl PH 6. 8)Tris121.14 g加ddH2O定容至1000ml,濃鹽酸精確調(diào)至PH 6. 8,4&室溫保存4. 10%SDS:電泳級(jí)SDS 10.0 g加ddH2O定容至100ml。室溫保存5. 5×電泳緩沖液 Tris15.1 g甘氨酸 94 g 10%
13、電泳級(jí)SDS50ml先在水中加入Tris堿,再加甘氨酸,最后加SDS,加水至1000ml,4保存 6. 10%過(guò)硫酸銨(AP): AP0.1 g加ddH2O至1.0ml,-20保存,一周內(nèi)使用,最好新鮮配制。7. 5×上樣緩沖液: 1mol/L Tris-Hcl (PH 6.8)0.6 ml50% 甘油 5 ml10% SDS2 ml-巰基乙醇 0.5 ml1% 溴芬藍(lán) 1 ml總10ml,置4避光保存8. TEMED:注意室溫較低時(shí)TEMED量可加倍,最后灌膠之前使用,4保存 強(qiáng)神經(jīng)毒性,戴口罩以防止誤吸,操作時(shí)快速,存放時(shí)密封9. 轉(zhuǎn)移緩沖液:PH8.3-8.4Tris3.64
14、g甘氨酸17.3 g甲醇240 mlddH2O960 ml10. 0.0 1mol/L PBS (PH 7.4) : NaCl8.0 gKCl0.2 gNa2HPO4 12H2O1.54 gKH2PO40.2 g加ddH2O定容至1000ml,調(diào)PH7.2-7.4,室溫保存11. 封閉液; 脫脂奶粉 5%(V/V)0.5 g0.02% 疊氮鈉0.002 g1× PBS10 ml疊氮鈉毒性大,可阻斷細(xì)胞色素電子運(yùn)送系統(tǒng),操作時(shí)戴手套12.Tris-NaCl(PH7.5)Tris12.114 gNaCl17.532 g加ddH2O至2000ml,用濃鹽酸精確調(diào)至PH7.5,室溫保存13.
15、 Tris-HCl(0.01M,PH7.6)Tris1.21 g加ddH2O至1000ml,用濃鹽酸精確調(diào)至PH7.6,室溫保存14麗春紅儲(chǔ)備液(2%):麗春紅S2 g三氯乙酸30 g磺基水楊酸30 gddH2O100 ml麗春紅工作液(0.2%):室溫保存2% 麗春紅儲(chǔ)備液一份ddH2O九份15生色液:聯(lián)苯胺顯色液(DAB)Tris-HCl (0.01M,PH7.6) 9 ml二氨基聯(lián)苯胺(DAB,現(xiàn)用現(xiàn)配)6 mg0.3%氯化鈷1 ml總10 ml以每10ml生色液加入10ul 30%的過(guò)氧化氫16細(xì)胞裂解液100ml: 50mmol/L HEPES (238.3) (pH7.4)1.19
16、15 g1%Triton-X100 1 ml100mmol/L NaF (44)440 mg1mmol/L EDTA (372.24)37.24 mg1mmol/L EGTA (380.40)38.40 mg加ddH2O定容至100ml, 4保存1M 500×正礬酸鈉(400.12)儲(chǔ)備液正礬酸鈉(400.12)80 mgddH2O200 ml配成儲(chǔ)備液-20保存裂解細(xì)胞時(shí)每ml裂解液加2ul儲(chǔ)備液, 正礬酸鈉終濃度為2 mmol/L0.5M(500×)儲(chǔ)備液PMSF(174.2)17.4 mg異丙醇200 ml配成儲(chǔ)備液-20保存裂解細(xì)胞時(shí)每ml裂解液加2ml儲(chǔ)備液, 正
17、礬酸鈉終濃度為1mmol/L使用前加入10ug/ml蛋白消化酶抑制劑aprotinin, leupeptin(儲(chǔ)備液500mg/ml)和pepstatinA;Aprotinin:為一58氨基堿性多肽,經(jīng)反復(fù)凍融后,會(huì)發(fā)生集聚,儲(chǔ)存液應(yīng)分裝成小份,保存于-20度,每一小份用后應(yīng)予廢棄。PMSF:在溶液中不穩(wěn)定,應(yīng)在臨用前從儲(chǔ)存液中現(xiàn)加于裂解液中。一旦眼睛或皮膚接觸了PMSF,應(yīng)立即用大量的水沖洗。凡被PMSF污染的衣物應(yīng)予丟棄。PMSF通常配成10mmol/L濃度儲(chǔ)液(1.74或17.4mg/ml溶于異丙醇中)保存于-20度。由于蛋白抑制劑可影響蛋白定量, 且新鮮的蛋白很少降解,故可不加蛋白抑制
18、劑SDS-PAGE凝膠的有效分離范圍丙烯酰胺濃度(%)1512107.55.0線(xiàn)性分離范圍12-43 kDa14- kDa16-68 kDa36-94 kDa57-212 kDa蛋白質(zhì)電泳應(yīng)用抗體AntibodiesType of IgGDilutionBcl-2mouse monoclonal IgG1: 200Bcl-XLrabbit polyclonal IgG1: 500Baxrabbit polyclonal IgG1: 800ERK1/2rabbit polyclonal IgG1: 1000phospho-ERK1/2mouse monoclonal IgG1: 1000p38r
19、abbit polyclonal IgG1: 300phospho-p38rabbit polyclonal IgG1: 200JNK1/2rabbit polyclonal IgG1: 400phospho-JNKmouse monoclonal IgG1: 200caspse-3rabbit polyclonal IgG1: 200p53mouse monoclonal IgG1: 300phospho-p53 (ser15)rabbit polyclonal IgG1: 300PARPrabbit polyclonal IgG1: 500ICADrabbit polyclonal IgG1: 800secondary antibodygoat anti-rabbit IgG-HRP1:
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